角膜上皮和基質(zhì)對角膜上皮基底膜再生的影響

羅煜青 綜述 李霞 審校

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021

基底膜是一種高度特化的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，廣泛存在于人體中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在組織損傷后，基底膜通過限制纖維化相關(guān)因子參與調(diào)節(jié)組織的纖維化愈合過程。角膜透明性對于維持其光學特性至關(guān)重要。角膜上皮基底膜(epithelial basement membrane，EBM)是介導角膜基質(zhì)纖維化的重要調(diào)控結(jié)構(gòu)。因此，EBM的損傷修復及其與角膜基質(zhì)纖維化的關(guān)系是研究組織纖維化的代表性系統(tǒng)之一[1-3]。本文就基底膜的認識發(fā)展、角膜EBM的成分與功能、角膜EBM再生與角膜基質(zhì)纖維化的關(guān)系、EBM再生的影響因素與相關(guān)治療方法進行綜述，以幫助臨床醫(yī)生從角膜損傷后的病理生理方面理解角膜瘢痕形成的過程及如何減輕角膜瘢痕化。

1 基底膜和角膜EBM概述

1.1 基底膜的認識發(fā)展及功能概述

在19世紀中期，研究者首次于光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)上皮與內(nèi)皮均附著在一層連續(xù)、柔軟的基底膜上?；啄V泛存在于人體各器官中[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，基底膜具有多種生物學功能，其可為上皮、內(nèi)皮或?qū)嵸|(zhì)細胞提供黏附，并將其與結(jié)締組織、神經(jīng)和肌肉分開；同時，基底膜可作為指導形態(tài)發(fā)生變化和組織修復的支架?；啄そ閷У募毎盘柾泛图毎兓艿浇M織特異性基底膜成分和結(jié)構(gòu)的影響[1]。

1.2 角膜EBM

角膜EBM位于角膜上皮與基質(zhì)之間，是一層高度特化的ECM。在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下EBM厚度為50～100 nm，由透明層和致密層構(gòu)成。EBM的主要成分包括層黏連蛋白(laminin，LM)、Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ，ColⅣ)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)和巢蛋白[5-6]。LM是EBM成分中最豐富的非膠原蛋白，它們可以自聚集形成網(wǎng)絡，啟動EBM的再生過程。LM還可以調(diào)節(jié)上皮細胞的遷移、分化，促進傷口愈合。這個作用是LM通過其亞基與整合素受體或非整合素受體結(jié)合，將EBM與上皮黏附而實現(xiàn)的[5-7]。ColⅣ自聚集形成的網(wǎng)絡決定了EBM的穩(wěn)定性，ColⅣ網(wǎng)絡的解體將導致EBM降解。ColⅣ以組織特異性的方式結(jié)合可溶性糖蛋白、蛋白聚糖和生長因子，完善EBM的屏障功能[1,8]。HSPG通過與其他EBM成分相互作用，參與組成完整的EBM。HSPG通過與多種表面受體結(jié)合，如成纖維細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、上皮生長因子、肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子，調(diào)節(jié)細胞增生、遷移和分化[9]。巢蛋白與EBM其他成分有良好的親和力，是EBM中重要的連接元件。在人體內(nèi)有巢蛋白1和巢蛋白2共2種亞型，二者相互代償，單一亞型的缺失不會導致EBM改變[6]。

2 角膜透明性的維持及角膜基質(zhì)纖維化

2.1 角膜基質(zhì)透明性的維持

角膜位于眼的最前部，約占屈光度的70%。角膜的透明性保證了光線的傳輸[10]。角膜基質(zhì)占人類角膜厚度的80%～90%。正常的角膜基質(zhì)由ColⅠ和ColⅤ構(gòu)成。不同類型的膠原緊密堆積，形成平行分布的板層[3,11]。此外，富含亮氨酸的蛋白多糖在ECM中具有重要的結(jié)構(gòu)作用，其指導、調(diào)節(jié)膠原纖維生長、纖維組織及ECM組裝。并且，富含亮氨酸的蛋白多糖膠原纖維可調(diào)節(jié)纖維間距，精確組織膠原纖維。精密的膠原纖維網(wǎng)絡可以減少光的散射，維持角膜基質(zhì)的透明性[3,12]。

2.2 角膜基質(zhì)纖維化

外傷、手術(shù)、感染和疾病發(fā)生后，角膜常發(fā)生基質(zhì)纖維化，而基質(zhì)纖維化是角膜瘢痕的病理學本質(zhì)。角膜基質(zhì)纖維化的產(chǎn)生是一個動態(tài)級聯(lián)的過程，包括角膜基質(zhì)細胞的激活、細胞因子的釋放和ECM異常沉積[13]。

在角膜上皮損傷后，傷口下基質(zhì)立刻出現(xiàn)細胞凋亡，形成無細胞區(qū)域。隨后，周圍的基質(zhì)細胞被激活并發(fā)育為成纖維細胞。成纖維細胞遷移至傷口區(qū)，并分泌ECM填補傷口。在傷口閉合后，成纖維細胞退化為基質(zhì)細胞，重新分泌正常的膠原纖維和蛋白多糖。這一過程使角膜恢復透明。若角膜嚴重受損，上皮及淚液中的纖維化相關(guān)因子TGF-β1持續(xù)以高濃度滲入基質(zhì)，成纖維細胞將在其作用下繼續(xù)發(fā)育為肌成纖維細胞并長期存在于傷口區(qū)。肌成纖維細胞本身不透明，并分泌紊亂的ECM，這些特性破壞了角膜的精確組織結(jié)構(gòu)，直接形成角膜瘢痕[13-15]。

3 EBM損傷修復與角膜基質(zhì)纖維化

EBM是介導角膜基質(zhì)纖維化的重要調(diào)控結(jié)構(gòu)[1]。在正常角膜中，TGF-β1存在于角膜上皮及淚液中，完整的EBM可阻止TGF-β1進入基質(zhì)，角膜基質(zhì)細胞處于靜止狀態(tài)。一旦EBM受損，TGF-β1就可以滲入基質(zhì)，激活角膜基質(zhì)細胞，啟動角膜纖維化過程。當EBM完全再生后，EBM阻斷TGF-β1進入基質(zhì)，肌成纖維細胞凋亡，正?；|(zhì)細胞重新填充傷口區(qū)，角膜恢復透明[13,16]。

3.1 EBM損傷與角膜基質(zhì)纖維化

在角膜上皮擦傷、干眼、糖尿病角膜病變、圓錐角膜等疾病早期，僅有角膜上皮輕微受損，上皮細胞經(jīng)過遷移、增生、分化后迅速覆蓋傷口，角膜往往不留瘢痕[2,17-20]。而在準分子激光屈光性角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy，PRK)中，角膜中央上皮、EBM與部分基質(zhì)被去除，術(shù)后1個月內(nèi)，所有患者均會出現(xiàn)角膜混濁，并在12～24個月內(nèi)出現(xiàn)明顯混濁，之后逐漸減輕。這是因為PRK破壞了角膜中央EBM，TGF-β1可以滲入基質(zhì)并啟動纖維化過程。與PRK相比，準分子激光角膜原位磨鑲術(shù)通過建立上皮-基質(zhì)皮瓣，保留了角膜中央完整的EBM。因此，術(shù)后角膜混濁僅存在于皮瓣邊緣，而角膜中央混濁少見。飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(small incision lenticule extraction，SMILE)僅從角膜側(cè)切口取出基質(zhì)，盡可能保留了完整的角膜結(jié)構(gòu)[21-22]。Sun等[23]僅在SMILE側(cè)切口處發(fā)現(xiàn)少量肌成纖維細胞。

在嚴重的外傷、感染及化學燒傷中，角膜往往在愈合后形成致密混濁。在角膜嚴重損傷中，角膜上皮、EBM、基質(zhì)均受到廣泛損傷，EBM無法在短時間內(nèi)再生[2]。Torricelli等[24]對屈光度為-9.0 D的兔眼行PRK術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)，角膜在術(shù)后1個月仍明顯混濁，TEM下未觀察到EBM再生，結(jié)果表明在角膜嚴重損傷后，即使傷口閉合，在EBM未再生的情況下，角膜混濁將持續(xù)存在。

3.2 EBM再生與角膜基質(zhì)纖維化消退

在角膜損傷后，EBM再生與角膜基質(zhì)纖維化消退密切相關(guān)。Santhanam等[25]通過對比屈光度為-4.5 D的兔眼PRK術(shù)后(-4.5 D組)與屈光度為-9.0 D的兔眼PRK術(shù)后(-9.0 D組)角膜情況，發(fā)現(xiàn)在8～10 d內(nèi)-4.5 D組兔角膜恢復透明，TEM下觀察到EBM的完全再生，角膜前基質(zhì)未發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞。相反，-9.0 D組在術(shù)后1個月時角膜仍然混濁，TEM下未觀察到EBM再生，角膜前基質(zhì)存在大量肌成纖維細胞。Marino等[26]對屈光度為-9.0 D的兔眼行PRK術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)，角膜在術(shù)后1個月時呈致密混濁，TEM下觀察未發(fā)現(xiàn)EBM結(jié)構(gòu)；2個月時，兔眼混濁區(qū)域出現(xiàn)局灶性透明，TEM下觀察可見EBM局部完全再生；4個月時，角膜完全恢復透明，TEM下觀察可見EBM完全再生，肌成纖維細胞消失。因此，他們推測角膜基質(zhì)纖維化的消退與EBM完全再生有關(guān)，并認為EBM是介導角膜基質(zhì)纖維化的重要調(diào)控結(jié)構(gòu)。

4 EBM再生的影響因素

EBM受損后，其能否迅速再生并恢復原有功能是決定角膜愈合結(jié)局的重要因素。因此，促進EBM再生可能是使混濁角膜恢復透明的重要手段。

4.1 EBM再生的過程及必要條件

目前的研究表明，EBM再生的起始步驟是角膜上皮細胞分泌的LM自聚集形成的網(wǎng)絡[7,27]。在LM形成新生EBM后，角膜基質(zhì)細胞必須參與后續(xù)EBM成分的提供[5]。因此，角膜上皮持續(xù)不愈合將導致LM合成不足，無細胞表面黏附，無法形成初始的EBM。若角膜基質(zhì)缺損嚴重，則基質(zhì)細胞無法提供后續(xù)EBM成分，亦無法生成初始的EBM。若角膜基質(zhì)缺失嚴重，則基質(zhì)細胞無法提供后續(xù)EBM成分，亦無法形成新生的EBM。

4.2 角膜上皮對EBM再生的影響

角膜上皮持續(xù)不愈合是導致EBM無法正常再生的重要因素。Wilson等[28]對屈光度為-4.5 D兔眼行PRK術(shù)后3～4周發(fā)生的角膜上皮持續(xù)缺損進行觀察，發(fā)現(xiàn)上皮若未在損傷后10～14 d愈合即會導致角膜基質(zhì)纖維化，即使該傷口在損傷后3～4周閉合，也不會有EBM再生。在重癥干眼、糖尿病角膜病變、圓錐角膜和嚴重的角結(jié)膜炎中，疾病早期常表現(xiàn)為角膜上皮受損。隨著病程延長，若角膜上皮長期不愈合，最終均會出現(xiàn)不同程度的角膜混濁[29-32]。

角膜上皮缺損可從以下幾個方面影響EBM再生：(1)LM作為EBM的主要成分，主要由角膜上皮提供，負責啟動EBM的再生過程。角膜上皮持續(xù)缺損導致LM分泌不足，無法自組裝形成連續(xù)的LM層。只有當角膜上皮愈合后，角膜上皮細胞分泌足夠的LM并將其錨定在上皮基底細胞表面才能形成連續(xù)的LM層[33-34]。(2)上皮缺損導致EBM與上皮錨定異常，直接影響EBM的正常功能。在圓錐角膜、角膜營養(yǎng)不良、糖尿病角膜病變、藥物性角膜病變等疾病中，均出現(xiàn)了上皮基底細胞數(shù)量減少、EBM與上皮錨定異常的情況[35]。這些疾病往往在晚期出現(xiàn)角膜混濁。(3)炎性因子白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)的作用。在角膜損傷后，淚液中IL-1分泌增加，它可直接激活Fas-Fas配體系統(tǒng)，誘導角膜基質(zhì)細胞凋亡；其次，IL-1可驅(qū)化骨髓源性纖維細胞達到傷口區(qū)，這些成纖維細胞到達傷口區(qū)后，可發(fā)育為肌成纖維細胞，參與角膜基質(zhì)纖維化過程；同時，IL-1可驅(qū)使中性粒細胞等炎性細胞釋放MMP作用于傷口區(qū)[16,36]。MMP直接作用于細胞外基質(zhì)蛋白和組成組織的分子，其中MMP-2與MMP-9可以直接降解EBM中ColⅣ組成的網(wǎng)絡，導致EBM降解[37]。MMP的持續(xù)升高可直接導致角膜上皮的持續(xù)缺損及EBM缺失。在復發(fā)性角膜糜爛、角結(jié)膜炎、糖尿病角膜病變中均可檢測到淚液中MMP含量的增加[32,37-38]。一旦上皮愈合，來自淚液和角膜上皮的IL-1和MMP就不能穿透上皮，繼續(xù)作用于基質(zhì)[39-40]。

因此，在角膜損傷后如何快速促進上皮愈合是減少EBM損害、促進EBM再生的重要手段。臨床上常用的治療方法包括：(1)配戴角膜繃帶鏡 配戴角膜繃帶鏡能減輕有害物質(zhì)和瞬目對角膜上皮的進一步損害[41]。(2)人工淚液點眼 使用人工淚液點眼可通過改善淚膜穩(wěn)定性而保護角膜上皮。有研究表明，透明質(zhì)酸可以促進角膜上皮細胞的遷移[42]。(3)局部使用類固醇類藥物 結(jié)膜下注射或滴注類固醇藥物能減少角膜傷口區(qū)中性粒細胞的遷移，減輕炎癥對角膜上皮的影響[43]。(4)局部或全身使用四環(huán)素類似物 多西環(huán)素及阿奇霉素除抗菌作用外，能直接抑制MMP對EBM和基質(zhì)的溶解。在反復不愈合的角膜傷口中，局部使用(結(jié)膜下注射或點眼)和口服四環(huán)素類似物可以促進角膜上皮化，減少角膜瘢痕形成[43-44]。(5)自體血清點眼 自體血清內(nèi)含有多種抗炎物質(zhì)，在長期不愈合的角膜中，可明顯促進上皮愈合[45]。(6)角膜緣干細胞移植 對于角膜緣干細胞受損而導致上皮持續(xù)不愈合的患者應積極進行角膜緣干細胞移植，以恢復角膜上皮的更新能力，維持角膜上皮細胞的功能[41]。

4.3 角膜基質(zhì)對EBM再生的影響

基質(zhì)缺損程度也是影響EBM再生的重要因素。與角膜的嚴重損傷相比，在較輕的角膜損傷中EBM完全再生和角膜恢復透明的時間均明顯較短，而在大范圍角膜損傷中，如穿通傷、化學燒傷、感染等，EBM出現(xiàn)延遲再生或缺陷再生，甚至不再生[46-48]。在大范圍角膜損傷中，肌成纖維細胞數(shù)量更多，角膜混濁更明顯且更不易消退。

角膜基質(zhì)主要通過以下方面對EBM再生造成影響：(1)角膜基質(zhì)細胞在受損時高表達EBM成分。有研究表明，在兔角膜損傷后，角膜基質(zhì)高表達EBM成分，如巢蛋白、基底膜聚糖和ColⅣ。并且，在較輕的角膜損傷中，EBM成分表達量明顯多于較重的角膜損傷[25]。Torricelli等[49]在人角膜的試驗中觀察到了類似的結(jié)果。(2)正常角膜基質(zhì)需要接近新生EBM，才能為EBM再生提供原料。角膜損傷修復過程中缺損的基質(zhì)部分由肌成纖維細胞及其分泌的紊亂的ECM填充，這一狀態(tài)是造成角膜基質(zhì)細胞無法接近新生EBM的因素[26,48]。體外研究表明，肌成纖維細胞內(nèi)彌散表達EBM成分，無法為EBM再生提供原料[50]。(3)角膜基質(zhì)表面的規(guī)則程度可以影響EBM再生。Netto等[51]利用準分子激光路徑中定位的細網(wǎng)篩在兔角膜表面模擬PRK術(shù)后基質(zhì)表面的不規(guī)則，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)表面越不規(guī)則，EBM再生越慢?；|(zhì)表面的不規(guī)則不利于LM形成連續(xù)的新生EBM，也不利于后續(xù)正常基質(zhì)細胞定位提供EBM成分[52]。

減少角膜基質(zhì)損傷、保留足夠數(shù)量功能正常的基質(zhì)細胞和減少基質(zhì)表面不規(guī)則是促進EBM再生的重要手段。臨床上針對角膜基質(zhì)損傷的治療方法較少，常用的方法有：(1)配戴角膜繃帶鏡 配戴角膜繃帶鏡可及時阻斷有害物質(zhì)對角膜基質(zhì)的進一步損害[53]。(2)絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)點眼 PRK術(shù)后常用MMC點眼減輕角膜基質(zhì)纖維化。MMC通過抑制分化活躍的肌成纖維細胞及其前體細胞的生長發(fā)育，為正?；|(zhì)細胞重新填充受損區(qū)域提供有力條件，促進EBM再生，以恢復角膜透明[52]。(3)羊膜移植 羊膜與角膜具有相似結(jié)構(gòu)，可以直接覆蓋傷口達到暫時替代EBM的作用，重建眼表[54]。(4)激光治療性角膜切削術(shù)(phototherapeutic keratectomy，PTK) PTK在已經(jīng)產(chǎn)生瘢痕的角膜中使用激光去除混濁的前基質(zhì)，并創(chuàng)造一個平滑的基質(zhì)表面，為EBM再生提供良好的環(huán)境[55]。近年來在體外研究中，組織工程學使用角膜基質(zhì)細胞3D培養(yǎng)模型模擬角膜基質(zhì)細胞微環(huán)境。該模型通過抗壞血酸誘導角膜成纖維細胞產(chǎn)生ECM。這種自組裝的ECM有助于研究各類生長因子在傷口愈合和組織再生中ECM沉積和重塑的作用[56]。

5 小結(jié)

角膜EBM與角膜基質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。EBM能特異性阻止纖維化因子TGF-β1持續(xù)滲入基質(zhì)，是角膜纖維化愈合過程中的重要調(diào)控結(jié)構(gòu)。角膜損傷是否破壞EBM影響角膜愈合的結(jié)局，在角膜損傷修復過程中，EBM是否及時并完全再生是角膜瘢痕能否減輕，甚至恢復透明的重要因素。角膜上皮為EBM再生提供的初始物質(zhì)LM和錨定結(jié)構(gòu)是EBM再生的起始步驟。角膜上皮的迅速愈合也阻止了炎性因子IL-1和MMP的作用。因此角膜上皮快速愈合能有效促進EBM再生。正常的角膜基質(zhì)細胞通過靠近新生EBM，為后續(xù)EBM再生提供所需原料。光滑的角膜基質(zhì)表面為EBM再生創(chuàng)造有利環(huán)境。在臨床工作中，促進角膜上皮迅速愈合、保存足夠數(shù)量功能正常的基質(zhì)細胞和創(chuàng)造光滑的角膜基質(zhì)表面是EBM再生的重要因素。但是針對角膜基質(zhì)損傷的有效治療方法仍較少，現(xiàn)階段常使用體外模型研究各類生長因子對角膜ECM重塑的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突