白三烯B4受體在急性髓系白血病中的預(yù)后價值和功能富集分析

急性髓系白血病（AML）是一種以原始造血細胞無序增殖為特征的骨髓惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率隨著年齡的增長而增加。由于該疾病的遺傳學(xué)復(fù)雜性，世界衛(wèi)生組織（WHO）分類和診斷標(biāo)準（2016 版）除臨床特征、形態(tài)學(xué)和免疫表型外，還納入了多種重現(xiàn)性細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)特征，如PML-RARα、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD、TP53、DNMT3A 和NPM1 突變等。目前，臨床工作者主要通過年齡、細胞遺傳學(xué)異常和特定基因突變來評估AML 患者的預(yù)后。然而，大約有40% AML 患者被歸類為中?；颊?，其中大多數(shù)未攜帶常見的核型異?；蚧蚋淖?。隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，近10年來，AML治療方案也有較大改觀。AML風(fēng)險分層策略和預(yù)后評估方案已不能滿足臨床需要。二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，腫瘤公共數(shù)據(jù)庫海量的測序和臨床信息為基因標(biāo)志物篩選提供了技術(shù)基礎(chǔ)。國內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)進行了多項研究來尋找新型預(yù)后生物標(biāo)志物并改善不同AML 亞組的風(fēng)險分層和預(yù)后評估。腫瘤發(fā)生、進展相關(guān)重要信號通路，比如免疫微環(huán)境、鐵死亡、脂質(zhì)和能量代謝、DNA修復(fù)和損傷有關(guān)的基因組經(jīng)過生物信息學(xué)模型處理可以作為預(yù)后判斷的工具。HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B等基因特征被證實為有效的單個預(yù)后分子指標(biāo)。但是這些基因標(biāo)志物的臨床應(yīng)用比較局限。由于參與腫瘤發(fā)生的信號通路基因之間相互調(diào)節(jié)、影響，有必要挖掘潛在的AML新型基因標(biāo)志物，完善腫瘤調(diào)控信號通路網(wǎng)絡(luò)機制。我們前期利用公共數(shù)據(jù)庫篩選了TCGA-AML 隊列中的多個預(yù)后相關(guān)基因，這些基因大部分未見諸報道，其預(yù)測準確性和有效性也未經(jīng)過臨床實驗驗證。本項研究中，我們通過生物信息學(xué)分析探討了AML腫瘤患者骨髓組織白三烯B4受體（LTB4R）的異常表達水平、預(yù)后價值和潛在生物學(xué)功能，并收集臨床標(biāo)本進行了初步驗證。LTB4R，又稱BLT1，是LTB4的高親和力受體，二者相互作用不僅可募集不同類型的炎癥細胞、激活炎癥反應(yīng)，也可作用于非免疫細胞啟動和/或放大各種組織中的病理性炎癥，在腫瘤組織中二者作用于不同的靶細胞呈現(xiàn)出更為復(fù)雜的抑癌或促癌效應(yīng)。已有研究報道LTB4R與實體腫瘤預(yù)后的相關(guān)性及作為治療靶點的潛力，如LTB4R在胰腺癌、表皮腫瘤、結(jié)腸癌組織過表達，促進腫瘤細胞增殖，調(diào)控細胞周期、誘導(dǎo)凋亡。另外，也可通過MMP-2途徑增強乳腺癌細胞的侵襲性，小鼠皮下腫瘤模型中證實LTB4R介導(dǎo)CTL 細胞在腫瘤組織中的浸潤。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用，因此調(diào)控免疫功能可能是預(yù)防和治療腫瘤的手段之一。針對AML患者的免疫治療手段也在不斷發(fā)展。目前，LTB4R在AML中的表達模式，預(yù)后價值，及其是否或如何影響AML患者的免疫微環(huán)境尚未見報道。本研究運用生物信息學(xué)工具分析了LTB4R在AML患者中的表達模式、預(yù)后價值和潛在生物學(xué)功能。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 樣本及試劑 本研究分析的數(shù)據(jù)集由美國國家癌癥研究所（NCI）TCGA 癌癥（TCGA-LAML）https://portal.gdc.cancer.gov/、GTEx（正常組織）https://gtexportal.org/home/datasets 和 Gene Expression Omnibus（GEO:GSE12417）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo下載。數(shù)據(jù)集TCGA-LAML于2020 年1月更新，納入173例AML患者，包含高通量測序（RNASeq）數(shù)據(jù)，其中151例含詳細的臨床信息（140例含預(yù)后信息）、細胞遺傳學(xué)和分子突變信息，以上數(shù)據(jù)集執(zhí)行R studio數(shù)據(jù)清洗“dplyr”包刪失信息不全的病例后納入生存分析和Cox回歸分析。

AML患者（=30）及健康對照者（=21）外周血樣本2020年2月～2022年1月于山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集，EDTA-K2 抗凝血用于分離外周血單個核細胞，促凝血1500 r/min離心5 min后分離血清保存至-80 ℃?zhèn)溆?。AML外周血樣本經(jīng)人工鏡檢分類篩選，白血病原始細胞比例≥20%或＞2000/μL的樣本（=19）納入本研究。實驗前均獲得患者知情同意。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批號為：2021[倫審字（S092號）]。

Ficoll 淋巴細胞分離液（天津灝洋），Trizol（Invitrogen），ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo），SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒（Toyobo），實時熒光定量PCR擴增儀ABI QuantStudio 5（ABI）。β-actin、LTB4R、HAVCR2、PDCD1引物由上海生工合成，序列如下：β-actin_180 bp：F：5'-CTCAC GAAACTGGAATAAGC-3'；R：5'-AAGCCACACGTA CTAAAGGT-3'；LTB4R_162 bp：F：5'-AGCTTTGTG GTGTGGAGTATCC-3'，R：5'-GCAACCAGCCAGTC CAAAAC-3'；HAV-CR2_75 bp：F：5'-CTGCTGCTAC TACTTACAAGGTC-3'，R：5'-GCAGGGCAGATAGG CATTCT-3'；PDCD1_137 bp：F：5'-CCAGGATGGTTC TTAGACTCCC-3'，R：5'-TTTAGCACGAAGCTCTCC GAT-3'。人LTB4R酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自上海凡科維公司，檢測范圍1～55 pg/mL。酶標(biāo)儀為Thermo Multiskan Go。

1.1.2 數(shù)據(jù)庫 利用基于網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)平臺，如PrognoScan、Linkedomics、UALCAN和WebGestalt和STRING（https://string-db.org/）進行生存分析、相關(guān)性分析、共表達基因篩選、功能富集分析和蛋白相互作用PPI（protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用R包“UpSetR”繪制Upset圖可視化共表達基因與免疫浸潤、DNA損傷修復(fù)、能量代謝、EMT相關(guān)基因的交集情況。采用R包“GSVA”內(nèi)置ssGSEA算法分析TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中LTB4R與24種免疫細胞標(biāo)志、免疫檢查點基因相關(guān)性。

1.2 方法

為進一步在臨床樣本中驗證LTB4R在AML中的表達水平及其與相關(guān)免疫檢查點基因表達的相關(guān)性，我們收集了白血病原始細胞比例≥20%或＞2000/μL 的AML患者外周血樣本，分離PBMC進行RT-PCR實驗，檢測各基因mRNA 表達水平，ELISA 實驗檢測血清LTB4R蛋白表達水平。圖8顯示在19例AML患者樣本中，LTB4R mRNA表達量高于對照樣本（=21），同時LTB4R mRNA 表達量與HAVCR2 呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與PDCD1正相關(guān)，但無統(tǒng)計學(xué)意義。AML患者血清LTB4R表達水平顯著高于正常對照樣本[（15.93±3.28）pg/mL（6.71±1.05）pg/mL，=0.0083]。

為了進一步探索LTB4R基因在AML中的潛在功能和分子途徑，我們利用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析了TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中173例患者的mRNA 測序數(shù)據(jù)，共篩選出與LTB4R相關(guān)的10 477個基因（＜0.01）。共表達熱圖顯示了與LTB4R表達呈正相關(guān)或負相關(guān)的Top10基因（圖4），參與炎癥反應(yīng)、代謝、胞膜運輸、細胞凋亡等一系列生物學(xué)功能。我們通過GO和KEGG分析在TCGA-LAML 數(shù)據(jù)集中富集了LTB4R共表達基因簇的功能和信號途徑。氣泡圖顯示基因簇富集于生物學(xué)進程（BP）免疫反應(yīng)相關(guān)的中性粒細胞活化、T細胞活化、細胞活性正向調(diào)節(jié)、白細胞粘附正向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中（圖5A）；這些基因簇在細胞成分（CC）方面是分泌性顆粒膜、溶酶體和細胞粘附蛋白復(fù)合體的推定結(jié)構(gòu)成分（圖5B）；在分子功能（MF）方面，它們涉及肌動蛋白及骨架綁定、SH2結(jié)構(gòu)域綁定和NADPH氧化酶活性等（圖5C）。KEGG分析富集了與共表達基因簇相關(guān)的7條通路（＜0.05），如B細胞受體信號途徑、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、腫瘤中心碳代謝（圖5D）。另一方面，腫瘤發(fā)生涉及免疫微環(huán)境、能量代謝、缺氧、鐵死亡、N6-甲基腺苷（m6A）等關(guān)鍵信號通路，UPSET 交集圖顯示，LTB4R共表達基因簇中132個為免疫相關(guān)基因，34個脂代謝相關(guān)基因，34個EMT相關(guān)基因，22個代謝調(diào)控分子和8個DNA損傷、修復(fù)調(diào)控分子（圖5E）。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可逃避免疫監(jiān)視、誘導(dǎo)免疫耐受，因此我們繼續(xù)分析了LTB4R與免疫浸潤細胞和免疫檢查點分子的相關(guān)性。圖6A 顯示，LTB4R 與免疫抑制細胞Treg、Th17、iDC、Tem 細胞呈正相關(guān)，而與T helper、CD8+T、Tcm、NK細胞呈負相關(guān)；圖6B顯示LTB4R與HAVCR2、PDCD1呈顯著正相關(guān)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示在AML中與LTB4R信號通路關(guān)聯(lián)密切前15位的蛋白包括LTB4R2、ALOX5、APALOX5、GPK6、GNAQ等，分別涉及腫瘤相關(guān)T細胞活化、炎癥反應(yīng)、Wnt信號通路、腫瘤相關(guān)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體和能量代謝。

探究前的知識儲備：教師引導(dǎo)學(xué)生復(fù)習(xí)綠色植物在光合作用中的物質(zhì)變化和能量變化的實質(zhì)，重點回顧化學(xué)能貯存在有機物中的要點，點亮學(xué)生思維中關(guān)于能量和物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，也為后面的探究埋下伏筆。

1.2.3 基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 我們利用(http://www.webgestalt.org/option.php)平臺對LTB4R及Top200共表達基因進行功能富集分析。選擇內(nèi)置的參考人類蛋白質(zhì)編碼基因組作為背景參數(shù)。通過“ggplot”和“dplyr”R包生成氣泡圖。（-log10）值＞1.3被認為富集到有意義的信號通路。

原因何在？我們可以從平頂山環(huán)境污染防治攻堅戰(zhàn)領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室印發(fā)的一份通知中得到答案。該通知針對改善空氣質(zhì)量共提出了25項重點任務(wù)，其中涉及“科學(xué)規(guī)劃營運加油站點”：要求6月底前，市內(nèi)四個國控空氣質(zhì)量自動監(jiān)測站點周邊2公里范圍內(nèi)營運加油站完成選址搬遷……搬遷前，即日起范圍內(nèi)加油站營業(yè)時間改為每日19時至次日8時。

腫瘤大標(biāo)本實質(zhì)部分切面形態(tài)為魚肉狀，顏色呈灰白色，質(zhì)地脆弱，瘤內(nèi)存在壞死囊變、出血等表現(xiàn)。腫瘤與網(wǎng)膜、腸系膜、腹壁、膀胱發(fā)生粘連的患者有3例；壞死腫塊與腸道相通伴發(fā)感染的有1例。爛魚肉狀是患者腫瘤組織主要形態(tài)，腫瘤內(nèi)壞死除可抽出暗紅色血液。延遲掃描表現(xiàn)為大部分強化的1例患者腫瘤動脈期周邊見不規(guī)則環(huán)形與結(jié)節(jié)狀強化。CT診斷提示腫瘤壞死，病理標(biāo)本顯示未發(fā)生腫瘤壞死。

1.2.4 基因集富集分析（GSEA）分析 TCGA-LAML數(shù)據(jù)集基于LTB4R 表達中位數(shù)分為兩組，采用R 包“DESeq2”篩選差異基因。對所有差異基因進行GSEA功能富集分析，＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25認為富集到有意義的信號通路。

目前AML患者的風(fēng)險分層策略包括臨床病理特征、染色體和基因異常。我們利用R studio和UALCAN平臺研究了LTB4R表達水平與AML臨床資料之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在M0、M1、M4、M5亞組中，LTB4R表達水平增強，在M2、M3或t（15;17）、t（8;21）組LTB4R表達水平降低，這與基于風(fēng)險分層的預(yù)后結(jié)果一致。LTB4R表達水平與FLT3突變、IDH、RAS突變未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，可能與樣本量過小有關(guān)。以上結(jié)果提示LTB4R可以作為特定AML亞組，尤其是M0、M1、M4、M5的風(fēng)險評估指標(biāo)，并顯示出與當(dāng)前風(fēng)險分層策略的協(xié)同性。

1.2.5 實時熒光定量PCR Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，Trizol法提取總RNA，使用ReverTra Ace qPCR RT kit 獲得互補cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒在ABI QuantStudio 5PCR儀上進行PCR擴增。設(shè)陰性對照2復(fù)孔，每個樣本設(shè)2個復(fù)孔，內(nèi)對照為1×ROX，PCR循環(huán)條件如下：預(yù)變性95 ℃60 s，40個循環(huán)95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃45 s。mRNA表達水平半定量計算公式為2。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）分別設(shè)空白孔、標(biāo)準孔、待測樣品孔。每孔加50 μL樣本（血清1∶5稀釋）。用酶標(biāo)儀測定吸光度（），通過標(biāo)準曲線計算樣品中人白三烯B4 受體(LTB4R)濃度。每孔讀取3次取平均值。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 基因表達TPM（每千堿基百萬讀數(shù)的轉(zhuǎn)錄本）格式的RNAseq 數(shù)據(jù)通過UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）中的Toil 流程進行處理。定量數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位距表示（mean±IQR）。Mann-Whitney U檢驗用于評估兩個獨立樣本中l(wèi)og2（TPM+1）水平的差異。散點圖是通過R studio（3.6.3）中的“ggplot2”R 包繪制。生存分析值和風(fēng)險系數(shù)（HR）由單因素Cox風(fēng)險回歸和對數(shù)秩檢驗生成。臨床資料基線分析將數(shù)據(jù)集TCGA-LAML（=140）基于LTB4R表達水平的中值作為臨界值分為高表達組和低表達組，基因表達與臨床特征之間的關(guān)系采用Chi-square 檢驗，Wilcoxon rank sum檢驗或Fisher精確檢驗。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示，兩組間比較采用Student檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。使用R studio 3.6.3和Excel軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析和可視化。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LTB4R mRNA在AML患者中的表達水平及預(yù)后價值

TCGA-LAML數(shù)據(jù)集基于LTB4R表達水平分為兩組，應(yīng)用R語言篩選出313個差異基因（或lncRNA）（|log2FoldChange|＞2，＜0.05），火山圖（圖7A）顯示其中58個紅色散點為表達上調(diào)基因，255個藍色散點為表達下調(diào)基因，Top5代表基因為：SLC10A2、HMX3、KCNN2、LINC00482、LAMP5-AS1、PDPN、AL117190.1、MEG9、RASL12、MEG8，其余基因以灰色散點表示。繼而針對總差異基因進行GSEA功能富集分析，結(jié)果如圖7B顯示，基于LTB4R的差異基因富集于CD4+αβT細胞分化、αβT細胞活化，免疫相關(guān)的T細胞活化、II型免疫反應(yīng)、免疫遞呈突觸、TNF受體綁定、IL-2/STAT5、TGF-β信號途徑。

2.2 LTB4R可作為AML 的獨立預(yù)后指標(biāo)

1970～80 年代沿用的急性髓系白血病FAB 分型（M0-M7）主要基于形態(tài)學(xué)和細胞化學(xué)染色。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，世界衛(wèi)生組織（WHO）分類標(biāo)準納入了一系列與癌基因、抑癌基因、細胞功能相關(guān)的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常，如t（15;17）（q22;q12）、PML-RARα、t（8;21）（q22;q22）、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD突變和NPM1突變。目前臨床上采用這些細胞遺傳學(xué)異常與臨床特征做為風(fēng)險分層指標(biāo)。為研究LTB4R是否能輔助AML疾病風(fēng)險分層，取LTB4R表達水平中位數(shù)為介值，結(jié)合各項臨床指標(biāo)將TCGA-LAML 隊列分組進行相關(guān)性分析，表1顯示LTB4R過表達水平與細胞遺傳學(xué)風(fēng)險（＜0.001）、FAB分型（＜0.001）、染色體異常（＜0.001）和NPM1突變（=0.023）相關(guān)。LTB4R低表達組的重現(xiàn)性細胞遺傳學(xué)異常具有更好的臨床預(yù)后，例如全部t（15;17）（11/11，100%）和t（8;21）（7/7，100%）患者均為LTB4R低表達。LTB4R 表達水平在FAB 各亞型中顯示出不同的分布特征，M1（22/35,62.9%）、M4（18/29，62.1%）和M5（13/15，86.7%）患者LTB4R表達更高，相反，大多數(shù)M2（60.5%）和M3（急性早幼粒細胞白血病，APL，80.0%）呈LTB4R低表達。另一方面，利用UALCAN 平臺分析了不同F(xiàn)AB 分型、年齡、性別、FLT3 突變、PML/RAR 融合和RAS 激活狀態(tài)亞組的LTB4R表達水平（圖3）。柱狀圖顯示，M3 占AML 的9%～12%，與M3 相比，M0、M1、M2、M4 和M5 中LTB4R表達水平升高（＜0.001，圖3A）。LTB4R在其他亞組之間未顯示明顯差異（圖3B～F）。

2.3 LTB4R表達水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

多種臨床特征如年齡、白細胞計數(shù)、原始細胞百分比和細胞遺傳學(xué)異常，都可能會影響AML 患者的預(yù)后。既往有多項基于全基因測序的AML預(yù)后相關(guān)變量的篩選研究，F(xiàn)HL1、HOPX、HMGA2 和FAM124B被證實為預(yù)后候選基因。本研究在此基礎(chǔ)上運用單因素和多因素Cox 風(fēng)險回歸分析，以確定LTB4R是否可作為AML OS 獨立預(yù)后因子。聯(lián)合LTB4R納入分析的變量包括年齡（≥60 歲）、外周血白細胞計數(shù)和原始細胞百分比、常見細胞遺傳學(xué)異?；蛑委煱悬c（FLT3 突變、DNMT3A 突變和TP53 突變）、預(yù)后基因指標(biāo)（HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B）（圖2）。圖2A森林圖顯示年齡、FAB分型、細胞遺傳學(xué)風(fēng)險、LTB4R（HR=1.825；95%：1.188-2.802；=0.006）、FHL1、HOPX、FAM124B均表現(xiàn)出風(fēng)險預(yù)測價值，多因素分析則證實LTB4R、年齡和FAM124B 為獨立預(yù)后風(fēng)險因子，其中LTB4R 顯示出較強的獨立風(fēng)險預(yù)測價值（=0.019，HR=1.864，95%：1.107-3.136，圖2B）。

2.4 LTB4R共表達基因篩選及功能富集分析

1.2.2 單因素和多因素Cox 回歸分析 采用Cox 回歸分析來篩選TCGA-LAML 隊列（=140）中的預(yù)后候選基因。使用“survival”、“survminer”、“forestplot”R 包繪制森林圖。年齡、細胞遺傳風(fēng)險和基因突變被視為分類變量，而白細胞計數(shù)和原始細胞百分比視為連續(xù)變量。采用每個基因的表達水平中位數(shù)為介值分組。

2.5 基于LTB4R的差異基因篩選及GSEA分析

利用R studio 分析TCGA數(shù)據(jù)庫來源的泛癌組織中LTB4R 基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖1A）。散點圖顯示AML患者骨髓樣本（TCGA-LAML，=173）中LTB4R轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常組織（GTEx，=70）（4.898±1.2202.252±0.215，＜0.001）。我們對基因表達數(shù)據(jù)和生存期進行了單變量Cox 比例風(fēng)險回歸分析篩選出TCGALAML 數(shù)據(jù)集（=140）中2563 個預(yù)后相關(guān)基因（Cox＜0.01），其中LTB4R mRNA高表達與總生存期（OS）顯著相關(guān)（HR=1.42，95%：1.13-1.79；Cox=0.003）。隨后利用R studio（圖1B）和PrognoScan平臺（圖1C）不同數(shù)據(jù)處理算法評估LTB4R基因在AML患者中的預(yù)后價值。Kaplan-Meier（KM）曲線圖顯示在TCGALAML數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)清洗后=140）中LTB4R 異常表達與總生存期（OS）相關(guān)（HR=1.74，95%：1.14-2.67；=0.011），LTB4R高表達組的中位生存時間為11.2月，低表達組為27.4月。LTB4R 的預(yù)后價值用PrognoScan平臺進行了驗證，Cox風(fēng)險回歸分析顯示在細胞遺傳學(xué)正常的AML 數(shù)據(jù)集GSE12417[（AMLCG（2004），=79，HR=1.72，95%：1.06-2.77；=0.027，圖1C]中LTB4R過表達是OS 的危險因素。利用時間操作特征(TimeROC)分析確定預(yù)測準確性。曲線下面積（AUC）分別為1 年AUC=0.613、3 年AUC=0.675、5 年AUC=0.748（圖1D）。

2.6 臨床實驗驗證LTB4R、免疫檢查點基因表達水平及相關(guān)性

1.2.1 生存分析 通過數(shù)據(jù)清洗納入了TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中140名具有高通量測序（RNA-Seq）和完整預(yù)后信息的AML 患者。生存分析結(jié)果由Kaplan-Meier曲線顯示。TimeROC（v 0.4）分析用以比較單個基因或基因組的預(yù)測特異性及靈敏性。以上利用R 包“survival”、“survminer”、“pROC”和“ggplot2”分析繪圖。

3 討論

我國白血病發(fā)病率約為3～4/10萬，其中AML占1.62/10萬，目前病因尚不完全清楚，已知的有病毒感染、免疫功能異常、物理、化學(xué)、遺傳因素等。除M3外，其他類型的AML治療手段以化療和造血干細胞移植為主，5年死亡率達50%。以腫瘤疫苗、細胞治療和細胞信號通路調(diào)節(jié)劑為代表的選擇性免疫治療和分子靶向治療是新興的治療措施，而個體化的治療方案要求全面檢查各種預(yù)后分層相關(guān)的預(yù)后指標(biāo)。迄今，臨床和科研工作者篩選了大量新型的AML生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用多種生物信息學(xué)分析工具，借助公共數(shù)據(jù)庫平臺，試圖篩選更簡單、有效的預(yù)后指標(biāo)。前期我們已通過Cox風(fēng)險回歸分析篩選出多個預(yù)后基因，如RHOBTB2、FHL1、HIVEP3、ARHGAP9和PSMB8，這些基因的潛在功能和預(yù)后價值有待驗證。本項研究中，我們探討了LTB4R基因在AML中的表達譜和預(yù)后意義。

TCGA泛癌數(shù)據(jù)集基因表達分析顯示AML患者骨髓組織中LTB4R轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并且在泛癌組織中表達水平差異明顯，呈現(xiàn)出器官特異性。急性髓系白血病患者骨髓樣本中白血病細胞的比例為20%～100%，這可能決定基因表達水平的分布情況。急性髓系白血病患者骨髓中LTB4R異常表達促使我們進一步探索其是否具有預(yù)后價值。

我們利用R studio 和PrognoScan 在兩個不同的AML數(shù)據(jù)集中分析并驗證了LTB4R基因?qū)ML患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示LTB4R過表達與AML患者的不良預(yù)后相關(guān)。TimeROC分析顯示LTB4R的AUC大于0.6，尤其是5年AUC=0.748，顯示出較強的預(yù)后評估性能。我們前期收集了一組與AML預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險因素，包括年齡、白細胞計數(shù)、原始細胞比例、重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常等，均納入Cox風(fēng)險回歸分析，多因素回歸結(jié)果證實LTB4R是AML不良預(yù)后的獨立預(yù)測基因。

基于“調(diào)整結(jié)構(gòu)、補齊短板、提升質(zhì)量”，推進供給側(cè)改革，以精準扶貧為核心，“輸血”與“造血”相結(jié)合，從目標(biāo)層、戰(zhàn)略層和路徑層提出供給側(cè)改革視角下精準扶貧優(yōu)化路徑，對接扶貧資源供需，確保貧困地區(qū)精準脫貧，見圖4。

LTB4R屬于G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族，特異性表達于白細胞，在胰腺癌、表皮腫瘤、結(jié)腸癌中的表達水平異常，并可發(fā)揮調(diào)控免疫微環(huán)境、促進腫瘤增殖和侵襲的功能生物學(xué)功能。然而，LTB4R能否以及如何調(diào)控腫瘤免疫并影響白血病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。

現(xiàn)金流折現(xiàn)模型的公式表述如下：P0=(E0CF1)/(1 +R)+(E0CF2)/(1 +R)2+...(延續(xù)到無限期)，其中P0代表某一企業(yè)、資產(chǎn)或工程的現(xiàn)值(當(dāng)前價值)，E0CFn代表當(dāng)前預(yù)測的未來第n期產(chǎn)生的自由現(xiàn)金流，R代表自由現(xiàn)金流的折現(xiàn)率。自由現(xiàn)金流貼現(xiàn)(DCF)模型是一種重要的公司估值方法，其定義為公司的價值等于公司在其剩余的生命周期中能夠提供的自由現(xiàn)金流的現(xiàn)值之和。

蕭飛羽左腕上的鋼環(huán)轉(zhuǎn)動得越來越快，顯然是否接受天問大師的賭約他一時難以取舍。當(dāng)他終于按住轉(zhuǎn)動的鋼環(huán)，目光卻落在武成龍身上。武成龍似乎知道他企圖進一步確定什么急忙傳音：“語出無悔，承諾是金，天問大師和紫陽道長口碑更勝只手拿云。只是除了黑白雙煞實力不為屬下所知，其他人應(yīng)戰(zhàn)會有違三少收服天問大師和紫陽道長的初衷?！?/p>

為進一步探索LTB4R在AML腫瘤發(fā)生發(fā)展中的潛在功能，我們首先通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫篩選出LTB4R共表達基因集合，包含多個免疫微環(huán)境、EMT轉(zhuǎn)化、DNA損傷修復(fù)和能量代謝相關(guān)基因，反映了LTB4R對疾病調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)的重要影響。運用GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些共表達基因富集到數(shù)條腫瘤相關(guān)的功能和信號通路，涉及免疫細胞分化、活化、吞噬功能和能量代謝。其次，我們基于LTB4R 表達水平將TCGA-LAML分組篩選出差異基因集合，GSEA分析顯示這些差異基因功能主要富集到免疫細胞活化、分化，信號傳導(dǎo)，免疫遞呈，免疫反應(yīng)，細胞因子信號通路。再次，通過與24種免疫細胞標(biāo)志的相關(guān)性研究我們發(fā)現(xiàn)LTB4R 與腫瘤免疫浸潤呈顯著相關(guān)性。最后，通過STRING平臺構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)揭示了在AML腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與LTB4R功能密切相關(guān)的15個功能蛋白。以上結(jié)果顯示LTB4R介導(dǎo)的信號通路與免疫微環(huán)境、能量代謝之間可能存在協(xié)同或交互作用。臨床實驗驗證了生信分析的結(jié)論，LTB4R在AML患者中表達水平增高，并且與免疫檢查點基因HAVCR2呈顯著正相關(guān)，而受到樣本量的影響，LTB4R與PDCD1表達相關(guān)性分析未顯示統(tǒng)計學(xué)意義，擴增結(jié)果顯示PDCD1擴增曲線CT值均在32左右，表明該基因在樣本中表達量均較低，可能會掩蓋組間表達差異，考慮下一步擴大樣本量繼續(xù)驗證。

單項血清腫瘤標(biāo)記物的靈敏度和特異度并不高，而聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別達到了83.33%和97.50%。如下表2所示。

綜上所述，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫綜合分析了LTB4R在AML患者的特異性表達模式，評估了預(yù)后價值和臨床特征相關(guān)性，進一步預(yù)測了其潛在功能，同時收集臨床樣本進行了實驗驗證。目前臨床上采用的AML分型標(biāo)準主要是FAB分型和WHO分型，前者主要基于形態(tài)學(xué)改變，后者側(cè)重重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常。除M3 外，其他AML 分型的治療方案區(qū)別不大，F(xiàn)LT3、IDH、NPM1的預(yù)后價值尚待進一步證實，靶向藥物臨床研究并未顯示出患者顯著獲益。因此現(xiàn)有的AML臨床預(yù)后風(fēng)險評估策略尚需進一步優(yōu)化。

LTB4R表達水平在AML患者，特別是在預(yù)后不良的高危亞組中顯著升高，可作為腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后因素之一。TimeROC實驗驗證了LTB4R預(yù)后預(yù)測的特異性和靈敏性。多因素COX回歸分析研究也證實納入臨床上現(xiàn)有的風(fēng)險因素和預(yù)后指標(biāo)，包括年齡、分型、細胞遺傳學(xué)異常和預(yù)后基因后，LTB4R也是一個有效的獨立預(yù)后基因。LTB4R可輔助臨床進行AML疾病風(fēng)險分層，并可能參與或協(xié)同腫瘤免疫、能量代謝等信號通路，在白血病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

臨床實驗驗證選取了白血病原始細胞≥20%或＞2000/μL的AML外周血樣本，可與TCGA、GEO數(shù)據(jù)集分析的結(jié)果相互驗證、互為補充，有利于收集患者綜合診斷和預(yù)后評估信息，受限于經(jīng)濟原因，并不是所有AML患者都能接受二代測序檢查，本文證實LTB4R可采用外周血單個核細胞標(biāo)本檢測mRNA水平，外周血清/血漿檢測蛋白水平，標(biāo)本易于獲得，臨床實驗室大多配備了分子診斷平臺和免疫學(xué)實驗流水線，有望開發(fā)檢測試劑盒，便于臨床應(yīng)用。