基于人工基質的著生藻類測定方法探討

嚴 飛，朱冰川，徐 賧

(江蘇省無錫環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 無錫 214000)

1 引言

河流水質主要從理化指標、水生生物、生境狀況等角度評價[1]?，F有環(huán)境下物理和化學監(jiān)測技術已經較為成熟，對污染物已經可以進行快速完善的測定，但環(huán)境中的污染物并非單獨存在，環(huán)境受到污染后的影響非常復雜也難以進行快速鑒定，因此根據水生生物對水體污染快速反應的特點，可以進行水環(huán)境污染的及時預警。水生生物的研究近年來越發(fā)重要，河流中藻類主要分為著生藻和浮游藻兩大類,著生藻類是水體中的初級生產者[2]。著生藻類是生長在水下各種基質表面上的所有藻類[3]，是水生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分[4]，但著生藻類的研究報道較少[5]。著生藻類生物完整性指數的水生態(tài)健康評價技術在國外得到廣泛應用[6]。

著生基質是研究著生藻類工作的基本材質，按照采樣基質的不同，對著生藻類的研究可以分為天然基質法和人工基質法。天然基質法是指采集位于水下的鵝卵石、碎石、高等水生植物、大型藻類、枯枝落葉等，并從其上刮取著生藻類，或用培養(yǎng)皿扣去河床上細沙、沉積物得到藻類的方法到藻類的方法[7]。受天然基質的局限性,對著生藻類的深入研究有限，而人工基質主要有載玻片、瓷磚、人工水草等[8]，本文以標準面積和可知時間的人工基質探討著生藻類的測定。由于對人工基質尚未有統(tǒng)一的使用標準,本次實驗主要對著生藻類的定性、定量監(jiān)測結果以及精密性等進行分析探討，對樣品處理和鑒定計數采用常規(guī)制片法(非硅藻樣品)和改進的計數方法[9]。

2 方法原理

利用人工基質(放置一段時間，讓藻類能附著生長)和天然基質采集水中著生藻類，對采集的樣品進行固定、濃縮，抽取樣品在顯微鏡下進行著生藻類的定性和定量，其中通過生物個體計數來表征單位面積藻類個體數量(藻類密度)，利用形態(tài)學對物種進行定性鑒定。

3 儀器設備、試劑和材料

3.1 設備器材

毛刷、鑷子、刀片、剪刀、樣品瓶(250 mL)、標簽紙、丙烯酸纜繩、硅藻計(由本中心提供技術參數進行定制，載玻片尺寸2.5 cm×7.7 cm，一共8 片，總面積為300 cm2，無站內編號)，配備10×目鏡和20×、40×、100×(油鏡)物鏡的生物顯微鏡(型號：NIKON80i，站內編號：AGS001，校準日期：2018年6月11日，有效期為1 年，檢定校準證書見附件10)，載玻片及蓋玻片、浮游生物計數框、移液槍、一次性槍頭、記號筆、膠頭滴管、乳膠手套及一般實驗室常用儀器和設備。

3.2試劑藥品

(1)固定劑。魯哥氏液：40 g碘(含量≥99.8%，分析純)溶于含碘化鉀(含量≥99.0%，分析純)60 g的1000 mL水溶液中；福爾馬林：市售40%的甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，分析純)。

(2)實驗用水。蒸餾水：新制備的超純水。

4 樣品的采集與保存

本次方法確認于2019年3月12日在梁南橋點位開始放置人工基質(硅藻計)1 個，每天查看，以確保硅藻計不丟失。3月26日收集樣品(人工基質定性、定量樣品1個，天然基質定性樣品1個)，共計2個(采樣記錄見表1)。

表1 采樣記錄

4.1 樣品采集

4.1.1 定量樣品—人工基質法

本次實驗采用人工基質硅藻計，在河流采樣中避開急流和漩渦，采樣時固定好器材，保證硅藻計距離水面5～10 cm，使之得到合適的光照，每天觀察了解采樣器材放置情況，在放置14 d后進行著生藻類的采集，采集過程中將硅藻計從水中緩慢移出，用毛刷和刀片將載玻片表面上所有附著的著生藻類全部刮到盛有蒸餾水的玻璃瓶中，并用蒸餾水將基質沖洗多次，用魯哥氏液固定，貼上標簽。此次方法確認采用直接加入魯哥氏液固定來定量鑒定著生藻類。

4.1.2 定性樣品—天然基質法

采集天然基質上的著生藻類樣品，本次實驗中采集基質為卵石(85%)、樹木殘干(15%)，采集過程中將基質從水中緩慢移出，將表面相對較為光滑和略帶綠色、藍綠色或棕黃色的部分用刀片刮取到裝有少量蒸餾水的樣品瓶中。將所有采集到的樣品混合裝入樣品瓶中，加入甲醛溶液，貼上臨時標簽。

4.2 樣品固定和保存

(1)定性樣品固定：按100∶3的比例在樣品中加入市售的甲醛溶液。

(2)定量樣品固定：按100∶1.5的比例在樣品中加入配好的魯哥氏液，鑒定完成后按定性樣品固定液的比例加入甲醛溶液永久保存。

(3)將樣品放入密封的樣品瓶中，置于統(tǒng)一的樣品柜中保存。

4.3 標識與記錄

(1)標識。在樣品瓶上粘貼標簽，標注采樣地點、日期、采集人姓名、固定液類型。在樣品記錄本上記錄與樣品編號相對應的采樣地點、日期與樣品類型。

(2)記錄。在著生藻類采樣記錄表中記錄河流名稱、采樣位置、采樣日期、采集人姓名、采樣方法及相關生態(tài)信息。采樣完成后，在著生藻類樣品登記表上記錄樣品信息(表2)。

表2 著生藻類樣品登記

5 樣品前處理和鑒定

5.1 樣品的處理和制備

5.1.1 定性樣品

常規(guī)制片法：將采集到的定性樣品根據個體密度適當沉淀、濃縮至適宜體積，觀察時，將樣品充分搖晃均勻后，靜置5～10 s，用膠頭滴管吸取液體中間略偏下位置的樣品滴放在載玻片上，制成臨時裝片。

5.1.2 定量樣品

將采集到的樣品濃縮、沉淀后，定容至20～50 mL(根據樣品中生物的密度確定定容體積)。本次實驗濃縮沉淀至50 mL。

5.2 鑒定和計數

所有樣品鑒定過程中參考《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》[10]。

5.2.1 定性樣品

將5.1.1 中制備的臨時裝片置于10×40 倍光學顯微鏡下進行觀察、鑒定和粗略計數。

5.2.2 定量樣品

將5.1.2 中制備的濃縮樣品充分搖晃均勻后，取0.1 mL置于浮游生物計數框中，在10×40 倍光學顯微鏡下進行觀察、鑒定和計數。

5.2.3 計數方法

本實驗采用改進的計數方法：對計數框中的樣品按照對角線的格進行計數，每0.1 mL計數10個小格，重復計數3個0.1 mL，共計30 小格。

著生藻類每片個數計算公式：

N=100×m/30

(1)

式(1)中：N為每片藻類個體數，ind；m為30 小格總個體數量(鏡檢生物個體數)，ind；30 為30 個小格；100 為計數框全片格數為100 個。

著生藻類個體數量(藻類密度)計算公式：

n=niV/ViS

(2)

式(2)中：n為單位面積藻類個體數量，ind/cm2；ni為抽樣的總個體數量，ind；V為定容總體積，mL；Vi為抽樣體積，mL；S為采樣的總面積，cm2，本次實驗采樣總面積為300 cm2。

6 實驗結果

本次方法確認的實驗時間：2019年3月12日至4月2日，實驗室分析結果分述如下。

6.1 天然基質定性監(jiān)測結果

定性樣品鑒定計數結果見表3。

表3 著生藻類—天然基質定性樣品數據統(tǒng)計

6.2 人工基質定性、定量樣品定性、定量樣品

數據鑒定計數結果見表4和表5。

表4 著生藻類—定量樣品數據統(tǒng)計表一

表5 著生藻類—定量樣品數據統(tǒng)計表二

6.3 精密性

由于生物監(jiān)測的特殊性，本實驗中主要針對定量樣品進行精密性檢查，通過以下兩方面來表征。

6.3.1 平行性

由同一分析人員在相同實驗條件下對同一樣品做平行分析，評估兩次實驗數據差異，兩片計數結果個數相差不超過15%(平行樣A見圖5，平行樣B見圖6)。由表1可知，平行樣個數計數結果相對差(相對差=兩片計數結果差值/兩片計數結果中的較小值×100)為4.7%，符合“兩片計數結果個數相差不超過15%”的要求[9](表6)。

表6 精密性檢查(平行性)

6.3.2 重復性

統(tǒng)一樣品、統(tǒng)一方法、統(tǒng)一分類鑒定參考文獻，做不同分析人員比對實驗，評估兩組實驗數據差異，兩片計數結果個數相差不超過15%。由表2可知，人員比對藻類個數計數結果相對差(同上)為7.8%，符合“兩片計數結果個數相差不超過15%”的要求(表7)。

表7 精密性檢查(重復性)

7 討論

本次實驗，探討了人工基質用于河流中著生藻類監(jiān)測的可行性，并使用該方法對梁塘河梁南橋斷面著生藻類進行了監(jiān)測，從實驗結果來看，在著生藻類定性方面，采用人工基質監(jiān)測結果與天然基質基本一致，藻種鑒定結果一致性達到95%；在著生藻類定量方面，經過精密性檢查，平行性符合“兩片計數結果個數相差不超過15%”的要求，重復性符合“兩片計數結果個數相差不超過15%”的要求。

總體來看，人工基質比天然基質在河流著生藻類監(jiān)測方面有以下優(yōu)勢：①人工基質比天然基質外觀更規(guī)整，沒有復雜結構，更容易觀測分析；②人工基質比天然基質更具有普及性，可以統(tǒng)一基質的材質并且對不同水體、流域進行橫向對比以及同一水體的不同深度縱向對比；③人工基質更易使藻類附著，并且可以在天然基質無法出現的更深水體中放置，開展更多開創(chuàng)性研究；④人工基質比天然基質更易保存，防止由于類似木材生物質離開水體后的氧化腐爛對藻類產生影響。由此可見，用人工基質取代天然基質對河流著生藻類進行監(jiān)測具有可行性，在今后實際工作中可以嘗試采用人工基質開展監(jiān)測。為繼續(xù)更深層次的著生藻類研究、水污染預警研究、和水生生物指示劑的研究提供鋪墊和引導作用。