手性配位交換色譜法拆分普盧利沙星對(duì)映體

陳 希， 鄢雷娜， 劉緒平， 肖欽欽， 段和祥， 陳偉康*

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌 330029)

藥物分子的手性與藥物的藥理活性、毒性及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有著密切關(guān)系。當(dāng)手性藥物的對(duì)映體進(jìn)入生物體內(nèi)，將作為不同的分子加以識(shí)別匹配，因此對(duì)映體在藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)和毒理學(xué)方面存在立體選擇性，致使其生物活性、代謝過(guò)程及毒性方面均可能存在明顯差異，最典型的例子為上世紀(jì)60年代的“反應(yīng)?！笔录1,2]。鑒于手性化合物對(duì)映體的藥理活性和毒性往往有很大差異，開(kāi)展對(duì)映體化學(xué)(純度鑒別、檢查等)、藥理學(xué)、毒理學(xué)以及臨床應(yīng)用等研究是非常有必要的，且具有重要意義。然而欲開(kāi)展這些工作，必須首先解決對(duì)映體拆分問(wèn)題，因此建立手性分離分析方法成為開(kāi)展手性藥物研究過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán)[3]。

普盧利沙星(Prulifloxacin)是日本新藥公司開(kāi)發(fā)研制的第四代喹諾酮類(lèi)廣譜抗生素，該藥對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌、厭氧菌、衣原體和支原體等都具有廣泛的殺菌和抑菌作用，臨床主要用于治療呼吸道感染、泌尿道感染、皮膚軟組織感染[4,5]。普盧利沙星分子結(jié)構(gòu)有一個(gè)手性碳，見(jiàn)圖1。有報(bào)道左旋普盧利沙星及其生理上允許的鹽可以替代現(xiàn)有抗菌藥物普盧利沙星及生理上允許的鹽，其不但抗菌作用明顯增強(qiáng)，而且毒性小[6]。為了解藥物中左右旋普盧利沙星的比例，有必要建立相應(yīng)的對(duì)映體拆分方法，但目前尚無(wú)該藥對(duì)映體的拆分報(bào)道。手性配位交換流動(dòng)相添加劑法，系在流動(dòng)相中添加某種手性配體(多采用手性氨基酸)和金屬離子，與待測(cè)的對(duì)映體配位形成兩個(gè)非對(duì)映的三元絡(luò)合物，在非手性固定相的色譜柱(如C18色譜柱)上進(jìn)行對(duì)映體的拆分[7,8]。已經(jīng)有文獻(xiàn)對(duì)莫西沙星、帕珠沙星、氧氟沙星、尤利沙星等手性喹諾酮藥物對(duì)映體進(jìn)行了拆分測(cè)定[9 - 13]。本文選用L-異亮氨酸和CuSO4作為手性添加劑，使用普通C18色譜柱對(duì)普盧利沙星對(duì)映體進(jìn)行拆分研究。

圖1 普盧利沙星的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

LC-20AD XR高效液相色譜儀(日本，島津公司)；MS205DU電子天平(瑞士，梅特勒-托利多公司)。

普盧利沙星對(duì)照品(梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：XM8QF-TS，含量：98.0%)。L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸為生化試劑，甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。水為超純水。

1.2 溶液配制

稱(chēng)取普盧利沙星對(duì)照品105.32 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(含普盧利沙星1032.1 μg/mL)。取上述溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液1 (含普盧利沙星206.4 μg/mL)。稱(chēng)取普盧利沙星對(duì)照品102.12 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙腈20 mL使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。取該溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液2 (含普盧利沙星200.2 μg/mL)，臨用新配，4 ℃保存。

1.3 色譜條件

色譜柱：月旭Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：L-異亮氨酸-CuSO4溶液(含8 mmol/L 的L-異亮氨酸和4 mmol/L的CuSO4，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至3.5)-甲醇(68∶32，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 稀釋劑和進(jìn)樣體積對(duì)拆分的影響

取對(duì)照品溶液1，當(dāng)進(jìn)樣體積為10 μL時(shí)，普盧利沙星兩個(gè)對(duì)映體的峰形特別差，理論塔板數(shù)(N)和分離度(RS)均不太滿(mǎn)意，且有較大的溶劑峰。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和對(duì)照品溶液2，分別進(jìn)樣2 μL和10 μL，兩種方式進(jìn)樣普盧利沙星兩個(gè)對(duì)映體峰間的RS約為3.61和3.78，普盧利沙星峰形幾乎無(wú)差異，只是乙腈為稀釋劑時(shí)溶劑峰較大。色譜圖見(jiàn)圖2。上述差異主要原因可能為乙腈對(duì)三元絡(luò)合物的形成有干擾，乙腈稀釋的對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積減少到2 μL時(shí)，普盧利沙星對(duì)映體峰形可以得到較好改善。使用流動(dòng)相稀釋時(shí)普盧利沙星放置3 h后降解1.8%，而使用乙腈稀釋時(shí)普盧利沙星幾乎不降解，所以如選用流動(dòng)相稀釋時(shí)需臨用新配。

圖2 普盧利沙星對(duì)照品的色譜圖

2.2 手性流動(dòng)相添加劑對(duì)拆分的影響

不同手性配體的手性拆分能力差異較大，本文分別考察了L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸作為手性配體的拆分情況。選擇質(zhì)量濃度約為1032.1 μg/mL的普盧利沙星對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，進(jìn)樣量2 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：使用L-脯氨酸時(shí)普盧利沙星僅有1個(gè)色譜峰，無(wú)法拆分普盧利沙星對(duì)映體；使用L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸時(shí)，色譜圖中普盧利沙星有2個(gè)色譜峰，可以實(shí)現(xiàn)普盧利沙星對(duì)映體的拆分。L-苯丙氨酸拆分普盧利沙星對(duì)映體時(shí)保留時(shí)間較長(zhǎng)，增加甲醇比例至36%，考察普盧利沙星對(duì)映體保留時(shí)間近似時(shí)，兩個(gè)對(duì)映體峰間RS，使用L-異亮氨酸可以獲得更佳RS，見(jiàn)表1。

表1 不同手性氨基酸對(duì)保留時(shí)間和分離度的影響

2.3 L-異亮氨酸濃度對(duì)拆分的影響

L-異亮氨酸濃度的增加可以增加流動(dòng)相中L-異亮氨酸和Cu2+二元絡(luò)合物的濃度，可使流動(dòng)相中產(chǎn)生更多的二元絡(luò)合物用于色譜柱固定相上的分配，進(jìn)而提高普盧利沙星對(duì)映體峰間RS[14]。但由于L-異亮氨酸和CuSO4手性添加劑在276 nm波長(zhǎng)也有紫外吸收，L-異亮氨酸濃度過(guò)高造成流動(dòng)相在276 nm吸收值過(guò)大(背景吸收)，樣品分析時(shí)普盧利沙星對(duì)映體峰高和峰面積會(huì)減少，所以需要找到適宜的L-異亮氨酸濃度。保持L-異亮氨酸和CuSO4濃度比為2∶1，考察L-異亮氨酸濃度為6～12 mmol/L時(shí)對(duì)普盧利沙星對(duì)映體拆分的影響。實(shí)驗(yàn)表明L-異亮氨酸濃度為8 mmol/L時(shí)有較好RS，峰面積(A)的減少也不太大，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L-異亮氨酸濃度對(duì)拆分的影響

2.4 金屬離子濃度對(duì)拆分的影響

Cu2+與配位體比例的不同，同樣會(huì)影響對(duì)映體拆分效果[15]。維持8 mmol/L L-異亮氨酸濃度不變，探尋最佳Cu2+濃度。結(jié)果顯示，Cu2+濃度為3 mmol/L時(shí)，普盧利沙星對(duì)映體峰間RS相比4 mmol/L時(shí)只增加了0.1，但是分析時(shí)間需要延長(zhǎng)到近30 min，結(jié)果見(jiàn)表3。綜合考慮，最終選擇CuSO4的濃度為4 mmol/L。

表3 CuSO4濃度對(duì)拆分的影響

2.5 流動(dòng)相pH對(duì)拆分的影響

流動(dòng)相pH對(duì)拆分的影響也很大，呈堿性有利于絡(luò)合物的形成，一般堿性流動(dòng)相比酸性時(shí)獲得更高的容量因子和RS[16]。但流動(dòng)相pH大于3.5后，Cu2+絡(luò)合物沉淀產(chǎn)生速度明顯加快，所以考察流動(dòng)相pH在3.0～3.5間變化對(duì)拆分的影響。結(jié)果顯示pH值越大，普盧利沙星對(duì)映體峰間RS越大，pH為3.5時(shí)具有最好的RS，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間和分離度的影響

2.6 有機(jī)改性劑對(duì)拆分的影響

不同的有機(jī)溶劑對(duì)拆分效果也有較大的差異，本實(shí)驗(yàn)中使用甲醇可以獲得較好的拆分效果。但有機(jī)相使用乙腈時(shí)無(wú)法拆分普盧利沙星對(duì)映體，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 以乙腈為有機(jī)相的普盧利沙星對(duì)照品色譜圖

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中配體種類(lèi)、濃度、比例以及pH等參數(shù)，得到了拆分普盧利沙星對(duì)映體的最佳流動(dòng)相組成：8 mmol/L L-異亮氨酸和4 mmol/L CuSO4溶液(pH=3.5)-甲醇(68∶32，V/V)，成功建立手性配位交換色譜流動(dòng)相添加劑法拆分普盧利沙星對(duì)映體的方法。該方法選擇性高，前處理簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，容易普及。