快速精確獲取小鼠角膜神經(jīng)三維圖像及其參數(shù)的技術(shù)方案研究

傅婷 黃奕嘉 劉俊 李志杰

1暨南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 眼表疾病協(xié)同創(chuàng)新研究實驗室&眼科研究所，廣州 510632；2暨南大學第一臨床醫(yī)學院眼科，廣州 510632

角膜是一種無血管、無淋巴管的透明組織，其屈光力約占整個視覺系統(tǒng)屈光力的2/3。角膜任何結(jié)構(gòu)和功能的改變均可顯著影響外界物體在視網(wǎng)膜成像的準確性[1]。角膜中分布著大量神經(jīng)纖維，角膜神經(jīng)纖維可通過復雜的感覺、瞬目和刺激淚液分泌來維持眼表的自身穩(wěn)態(tài)[2]。另外，角膜神經(jīng)亦可通過釋放多種營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)角膜上皮細胞的分裂和創(chuàng)傷修復以維持角膜上皮層的完整性[3]。當角膜神經(jīng)纖維功能受損時將導致多種眼表疾病，如干眼、角膜神經(jīng)營養(yǎng)不良、角膜上皮潰瘍等，嚴重者可致盲。此外，角膜神經(jīng)纖維感覺過敏還可能導致角膜神經(jīng)性疼痛[4]。因此，研究角膜的神經(jīng)分布和生理特征不僅有利于了解正常的角膜結(jié)構(gòu)和生理功能，而且對于研究神經(jīng)相關(guān)性角膜病的發(fā)生機制以及制定相關(guān)的防治措施均具有重要意義。鑒定角膜神經(jīng)纖維的方法包括早期經(jīng)典的神經(jīng)組織學方法，如氯化金和氯化銀染色，以及后來的免疫熒光組織化學方法、采用透射電子顯微鏡技術(shù)對離體角膜神經(jīng)進行超微結(jié)構(gòu)觀察和采用激光掃描共聚焦顯微鏡對活體角膜神經(jīng)進行研究等[5-11]。上述方法各有利弊，如角膜組織切片后采用氯化金染色法雖然可以看到角膜上皮神經(jīng)末梢，但不能對角膜神經(jīng)進行整體觀察；普通光學顯微鏡分辨率低，難以提供高清神經(jīng)結(jié)構(gòu)圖像。近十年來，本研究團隊采用高分辨率去卷積顯微鏡進行小鼠完整角膜神經(jīng)纖維圖像獲取，并結(jié)合交互式顯微鏡圖像分析軟件Imaris的絲狀追蹤模塊對正常和創(chuàng)傷角膜的神經(jīng)分布特征及其各種參數(shù)進行分析[12-16]。角膜神經(jīng)的可視化研究對角膜多種疾病的發(fā)病機制和病理學機制的研究具有重要意義。本研究擬探討獲取角膜神經(jīng)分布和分析參數(shù)的實驗方法，為相關(guān)研究工作提供新的方法學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取8周齡健康無眼疾SPF級雌性C57BL/6小鼠4只，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。實驗過程嚴格遵循視覺眼科學研究學會制定的科研動物使用規(guī)范，本研究方案經(jīng)暨南大學實驗動物福利委員會審核批準(批文號：JN-A-2002-01)。

1.1.2主要試劑及儀器 抗神經(jīng)元特異性β-Ⅲ微管蛋白NorthernLightsTMNL557熒光標記抗體(美國R&D Systems公司)；Triton-X100、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’,6-diamidine-2’-phenylindole dihydrochloride，DAPI)(美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；乙醚(廣州化學試劑廠)；質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛(上海索萊寶生物科技有限公司)；抗熒光衰減封片劑(武漢博士德生物工程有限公司)。體視顯微鏡(桂林桂光儀器有限公司)；脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；高爾夫樣刀(美國Accutome公司)；高分辨率去卷積顯微鏡(DeltaVision Elite，美國GE醫(yī)療集團)。

1.2 方法

1.2.1角膜組織的獲取 按照文獻[17]描述的方法獲取小鼠角膜。吸入過量乙醚麻醉后使小鼠安樂死，立刻取下4只小鼠完整右眼眼球置于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜(圖1A)，在PBS中漂洗3次，每次5 min，剖取具有完整角膜緣的角膜片。

圖1 角膜組織的獲取、固定、免疫熒光染色和角膜整鋪片流程圖 A：眼球固定 B：角膜組織切開成梅花狀 C：梅花狀角膜組織的抗體孵育 D：孵育后梅花狀角膜組織的漂洗 E：梅花狀角膜組織整鋪片F(xiàn)igure 1 Flowchart of the acquisition,fixation,immunofluorescence staining of corneal tissue and whole-mounted cornea preparation A：Fixation of the eyeball B：The corneal tissue cut into a plum blossom shape C：Antibody incubation of plum-shaped corneal tissue D：Rinsing of plum-shaped corneal tissue after incubation E：A plum-shaped corneal whole-mount

1.2.2免疫熒光染色及角膜整鋪片 將漂洗后的角膜片置于載玻片上，在顯微鏡下放射狀切開成梅花狀，將梅花狀角膜組織放入200 μl質(zhì)量分數(shù)2% BSA溶液中封閉15～20 min后置于含體積分數(shù)0.1% Triton X-100的PBS中透膜15～20 min；在含有2% BSA和0.1% Triton X-100的PBS混合溶液中按照10∶ 1的比例加入抗神經(jīng)元特異性β-Ⅲ微管蛋白NorthernLightsTMNL557熒光標記抗體；將透膜后的角膜組織置于含抗體的混合液中，放在40 r/min的脫色搖床上，4 ℃環(huán)境下避光孵育過夜；將角膜組織置于培養(yǎng)皿中，PBS漂洗3次，每次5 min；將角膜組織置于載玻片上，內(nèi)皮面朝下，在體式顯微鏡下將角膜鋪平；滴加含有DAPI的抗熒光衰減封片劑后用超薄蓋玻片封片，用螺釘夾平并置于避光環(huán)境下風干(圖1)。

1.2.3整個角膜神經(jīng)纖維分布圖像的獲取 將封片好的角膜片置于DeltaVision Elite高分辨率去卷積顯微鏡60倍油鏡下；通過調(diào)節(jié)焦距，將角膜上皮層定位掃描最高點，內(nèi)皮層定位掃描最低點，2點之間的距離為掃描的縱向(Z)間距，通過移動載物臺確定掃描橫向距離X軸和Y軸，確定掃描范圍，囊括完整的角膜組織；每個圖像掃描的Z軸間距(dZ)、X軸長度(dX)和Y軸寬度(dY)可根據(jù)角膜厚度及大小進行調(diào)整；采用科學互補性金屬氧化物半導體探測器捕獲圖像，當掃描程序接收后即可獲得所掃描區(qū)域的圖像文件；為了獲得更為清晰的圖像，一般可將上述圖像文件采用DeltaVision Elite系統(tǒng)自帶的去卷積功能進行還原型三維(three dimension，3D)去卷積運算；采用縫合(Stitch)模塊可將獲得的上述圖像進行拼接并最終得到完整的角膜神經(jīng)纖維圖像文件[由于所獲取的圖像文件巨大，可選擇用于縮減的倍數(shù)(10倍或更大的倍數(shù))功能縮減文件大小以避免運算過載，造成過程終止或黑屏]；根據(jù)需要可采用計算機自帶投射功能將Z軸獲得的數(shù)據(jù)投射成一個平面圖像；在View模式下進行“Volume Viewer”可對獲取的圖片進行3D可視化。

1.2.4角膜神經(jīng)纖維的自動統(tǒng)計

1.2.4.1角膜分區(qū) 為了分析角膜中神經(jīng)纖維在生理和病理狀態(tài)下的分布和改變，將完整的角膜從角膜中央到角膜緣分為5個環(huán)形區(qū)，依次為1區(qū)(Center)、2區(qū)(Paracentral)、3區(qū)(Original wound edge)、4區(qū)(Peripheral)和5區(qū)(Limbus)(圖2)。以方便統(tǒng)計不同區(qū)域內(nèi)角膜神經(jīng)纖維的不同參數(shù)。

圖2 完整角膜分區(qū)示意圖 含有角膜緣的完整角膜從角膜中央到角膜緣可分為5個區(qū)Figure 2 Schematic diagram of cornea zones The cornea with complete limbus could be divided into five annular zones (1-5) from the central cornea to the limbal area

1.2.4.2角膜不同分區(qū)內(nèi)角膜神經(jīng)纖維的自動統(tǒng)計 采用交互式顯微鏡圖像分析軟件Imaris(Bitplane AG，Zurich，Switzerland)中絲狀物追蹤(Filament Tracer)模塊下的自動檢測(Automatic Detection)模式進行角膜不同分區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維的自動統(tǒng)計。具體步驟為：(1)感興趣區(qū)域的創(chuàng)建 采用Surpass視圖模式打開圖片(注意所打開圖像格式應為TIF格式)，用工具欄“Edit”中的“Crop 3D”模塊選擇確定一個感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)(圖3A)；(2)細絲結(jié)構(gòu)的創(chuàng)建 在Surpass目錄欄上點擊新建細絲結(jié)構(gòu)(Add New Filament)圖標加入一個新的細絲結(jié)構(gòu)；(3)算法創(chuàng)建 以自動路徑(非回路)[Autopath (no loops)]作為算法，并選擇圖像計算細絲直徑(Calculate Diameter of Filament from Image)；(4)起始點及終止點直徑的創(chuàng)建 通過設(shè)置起始點最大直徑(Starting Points Largest Diameter)及終止點最小直徑(End Piont Diameter)來構(gòu)建ROI中絲狀物結(jié)構(gòu)的起始點和終止點直徑；(5)分類點的創(chuàng)建 通過手動調(diào)節(jié)起始點閾值(Starting Poind Threshold)和終止點閾值(Seed Poind Threshold)，將自動檢測到細絲結(jié)構(gòu)的起始點和終止點進行分類；(6)樹突直徑的創(chuàng)建 通過手動調(diào)節(jié)樹突直徑閾值(Dendrite Diameter Threshold)將神經(jīng)絲狀物相應地顯示出來；(7)細絲顯像設(shè)置 通過更改細絲樣式(Style)以及是否顯示樹突結(jié)構(gòu)(Show Dendrites)來改變細絲視覺效果圖，從而獲取待檢測角膜神經(jīng)纖維可視化圖像(圖3B)；(8)數(shù)據(jù)處理 通過點擊統(tǒng)計圖標(Statistics)可以自動得到角膜神經(jīng)纖維不同的統(tǒng)計變量以及統(tǒng)計類別，選擇詳細標簽(Detailed)下的所有值(All Values)，通過“Export All Statistics to File”導出所有自動統(tǒng)計的數(shù)據(jù)。

圖3 Imaris軟件自動檢測模式下分析的角膜神經(jīng)圖像 抗神經(jīng)元特異性β-Ⅲ微管蛋白NorthernLightsTMNL557熒光標記抗體標記角膜神經(jīng)纖維，紅色為神經(jīng)纖維 A：完整角膜神經(jīng)纖維圖像ROI(方框)的確定(標尺=500 μm) B：待測區(qū)域神經(jīng)絲狀物細絲(標尺=50 μm) 藍色點代表待測神經(jīng)纖維的起始點Figure 3 Corneal nerve images analyzed with Imaris software under the automatic detection module The corneal nerve fibers were immunostained by NorthernLightsTMNL557,the anti-β-Ⅲ tubulin fluorescent-conjugated antibody,and color red indicated nerve fibers A：The identification of ROI (square) of the complete corneal nerve image (bar=500 μm) B：Visualized corneal nerve filament in the area to be tested (bar=50 μm) The blue dots showed the starting points of the nerve filament

1.2.4.3自動路徑模式下指定起始點至終止點神經(jīng)纖維長度的自動統(tǒng)計 自動檢測模式是根據(jù)設(shè)置細絲結(jié)構(gòu)的起始點以及終止點閾值對不同ROI內(nèi)角膜神經(jīng)纖維信息的自動統(tǒng)計，當需要測定指定神經(jīng)纖維起始點至終止點纖維長度時，選擇絲狀物追蹤模塊中的自動路徑(AutoPath)模式進行操作。(1)細絲結(jié)構(gòu)的創(chuàng)建 Surpass視圖模式打開圖片，在3D View模式下創(chuàng)建新的細絲結(jié)構(gòu)；(2)算法創(chuàng)建 創(chuàng)建算法時點擊“跳過自動創(chuàng)建，手動編輯(Skip automatic creation,edit manually)”，即停止起始點和終止點自動檢測；(3)待測神經(jīng)纖維的繪制 點擊繪制(Draw)標簽，選擇方法(Method)參數(shù)為自動路徑，改變鼠標指針模式為“Select”，按下Shift和鼠標右鍵確定待測神經(jīng)纖維起始點，沿著神經(jīng)纖維路徑移動鼠標光標至待測神經(jīng)纖維終止點，按下Shift和鼠標左鍵固定終止點；(4)數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計圖標導出數(shù)據(jù)中的“_Filament_Length_(sum)”文件即為待測神經(jīng)纖維的長度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 角膜神經(jīng)纖維圖像

角膜3D圖像中可見角膜基質(zhì)神經(jīng)叢、角膜基底下神經(jīng)叢、由角膜基底下神經(jīng)分支向角膜上皮層延伸的神經(jīng)末梢以及不同角膜層面上的完整角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)。小鼠角膜緣處神經(jīng)纖維進入角膜基質(zhì)層后分成許多細小的分支，向角膜中心伸展，并向上延伸至角膜前間質(zhì)層，部分角膜基質(zhì)神經(jīng)相互交織形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，但大部分角膜基質(zhì)神經(jīng)分支穿過角膜基底膜形成角膜基底下神經(jīng)叢。角膜上皮神經(jīng)由角膜基底下神經(jīng)叢及游離的神經(jīng)末梢組成，構(gòu)成角膜基底下神經(jīng)纖維。角膜緣處呈密集網(wǎng)絡(luò)狀的基質(zhì)層神經(jīng)纖維在進入前彈力層后開始發(fā)出密集的分枝，形成直的或串珠狀角膜基底下神經(jīng)叢，角膜基底下神經(jīng)叢向角膜中心伸展交織形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，在角膜頂點匯聚成漩渦狀結(jié)構(gòu)，少部分纖維垂直進入上皮層，并發(fā)出許多微小的神經(jīng)末梢分枝(圖4)。

圖4 DeltaVision Elite高分辨率去卷積顯微鏡下獲取的角膜神經(jīng)圖像 抗神經(jīng)元特異性β-Ⅲ微管蛋白NorthernLightsTMNL557熒光標記抗體標記角膜神經(jīng)纖維，紅色表示神經(jīng)纖維，藍色表示細胞核 A：角膜神經(jīng)纖維3D圖像的縱切面(標尺=25 μm) 1：角膜基質(zhì)神經(jīng)叢；2：角膜基底下神經(jīng)叢；3：角膜神經(jīng)末梢分枝 B：小鼠角膜基質(zhì)神經(jīng)纖維圖(標尺=100 μm) 可見部分角膜基質(zhì)神經(jīng)相互交織形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) C：小鼠角膜基底下神經(jīng)纖維圖(標尺=100 μm) 可見角膜基底下神經(jīng)叢(白色虛線框代表ROI) D：角膜基底下神經(jīng)叢(標尺=100 μm) 角膜基質(zhì)神經(jīng)分支穿過角膜基底膜形成直的或串珠狀角膜基底下神經(jīng)叢 E：角膜基底層下神經(jīng)纖維在角膜頂點匯聚成漩渦狀結(jié)構(gòu)(標尺=100 μm) F：位于角膜上皮層內(nèi)的角膜神經(jīng)末梢分枝(標尺=100 μm)Figure 4 Corneal nerve images obtained with the DeltaVision Elite high-resolution deconvolution microscope The corneal nerve fibers were immunostained by NorthernLightsTMNL557,the anti-β-Ⅲ tubulin fluorescent-conjugated antibody,and color blue showed cell nuclei and color red indicated nerve fibers A：The longitudinal section of a 3D image of a corneal nerve (bar=25 μm) 1：Corneal stromal nerve plexus;2：Corneal subbasal nerve plexus;3：Branch of corneal nerve endings B：Corneal stromal nerve image of mouse (bar=100 μm) Some intertwined corneal stromal nerves formed a neural network C：Corneal subbasal nerves image (bar=100 μm) Nerve plexus at the bottom of the corneal basement membrane were seen (The white dotted frames showed ROI) D：Corneal subbasal nerve plexus image (bar=100 μm) Branches of corneal stromal nerve went through the corneal basement membrane to form straight or bead-like corneal subbasal nerve plexus E：Corneal subbasal nerves converging into a vortex-like structure at the apex of the cornea (bar=100 μm) F：Branches of corneal nerve endings in the epithelium (bar=100 μm)

2.2 小鼠角膜神經(jīng)纖維密度和長度影像

2.2.1角膜不同分區(qū)內(nèi)角膜神經(jīng)纖維密度 4區(qū)角膜上皮神經(jīng)末梢密度為(2 488.88±282.84)μm/μm2，角膜神經(jīng)纖維向角膜中央1區(qū)逐漸增多，中央1區(qū)密度為(5 766.66±298.55)μm/μm2；4區(qū)角膜基質(zhì)層神纖維密度為(40.99±0.99)μm/μm2，基質(zhì)層神經(jīng)纖維向角膜中央1區(qū)逐漸減少，中央1區(qū)密度為(34.57±1.28)μm/μm2；角膜基底下神經(jīng)纖維密度從角膜緣向角膜中央呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

2.2.2指定起始點至終止點角膜神經(jīng)纖維長度 自動路徑模式下可見，角膜緣處呈密集網(wǎng)絡(luò)狀的基質(zhì)層神經(jīng)纖維進入前彈力層(151.36±20.72)μm處開始發(fā)出密集的分枝，形成基底下神經(jīng)叢(圖5)。

圖5 Imaris軟件自動路徑檢測模式下分析的角膜神經(jīng)圖像(標尺=50 μm) 抗神經(jīng)元特異性β-Ⅲ微管蛋白NorthernLightsTMNL557熒光標記抗體標記角膜神經(jīng)纖維，可見角膜緣處呈密集網(wǎng)絡(luò)狀的基質(zhì)層神經(jīng)纖維進入前彈力層約151 μm處開始發(fā)出密集的分枝，形成基底下神經(jīng)叢，紅色為神經(jīng)纖維 A：白色箭頭指待測神經(jīng)纖維 B：黃色線段顯示待測角膜神經(jīng)纖維顯像，藍色點代表待測神經(jīng)纖維的起始點Figure 5 Corneal nerve images analyzed with Imaris software under the autopath module (bar=50 μm) The corneal nerve fibers were immunostained by NorthernLightsTMNL557,the anti-β-Ⅲ tubulin fluorescent-conjugated antibody,and the stromal nerve fibers in a dense network at the limbus entered the Bowman membrane for about 151 μm and then began to branch to form subbasal nerve plexus.The color red indicated nerve fibers A：The white arrows showed the nerve to be measured B：The yellow lines showed the visualized corneal nerve fibers to be tested,and the blue dots showed the starting points of the nerve filament to be tested

3 討論

本研究團隊在角膜整鋪片下采用高分辨率去卷積顯微鏡對小鼠角膜神經(jīng)分布和3D結(jié)構(gòu)進行分析，可以清晰地顯示角膜上皮層神經(jīng)末梢、角膜基底層下神經(jīng)叢以及角膜基質(zhì)層神經(jīng)纖維的分布和基本結(jié)構(gòu)特征。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過圖像分析軟件Imaris的絲狀物追蹤模塊可以快速和自動檢測特定區(qū)域的角膜神經(jīng)纖維相關(guān)參數(shù)，主要包括神經(jīng)纖維密度和單一神經(jīng)纖維長度。該實驗方案為相關(guān)研究人員評估正常和病理狀態(tài)下角膜神經(jīng)的分布和形態(tài)特征以及各種疾病狀態(tài)下神經(jīng)纖維的動態(tài)變化過程提供了重要的技術(shù)支持和方法學依據(jù)。

角膜神經(jīng)起源于三叉神經(jīng)節(jié)，含有薄髓鞘的Aδ類神經(jīng)和無髓鞘的C類神經(jīng)[18]。角膜緣有髓神經(jīng)纖維進入角膜基質(zhì)淺層后在角膜內(nèi)脫髓鞘形成透明的角膜上皮下神經(jīng)叢，并跨越角膜上皮層形成垂直纖維神經(jīng)以及角膜基質(zhì)神經(jīng)。角膜基質(zhì)層神經(jīng)纖維主要位于角膜基質(zhì)的前中部[2,6]，角膜上皮層的垂直神經(jīng)末梢與角膜的感覺敏感度密切相關(guān)。角膜基底下神經(jīng)叢由串珠狀神經(jīng)纖維組成，這些串珠樣結(jié)構(gòu)在電子顯微鏡下呈現(xiàn)神經(jīng)纖維內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu)，其主要功能是為神經(jīng)纖維的代謝和功能活動提供能量。因此，角膜神經(jīng)纖維串珠的大小和數(shù)量與角膜神經(jīng)纖維的代謝狀態(tài)相關(guān)[13,19]。此外，角膜神經(jīng)在維持眼表的穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用[4]。角膜感覺神經(jīng)可刺激淚腺生成淚液，以維持眼表濕潤狀態(tài)，其分泌的神經(jīng)肽物質(zhì)可促進角膜上皮細胞的有絲分裂[20]。角膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的破壞可造成角膜組織的神經(jīng)營養(yǎng)不良性角膜病變。角膜神經(jīng)屬于外周神經(jīng)系統(tǒng)，不具有完全的再生能力，其主要包括創(chuàng)口內(nèi)神經(jīng)纖維的出芽及創(chuàng)口周圍神經(jīng)主干生長出神經(jīng)纖維2種方式。角膜受到損傷后短期內(nèi)創(chuàng)傷區(qū)神經(jīng)纖維即可發(fā)生變性，創(chuàng)傷區(qū)周圍的神經(jīng)軸索生成新生軸突[5]。因此，探索不同生理和病理狀態(tài)下角膜神經(jīng)纖維的改變對于角膜相關(guān)疾病的及時診療具有重要的臨床意義。

本研究團隊在過去10年內(nèi)采用免疫熒光技術(shù)對角膜神經(jīng)纖維的染色方法進行了反復的技術(shù)改進，積累了許多可以借鑒的經(jīng)驗。需要指出的是，基于角膜的組織結(jié)構(gòu)特征，實驗過程中處理角膜的操作應注意下述問題：(1)為了獲取完整的角膜神經(jīng)纖維圖像，在取材過程中應盡量避免使用銳利器械，以免損傷角膜組織，特別是角膜上皮層；(2)角膜中的神經(jīng)纖維都是起自于角膜緣神經(jīng)的分支，為了獲得完整的角膜神經(jīng)圖像，必須保留足夠且完整的角膜緣結(jié)構(gòu)；(3)為了保證熒光標記抗體向角膜組織的滲透并防止孵育期間多個角膜之間的疊加，在抗體孵育過程中置于轉(zhuǎn)速為40 r/min的脫色搖床上4 ℃環(huán)境下至少過夜(12 h)處理；(4)為了減少熒光成分的脫失，孵育后的角膜組織用PBS漂洗過程中應緩慢振蕩，每次5 min，共3次；(5)為了確保角膜整鋪片處于平整狀態(tài)，鋪片過程中須確保角膜內(nèi)皮層向下、角膜上皮層向上，按圖1E的方式平鋪；(6)為了防止熒光在拍照過程中淬滅，應用商業(yè)抗熒光衰減封片劑或自制抗熒光衰減膠水封片；(7)在獲取圖像時其曝光強度不易過高；(8)用Imaris的絲狀物追蹤模塊自動檢測模式自動統(tǒng)計不同區(qū)域角膜神經(jīng)相關(guān)信息時應注意調(diào)節(jié)起始點閾值、終止點閾值和樹突直徑閾值；(9)正常角膜神經(jīng)密度和某些分布特征隨小鼠鼠齡的增加會發(fā)生衰老性下降[16,21]，因此比較分析上述各種角膜神經(jīng)參數(shù)時應注意小鼠鼠齡的影響。

本研究采用的獲取高清完整角膜神經(jīng)分布和各種圖像分析參數(shù)實驗方案的主要優(yōu)點包括：(1)采用整鋪片技術(shù)和高分辨率去卷積顯微鏡以及自攜帶的圖像拼接處理技術(shù)可獲得所有神經(jīng)纖維在整個角膜的3D分布特征，從而解決了傳統(tǒng)技術(shù)對了解角膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)和分布特征的局限性；(2)交互式顯微鏡圖像分析軟件Imaris的絲狀物追蹤模塊可自動和快速獲取特定區(qū)域內(nèi)角膜神經(jīng)纖維的相關(guān)參數(shù)?；诒狙芯糠椒ń⒌膶嶒灧桨缚蔀檠芯拷悄ど窠?jīng)的生理和病理特征提供重要的技術(shù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明傅婷：文章選題及撰寫、實驗研究、分析數(shù)據(jù)；黃奕嘉：實驗研究、分析數(shù)據(jù)；劉?。赫撐男薷?；李志杰：文章選題及撰寫