綠原酸合成代謝途徑關(guān)鍵酶的生物信息學(xué)研究

馮唐鍇，楊文濤

(景德鎮(zhèn)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

1 引言

金銀花(Lonicerajaponica)為忍冬科忍冬屬多年生半常綠木質(zhì)藤本植物，通?？煞譃榱箢悺，F(xiàn)存忍冬屬植物200余種，我國約98種，其中47種可入藥 ，如山銀花等[1～3]。金銀花藥用成分包括黃酮類化合物、揮發(fā)油、三萜皂苷類化合物、無機(jī)元素類、有機(jī)酸類化合物等[4,5]，其中的綠原酸等化合物[6,7]都具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱功效[8]，還能抗菌、抗病毒、抗炎、促進(jìn)炎性細(xì)胞吞噬功能、降血脂、使中樞神經(jīng)興奮，甚至對(duì)肉瘤S180和艾式腹水癌也有明顯的細(xì)胞毒作用[9～11]。金銀花起到藥用功效的主要化合物為綠原酸[12～15]；目前對(duì)金銀花各類藥用成分合成途徑的研究中，也屬綠原酸最為詳細(xì)[16～18]；通過各種手段影響代謝途徑，提高金銀花綠原酸的含量也是研究的熱點(diǎn)[19]。因此，本研究以金銀花綠原酸合成代謝途徑為主要研究背景，利用生物信息學(xué)方法對(duì)植物綠原酸合成的3種關(guān)鍵酶進(jìn)行了比較分析。希望通過此研究了解各類植物中綠原酸合成關(guān)鍵酶的理化性質(zhì)和進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究綠原酸合成途徑提供線索和參考。

2 材料與方法

本研究通過查閱文獻(xiàn)資料了解綠原酸合成途徑及其關(guān)鍵酶。從美國國家生物信息中心(National center for biotechnology information，NCBI，網(wǎng)址：www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取各種酶的氨基酸序列。利用ExPASy-ProtParam(網(wǎng)址：expasy.org/protparam/)在線軟件了解金銀花合成途徑關(guān)鍵酶的理化性質(zhì)。利用MEGA-7軟件比對(duì)各植物同種酶蛋白氨基酸序列間的相似性及演化距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。研究于2019年9月份至2020年5月份在景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

閱讀文獻(xiàn)資料[20～22]表明，綠原酸合成途徑中羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(Hqt)、羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(Hct)和P-香豆酸3-羥化酶(C3h)均起著很重要的作用，是該途徑的關(guān)鍵酶。本研究對(duì)不同植物中的這3種酶分子進(jìn)行了序列檢索、理化性質(zhì)分析和相似性比對(duì)及建樹。

3.1 序列檢索及理化性質(zhì)分析

3.1.1 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸 羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(Hqt)

Hqt在植物中的表達(dá)量及分布都與綠原酸含量正相關(guān)，且該酶還能在體外催化奎寧酸與咖啡酰輔酶A的縮合反應(yīng)[23～25]。本研究下載了10種植物的Hqt氨基酸序列信息，利用在線軟件ExPASy-ProtParam逐一分析比較目標(biāo)酶蛋白的理化性質(zhì)，所得結(jié)果如表1所示。

表1 不同植物Hqt的序列號(hào)及理化性質(zhì)

分析結(jié)果表明，10種不同植物的Hqt約含400～500 個(gè)氨基酸殘基；相對(duì)分子質(zhì)量約為47.0～50.0 kDa。等電點(diǎn)(pI)變化分布在5.48～7.64之間，總體為中性偏酸分布。分析結(jié)果表明不同植物Hqt穩(wěn)定性有差異，金銀花、桔梗、刺苞菜薊中的該酶穩(wěn)定性相對(duì)較強(qiáng)，其他6種植物該酶穩(wěn)定性較弱。相對(duì)平均親水性分析表明該酶為親水性蛋白，只有在虎眼萬年青中該酶表現(xiàn)為疏水。

3.1.2 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸 羥基肉桂
酰轉(zhuǎn)移酶(Hct)

下載了10 種植物Hct氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在線軟件分析比較目標(biāo)酶蛋白理化性質(zhì)，所得結(jié)果如表2所示。

表2 不同植物Hct的序列號(hào)及理化性質(zhì)

分析結(jié)果表明，10種不同植物的Hct約含400～500 個(gè)氨基酸殘基；相對(duì)分子質(zhì)量約為44.0～50.0 kDa。等電點(diǎn)(pI)變化分布為5.44～6.76，皆為等電點(diǎn)弱偏酸性分子。不同植物Hct穩(wěn)定性也存在差異，金銀花、煙草、桔梗、團(tuán)花樹、紫錐菊、木槿中該酶穩(wěn)定性相對(duì)較強(qiáng)，其他4種植物該酶穩(wěn)定性較弱。所有10種植物的Hct均為親水性蛋白。

3.1.3 P-香豆酸3-羥化酶(C3h)

下載了10種植物C3h氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在線軟件分析比較了目標(biāo)酶蛋白理化性質(zhì)，所得結(jié)果如表3所示。

表3 不同植物的C3h的序列號(hào)及理化性質(zhì)

分析結(jié)果表明，10 種不同植物的C3h約含400～500 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為44.0～60.0 kDa。等電點(diǎn)(pI)方面，金銀花C3h較為特殊，為堿性較強(qiáng)的8.92，其他9種C3h分子等電點(diǎn)均為弱酸性值，分布在5.42～6.76之間。金銀花、芝麻、西樺、苦蕎、水仙、毛白楊C3h分子較為穩(wěn)定，其他4種植物的該分子穩(wěn)定性較弱。所有10種植物的C3h皆為親水性蛋白。

3.2 系統(tǒng)發(fā)生分析

3.2.1 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸 羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(Hqt)

本研究利用MEGA-7軟件對(duì)表1中所列不同植物的Hqt氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用距離標(biāo)尺、分支長度、自展值等指標(biāo)分析了Hqt分子的進(jìn)化關(guān)系，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。由圖1可知，金銀花與桔梗的Hqt親緣關(guān)系最近，其次是刺苞菜薊，三者的分支長度接近，遺傳距離相近，這與它們的穩(wěn)定性分析結(jié)果也較為吻合，可能表明它們?cè)诰G原酸的生物合成途徑中的作用相似度更高。系統(tǒng)發(fā)生樹還顯示虎眼萬年青Hqt與其余9種植物Hqt親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與親水性分析結(jié)果吻合，可能提示虎眼萬年青中的Hqt的結(jié)構(gòu)、功能及其參與的主要代謝途徑等方面與其他9種植物存在差異。

圖1 10種植物Hqt的親緣分析

3.2.2 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸 羥基肉桂
酰轉(zhuǎn)移酶(Hct)

利用MEGA-7軟件對(duì)表2中10種植物的Hct氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。由圖2可知，金銀花與煙草的Hct親緣關(guān)系較為接近，表明它們?cè)诰G原酸合成途徑中作用可能相近，因此研究該代謝途徑時(shí)可以對(duì)金銀花和煙草進(jìn)行比較[26]。

圖2 10種植物Hct的親緣分析

3.2.3 P-香豆酸3-羥化酶(C3h)

利用MEGA-7軟件對(duì)表3中10種植物的C3h氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。如圖3所示，金銀花C3h和其他9種植物間沒有親緣關(guān)系特別相近的分子。相對(duì)而言，它和金合歡、豇豆、毛白楊、西樺的親緣關(guān)系可能稍近一些。其他植物中金合歡和豇豆親緣關(guān)系較近，毛白楊和西樺的親緣關(guān)系較近。

圖3 10種植物C3h的親緣分析

4 結(jié)論

不同植物綠原酸合成途徑3種關(guān)鍵酶的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，從氨基酸殘基數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、親水性等幾個(gè)基礎(chǔ)指標(biāo)來看，不同生物中的同種酶相似性較高，但是具體細(xì)節(jié)方面會(huì)有一些差異。對(duì)Hqt而言，10種植物中金銀花與桔梗、刺苞菜薊的Hqt分子穩(wěn)定性較高，而虎眼萬年青的Hqt與其他植物有著較為明顯的差異。在Hct方面，不同植物的酶分子只在穩(wěn)定性方面存在一些差異。在C3h方面，金銀花C3h的等電點(diǎn)為堿性達(dá)8.92，而其他植物皆為弱酸性。氨基酸序列比較和建樹分析表明，不同植物同類酶的理化性和序列相似性分析結(jié)果是一致的。以金銀花為例：Hqt方面，金銀花和桔梗進(jìn)化關(guān)系最近，其次是刺苞菜薊；與虎眼萬年青遺傳距離最遠(yuǎn)。Hct方面，與金銀花進(jìn)化關(guān)系最近的是煙草，其次是團(tuán)花樹和中粒咖啡。C3h方面，則沒有發(fā)現(xiàn)與金銀花進(jìn)化關(guān)系特別接近的植物物種。

5 討論

對(duì)金銀花等不同植物綠原酸合成途徑中Hqt、Hct、C3h的系統(tǒng)發(fā)生分析表明，用不同蛋白質(zhì)分子建立系統(tǒng)發(fā)育樹不能得出各種植物相同的進(jìn)化關(guān)系。如：金銀花和桔梗的Hqt分子進(jìn)化關(guān)系較近，而它們的Hct的進(jìn)化關(guān)系則較遠(yuǎn)。代謝途徑相似的情況下，不同植物中合成的終產(chǎn)物(如：綠原酸)含量也可能有差異。因此關(guān)鍵酶的序列差異和表達(dá)差異都可能對(duì)代謝終產(chǎn)物的生成有所影響。不同植物不同酶分子進(jìn)化上的差異，可能表明它們所在植物為了適應(yīng)各自的環(huán)境和生存策略，選擇了對(duì)不同化合物的需求差異，并進(jìn)一步將這種差異反映在了代謝途徑中，最終這種選擇會(huì)映射到相應(yīng)的基因組中，影響到遺傳的變化?；⒀廴f年青Hqt與其他植物較大的遺傳距離以及疏水性方面的明顯差異，可能表明綠原酸合成途徑對(duì)該植物而言，或者有不一樣的作用。另外，金銀花C3h與其他植物同一分子在等電點(diǎn)方面的顯著差異，可能指示金銀花細(xì)胞中C3h的活性環(huán)境與其他植物或有差異，但這需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

本研究最大的遺憾是在選擇植物種類的時(shí)候，沒有選擇相同物種的3種關(guān)鍵酶進(jìn)行比較，削弱了不同植物綠原酸合成途徑的可比性。這主要是因?yàn)椴⒎撬心康奈锓N的Hqt、Hct和C3h都被測(cè)序研究，或者并非所有的植物都有完整的綠原酸合成途徑。因此，如果要有更準(zhǔn)確的分析結(jié)果，可能還需要進(jìn)一步改進(jìn)研究策略，例如：3種綠原酸合成途徑的關(guān)鍵酶在金銀花和煙草中都存在，且兩種植物的Hct的分子遺傳距離很近。因此在后續(xù)代謝途徑比較研究過程中可以將金銀花和煙草進(jìn)行對(duì)比，幫助人們進(jìn)一步了解了綠原酸合成途徑的細(xì)節(jié)。