Leptin對缺氧狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外增殖和分化的影響

視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（RPCs）神經(jīng)發(fā)生和保護(hù)的研究是發(fā)展眼部干細(xì)胞替代治療的基礎(chǔ)。研究表明，成人眼部保留的RPCs 可持續(xù)不斷的分化為成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。體外培養(yǎng)的RPCs可整合入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜功能的作用。RPCs不僅可改善修復(fù)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷，還具有傳遞和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子作用。缺氧是多種視網(wǎng)膜退行性變的主要病理機(jī)制，氧濃度變化是干細(xì)胞活性的主要調(diào)節(jié)因子。因此，促進(jìn)缺氧狀態(tài)下RPCs神經(jīng)發(fā)生或保護(hù)自體RPCs活性有利于視神經(jīng)損傷修復(fù)，也是眼科疾病研究熱點(diǎn)之一。

有研究表明,銀杏外果皮多糖具有提高免疫力、清除自由基、抗衰老、抗炎及抗腫瘤作用[11-15],銀杏外果皮內(nèi)所含酚酸類化合物具有抗腫瘤活性[9-10],銀杏外果皮提取物亦具有抑制真菌生長的活性[16-17]。鑒于溶劑冷浸法所得銀杏外果皮富含酚類化合物,筆者對其體外抗氧化活性進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果表明,銀杏外果皮揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基均顯示出一定的清除活性,但明顯弱于陽性對照維生素C,這是首次測定了銀杏外果皮揮發(fā)油成分的體外抗氧化活性。該研究結(jié)果為銀杏外果皮的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

PTEN信號在中樞神經(jīng)損傷后干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮必要作用。在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中，PTEN不僅能夠調(diào)控神經(jīng)元的軸突伸長，而且與神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化有著密切聯(lián)系。RPCs具有干細(xì)胞特性，因此PTEN蛋白也是研究RPCs活性的重要分子。Leptin為16-kDa的多功能細(xì)胞因子，在許多中樞神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)的作用。而目前Leptin在眼部的作用尚無定論，2型糖尿病患者合并糖尿病神經(jīng)病變時血清中Leptin水平升高，合并微血管并發(fā)癥時玻璃體腔Leptin水平升高。視網(wǎng)膜視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，Leptin對缺氧狀態(tài)下RPCs活性的影響及其機(jī)制，迄今為止，尚未見系統(tǒng)性研究報(bào)道。

本研究擬使用Leptin作用于缺氧培養(yǎng)RPCs，探討Leptin對細(xì)胞增殖、分化的影響及細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)的變化，為通過藥物或基因干預(yù)保護(hù)視網(wǎng)膜干細(xì)胞提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

神經(jīng)干細(xì)胞特異性培養(yǎng)基，含DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco）、B27 supplement（Gibco）、N2 supplement（Gibco）、bFGF（Gibco）、EGF（Gibco）、肝素溶液（Sigma）、penicillin-streptomycin（Gibco），TrypLEExpress（Gibco），Recombinant rat leptin (R&D Systems,Minneapolis），多聚賴氨酸（Sigma），Rabbit monoclonal anti-PTEN 抗體（Abcam），Mouse monoclonal anti-βactin（Abcam），Goat antibody to rabbit lgG-HRP（Abcam），Goat antibody to mouse lgG-HRP（Abcam），Rabbit monoclonal anti-β-III Tubulin 抗 體（CST），Mouse anti-Thy1.1 monoclonal antibody（Millipore），Mouse anti-GFAP monoclonal antibody（Millipore），Cy3-conjugated anti-rabbit IgG（康為世紀(jì)生物公司），Cy3-Goat-conjugated anti-mouse IgG（康為世紀(jì)生物公司），CCK-8（上海七海復(fù)泰生物公司），5%FBS（Gibco），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（西安晶彩生物公司），GBOX-HR全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（Syngene）。

1.2 方法

Western blot法檢測3 nmol/L Leptin作用缺氧狀態(tài)下RPCs 48 h后，RPCs中PTEN蛋白相對表達(dá)量，結(jié)果顯示：缺氧培養(yǎng)下3 nmol/L Leptin 作用RPCs細(xì)胞48 h，PTEN蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，各組PTEN蛋白相對表達(dá)量分別為：Control組1.062±0.046、Hypoxia組0.841±0.060、Hypoxia+Leptin組0.573±0.072；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖5）。

CCK-8法檢測Leptin對缺氧培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖活性的作用（圖2），結(jié)果表明，低濃度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用12 h后，Hypoxia+Leptin組RPCs細(xì)胞增殖活性較對照組增強(qiáng)，高濃度Leptin（10 nmol/L、30 nmol/L）組細(xì)胞增殖活性減弱（=23.554，＜0.05），而Hypoxia+0 nmol/L Leptin與Control組在12 h時，細(xì)胞增殖活性未見明顯差異（＞0.05）。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，低于3.0 nmol/L Leptin 組，RPCs 細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，隨Leptin 濃度增高呈遞增趨勢，高濃度10 nmol/L、30 nmol/L Leptin組細(xì)胞增殖活性減弱（=88.756，＜0.05）；其中，1.0 nmol/L、3.0 nmol/L Leptin組細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，兩者之前無明顯差異（＞0.05）。各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h，低于3.0 nmol/L Leptin組細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步增強(qiáng)，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graph Pad Prism v5.0軟件作圖。計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。各組總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)。當(dāng)＜0.05時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

許沁的一番舌戰(zhàn)，輕而易舉地把不當(dāng)?shù)美駴Q了。甚至玉敏都覺得，許沁說得有道理，誰都沒有不當(dāng)?shù)美２贿^楊律師堅(jiān)持說，無論你和你朋友，只是不知情而已。但我的當(dāng)事人告知你了，你便知情了，你有義務(wù)告知你朋友。在你和你朋友知道或者應(yīng)當(dāng)知道的情況下，都有義務(wù)歸還物品，或補(bǔ)差價。

1.2.4 Western blot法檢測Leptin對RPCs中PTEN表達(dá)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)鑒定1 d后，進(jìn)入下列實(shí)驗(yàn)組：Control組，Hypoxia組，Hypoxia+Leptin組，其中Leptin濃度為3.0 nmol/L。以上條件下培養(yǎng)48 h后，分別提取細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳：將配好膠的玻璃板固定在電泳槽中，加入電泳緩沖液。用微量加樣器將樣品緩慢注入加樣孔中，每孔10 μL。80 V電泳40～50 min，120 V電泳90～120 min。蛋白轉(zhuǎn)膜：將PVDF膜和凝膠置于半干轉(zhuǎn)儀中央，轉(zhuǎn)印90 min。將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜置于含有5%脫脂奶粉封閉液的孵育盒中，室溫條件下，在搖床上孵育1 h。將膜放入雜交袋中，加入相應(yīng)一抗PTEN（1∶1000）、β-actin（1∶1000），（用5%脫脂奶粉封閉液稀釋），封閉雜交袋，室溫下輕搖孵育1 h后4 ℃孵育過夜。TBST將膜漂洗3×15 min。加入HRP標(biāo)記的抗兔/小鼠（相應(yīng)比例稀釋1∶5000～1∶100 000）二抗，室溫孵育2 h。用TBST將膜漂洗3×15 min。ECL化學(xué)發(fā)光并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。用ImageJ 軟件對采集的Western blot結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算出條帶的積分光密度，進(jìn)行半定量分析。Western blot法檢測PTEN蛋白表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.2.3 免疫熒光染色法研究Leptin對RPCs分化的影響細(xì)胞培養(yǎng)鑒定1d后，進(jìn)入下列實(shí)驗(yàn)組：Control組，Hypoxia組，Hypoxia+Leptin組，其中Leptin濃度為3.0 nmol/L。以上條件下培養(yǎng)48 h后，各組細(xì)胞中的培養(yǎng)基由細(xì)胞生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為分化培養(yǎng)基（去除細(xì)胞因子EGF 及bFGF，增添5%FBS）將細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞密度為2.0×10/mL，24孔板中放置多聚賴氨酸包被的8 mm×8 mm 的細(xì)胞玻璃爬片，培養(yǎng)6 d。用4 ℃預(yù)冷的PBS（0.01 mol/L，pH7.4）漂洗細(xì)胞3 次，5 min/次。預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗3 次，5 min/次。0.3%TritonX-100孵育20 min，用PBS漂洗3次，5 min/次。正常山羊血清封閉非特異性抗原，常溫孵育2 h。采用PBS 稀釋的一抗（Rabbit monoclonal anti-β-III Tubulin抗體，Mouse anti-Thy1.1 monoclonal antibody，Mouse anti-GFAP monoclonal antibody，稀釋比1∶1000），室溫0.5 h后4 ℃冰箱過夜。取出復(fù)溫后，用PBS漂洗3遍，5 min/次。加入熒光素標(biāo)記的二抗（0.01 mol/L PBS 稀釋，Cy3-conjugated anti-rabbit IgG 稀釋比1∶500）室溫孵育2 h；PBS漂洗3次，3 min/次。加入DAPI（1∶1000稀釋，0.1 mg/mL），5 min。PBS漂洗3次，5 min/次。甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。采用正置熒光顯微鏡于10×下照相，每張細(xì)胞爬片至少隨機(jī)選取10個視野。對GFAP陽性細(xì)胞比例和β-tubulin III陽性細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究Leptin對RPCs分化的影響。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞

RPCs 起源于胚胎神經(jīng)外胚層，眼部發(fā)育過程中RPCs主要分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及Müller細(xì)胞。成人RPCs保留于眼部的幾種組織中，包括睫狀體邊緣區(qū)域、神經(jīng)視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮層及虹膜組織中。本次研究中使用神經(jīng)干細(xì)胞特異性培養(yǎng)基，依據(jù)本課題組已建立方法原代培養(yǎng)RPCs，免疫熒光法鑒定細(xì)胞Nestin及Pax6表達(dá)陽性，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示：本研究所培養(yǎng)的細(xì)胞為RPCs。缺氧是多種眼底疾病的病理機(jī)制，本研究中缺氧培養(yǎng)為1%O細(xì)胞培養(yǎng)箱6 h，與多種干細(xì)胞缺氧研究中實(shí)驗(yàn)條件一致，如其他在體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧的研究。在CCK-8結(jié)果示：缺氧刺激RPCs后，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h及48 h，RPCs細(xì)胞增殖活性較對照組細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，與本課題組前期研究結(jié)果一致，提示RPCs細(xì)胞對缺氧的耐受性較強(qiáng)。研究也顯示低于3%氧氣濃度條件下缺氧培養(yǎng)可提高人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖活性，其細(xì)胞中Ki67及CyclingD1表達(dá)增加，提示短時間缺氧狀態(tài)可激活RPCs增殖活性。

2.2 Leptin對缺氧培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖活性的作用

1.2.2 CCK-8 法檢測Leptin 對細(xì)胞增殖活性的影響RPCs細(xì)胞接種于96孔板中（細(xì)胞密度為5000/孔），在培養(yǎng)液中加入Leptin，Leptin 不同濃度（根據(jù)Jacob C.Garza等在腦神經(jīng)干細(xì)胞中的研究）分別作用RPCs細(xì)胞，分組如下：Control組、Hypoxia+0 nmol/L，0.3 nmol/L及1.0 nmol/L、3.0 nmol/L、10 nmol/L、30 nmol/L Leptin組。分別培養(yǎng)至12、24、48 h后，加入10μL CCK-8溶液，各組細(xì)胞在37 ℃下4 h。用酶標(biāo)儀測定吸光值。每組設(shè)置5個復(fù)孔取平均值，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

免疫熒光染色法檢測3 nmol/L Leptin作用缺氧培養(yǎng)狀態(tài)下RPCs 48 h后，細(xì)胞的分化情況，結(jié)果顯示：分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)下RPCs可分化為β-tubulin III陽性細(xì)胞（圖3A、C、E）和GFAP陽性細(xì)胞（圖3B、D、F）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：β-tubulin III 陽性細(xì)胞百分率：Control 組（34.60±4.65）%、Hypoxia組（38.10±5.32）%、Hypoxia+Leptin 組（38.30±4.47）%；GFAP 陽性細(xì)胞百分率：Control組（41.20±3.94）%、Hypoxia組（42.00±4.42）%、Hypoxia+Leptin 組（42.40±4.19）%。與Control 組及Hypoxia 組相比，Hypoxia+Leptin 組β-tubulin III 陽性細(xì)胞比例和GFAP陽性細(xì)胞比例均無顯著性差異（＞0.05，圖4）。

2.3 Leptin對缺氧培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的影響

3.會計(jì)行為主體方面。企業(yè)金融會計(jì)風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)生和企業(yè)會計(jì)從業(yè)人員的整體素質(zhì)有著緊密的關(guān)系，很多時候風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生的主要原因就是會計(jì)從業(yè)人員的自身素質(zhì)不夠，專業(yè)水平達(dá)不到要求，這也就使得金融會計(jì)行業(yè)整體水平的下滑，所以要從根本出發(fā)，從提高金融會計(jì)從業(yè)人員的自身素質(zhì)和專業(yè)技能抓起，營造出良好的會計(jì)工作環(huán)境，與此同時，企業(yè)對于會計(jì)這個崗位要進(jìn)行一定的考核，不管是自身道德素質(zhì)還是專業(yè)技能上，只有全面的考核才能提高會計(jì)從業(yè)人員的整體素質(zhì)。

上海老港綜合填埋場（以下簡稱“填埋場”）是老港固體廢棄物綜合利用基地其中1個填埋場，從2013年1月開始試運(yùn)營，管理逐步完善。為實(shí)現(xiàn)填埋場高標(biāo)準(zhǔn)、高效率、高水平的運(yùn)營管理，亟需對填埋場現(xiàn)存的一些問題進(jìn)行研究。以“合規(guī)、安全、可持續(xù)發(fā)展”的理念為核心，提出從安全、污染控制、作業(yè)工序3個方面保障填埋場作業(yè)，進(jìn)行配套輔助設(shè)施研究。旨在提高運(yùn)營管理效率，為填埋場的精細(xì)化管理提供科學(xué)技術(shù)支撐。

2.4 Leptin對各組視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)的影響

1.2.1 RPCs的培養(yǎng)及鑒定 依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期已建立方法原代培養(yǎng)及鑒定Sprague-Dawley大鼠（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，雙眼無眼疾）RPCs，無菌條件下，小心分離出生后1 d的乳鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜，剪切、吹打、過篩后獲得細(xì)胞懸液，采用神經(jīng)干細(xì)胞特異性培養(yǎng)基（含DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、B27 supplement、N2 supplement、bFGF、EGF、肝素溶液、penicillin-streptomycin），將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長特性。2～3 d神經(jīng)球形成，使用TrypLE?Select (Gibco)，于37 ℃下3 min，接種于6孔板，常規(guī)換液，觀察細(xì)胞形態(tài)。缺氧培養(yǎng)組細(xì)胞置于37 ℃，94%N2+5%CO+1%O培養(yǎng)箱中作用6 h，常氧培養(yǎng)組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO常規(guī)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，其中約含21%O。使用倒置相差顯微鏡（Leica DMI3000B,Leica Microsystems GmbH,Wetzlar）觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞鑒定方法同本課題組前期研究。動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批文號：2019-180）。

3 討論

原代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示：P0代RPCs為圓形懸浮生長，邊界清晰，胞漿透亮（圖1A），培養(yǎng)2 d后細(xì)胞聚集成神經(jīng)球（圖1B）。

脂肪細(xì)胞因子Leptin為由肥胖基因（ob gene）編碼的16 000脂肪因子，最初只知道其通過作用于下丘腦弓狀核發(fā)揮內(nèi)源性能量平衡調(diào)控功能，其特異性跨膜受體（LepR）廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，視網(wǎng)膜新生血管網(wǎng)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及色素上皮層中均可發(fā)現(xiàn)LepR。研究發(fā)現(xiàn)外源性Leptin可誘導(dǎo)腦中風(fēng)后神經(jīng)發(fā)生及血管生成，提高腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性，本研究設(shè)置了不同Leptin濃度及時間梯度，檢測細(xì)胞增殖活性變化，篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Leptin的最佳作用濃度及時間。CCK-8結(jié)果示：低濃度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用48 h后，Hypoxia組RPCs細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步增強(qiáng)，隨Leptin 濃度增高呈遞增趨勢，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，提示Leptin可進(jìn)一步促進(jìn)缺氧刺激后RPCs細(xì)胞增殖。此結(jié)果與在腦神經(jīng)干細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。而高濃度10 nmol/L，30 nmol/L Leptin作用48 h 細(xì)胞增殖活性減弱；觀察到細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)受到影響?？赡芤?yàn)楦邼舛萀eptin產(chǎn)生了細(xì)胞毒性或結(jié)合了其他非特異性受體，抵消了LepR的作用。因此，選用3.0 nmol/LLeptin濃度、48 h作用時間進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

β-微管蛋白III（β-tubulin III）是原始神經(jīng)上皮中表達(dá)最早的神經(jīng)元標(biāo)志物之一。膠質(zhì)纖維酸性蛋白是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的中間絲蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，3 nmol/LLeptin作用缺氧刺激后的RPCs 48 h，分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 d，β-tubulin III陽性細(xì)胞比例和膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細(xì)胞比例均無顯著性差異，提示3 nmol/L Leptin對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的分化無明顯影響。而研究發(fā)現(xiàn)Leptin（300 ng/mL）可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成脂細(xì)胞?？赡芘c視網(wǎng)膜祖細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性差異有關(guān)。

PTEN蛋白具有磷酸酯酶活性，可拮抗PI3K/AKT信號通路。在RPCs神經(jīng)發(fā)生過程中，PTEN可調(diào)控RPCs神經(jīng)發(fā)生與RPCs保存之間的動態(tài)平衡。下丘腦神經(jīng)元中，外源性Leptin可通過抑制PTEN促進(jìn)神經(jīng)元生長。因此，PTEN蛋白為調(diào)控干細(xì)胞內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的重要分子。本研究發(fā)現(xiàn)3 nmol/L Leptin作用于缺氧刺激下RPCs 48 h，RPCs細(xì)胞活性增強(qiáng)。PTEN蛋白是否為RPCs細(xì)胞中Leptin識別AKT信號過程中的重要節(jié)點(diǎn)，尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 nmol/L Leptin可抑制Hypoxia組RPCs中PTEN表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，Leptin是否通過解除PTEN對PI3K/AKT通路的抑制，增強(qiáng)RPCs增殖，將在后續(xù)研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

式(24)雖然消除了輔助參數(shù)但θ2中卻同時引入了另外的輔助參數(shù)ρ.顯然，θ2中ρ和x,y是相關(guān)的，因此式(24)的結(jié)果同樣并非最優(yōu).為此，在第3步中，利用θ2中輔助參數(shù)ρ與目標(biāo)位置x,y的約束關(guān)系來構(gòu)建方程，從而進(jìn)一步提高目標(biāo)位置的估計(jì)精度.考慮的估計(jì)誤差，則由ρ=x2+y2可得：

因此，本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度Leptin可促進(jìn)體外缺氧培養(yǎng)下大鼠RPCs增殖，抑制細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)，對細(xì)胞分化未見明顯影響，初步探討了Leptin 對RPCs神經(jīng)發(fā)生的作用，為通過藥物或基因操作干預(yù)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)視神經(jīng)損傷提供了新思路。