雷公藤甲素抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎癥和遷移：基于circRNA 0003353/JAK2/STAT3信號(hào)通路

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征，影響患者生活質(zhì)量。成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）的增殖過(guò)度、凋亡不足、炎性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，是導(dǎo)致RA 患者關(guān)節(jié)畸形、功能障礙重要因素之一。JAK2/STAT3是多種細(xì)胞生長(zhǎng)、活化、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3信號(hào)通路的異?；罨蓪?dǎo)致RA患者體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)升高，影響關(guān)節(jié)腔血管生成等。circRNAs是一類新型的RNA，在FLS遷移、分子信號(hào)通路、免疫炎癥反應(yīng)等方面具有調(diào)控作用。本團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)高通量測(cè)序及GO 分析研究，認(rèn)為circRNA 0003353是參與RA炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵circRNA。

本院RA住院患者多為疾病活動(dòng)期，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛而熱、屈伸不利，發(fā)熱、口渴、不欲飲、煩悶不安、小便黃等。雷公藤甲素（TPL）是環(huán)氧化二萜內(nèi)脂化合物，大多從雷公藤屬植物中提取而來(lái)，活性高，研究表明TPL能降低滑膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素（IL-6）的表達(dá)水平。但是RA患者體內(nèi)circRNA 0003353表達(dá)如何、炎癥指標(biāo)表達(dá)如何，以及TPL能否通過(guò)circRNA 0003353/JAK2/STAT3 改善RA-FLS 的炎癥及細(xì)胞遷移尚不明確。

本研究首先臨床觀察RA 患者體內(nèi)circRNA 0003353 及免疫炎癥指標(biāo)變化，再體外細(xì)胞培養(yǎng)，將circRNA 0003353過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLS細(xì)胞中，以最佳濃度TPL干預(yù)，觀察過(guò)表達(dá)circRNA 0003353狀態(tài)下，TPL對(duì)RA-FLS中JAK2/STAT3信號(hào)通路、細(xì)胞因子和細(xì)胞遷移的影響，從而推測(cè)TPL 能否通過(guò)circRNA 0003353/JAK2/STAT3影響RA炎癥反應(yīng)和細(xì)胞遷移，為TPL治療RA臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 基本資料

收集安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院RA患者（2021年3月～2021年9月）50例，30例正常人來(lái)自我院健康體檢中心。其中男性5例，女性45例，年齡57.32±10.85歲；30例正常人來(lái)自我院健康體檢中心，其中男性3例，女性27例，年齡53.28±16.03歲，兩組基本情況一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用肝素鈉抗凝管清晨空腹留取靜脈血4 mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80 ℃冰箱備用。本研究通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理編號(hào)：2019AH-12）。

研究會(huì)以為國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)體制改革服務(wù)為目標(biāo)，面向社會(huì)經(jīng)濟(jì)系統(tǒng)工程問(wèn)題，組織自然科學(xué)、工程技術(shù)工作者和哲學(xué)、社會(huì)科學(xué)工作者一道，創(chuàng)新和運(yùn)用定量與定性相結(jié)合、人腦與電腦相結(jié)合等系統(tǒng)工程理論、方法，形成了一批科研成果，為推動(dòng)政府、部門與企業(yè)決策的民主化、科學(xué)化、制度化提供智力支持，為科學(xué)決策貢獻(xiàn)了力量。

1.2 診斷及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

保管馬鈴薯要做好防病、防凍、防腐等項(xiàng)工作。做好田間的防病工作，及時(shí)拔除病株，噴灑藥劑，防止病害蔓延。種用馬鈴薯可適當(dāng)提早收獲，食用馬鈴薯不宜收獲過(guò)早，在大部分莖葉由黃綠變?yōu)榭菸?、薯塊發(fā)硬時(shí)開(kāi)始收獲，并抓緊在霜凍前收完。收獲后，在陰涼通風(fēng)處保管幾天，再裝入地窖長(zhǎng)期保管。裝窖時(shí)揀出損傷、蟲(chóng)咬或感染病害的薯塊。裝窖前禁止日曬，防止毒素增加。裝薯前一周打掃地窖，敞開(kāi)窖蓋，曬窖和散發(fā)窖內(nèi)濕氣。馬鈴薯裝窖時(shí)，不能裝滿。

教師要扮演好自己的角色，努力成為合格的學(xué)習(xí)督促者，教學(xué)改革的創(chuàng)新者。隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，教育的改革力度不斷加大，對(duì)于教師的要求也越來(lái)越高。但是教學(xué)的環(huán)境過(guò)于封閉，教師沒(méi)有更多的機(jī)會(huì)和外界進(jìn)行過(guò)多的接觸，所以教師的人生視野往往很容易被局限，慢慢的和學(xué)生之間的心理差距也越來(lái)越大。這種差距的出現(xiàn)，往往會(huì)使學(xué)生與教師在學(xué)習(xí)過(guò)程中很難產(chǎn)生共鳴，不利于教學(xué)質(zhì)量的提升。教師要敢于從實(shí)際生活中累積教學(xué)素材，多借鑒優(yōu)秀教師的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，在空閑時(shí)間教師也可以參加繼續(xù)教育等，只有不斷學(xué)習(xí)才能夠提升自身的個(gè)人素質(zhì)能力，拓寬個(gè)人的知識(shí)內(nèi)涵，為提升課堂教學(xué)有效性做好基礎(chǔ)的保障。

1.3 FLS的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

1.5.3 Western blot檢測(cè)p-JAK2，p-STAT3，JAK2，STAT3蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞樣本，加入RIPA 裂解液1 mL（內(nèi)含1 mmol/L PMSF）進(jìn)行裂解。離心10 min，收集上清液，在收集的蛋白樣品中按照1∶4 加入5×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜后，把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗，封閉。滴加p-JAK2（1∶1000）、p-STAT3（1∶1000）、JAK2（1∶1000）、STAT3（1∶1000）一抗，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜；洗滌后，滴加1∶20 000用二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。漂洗后用ECL發(fā)光試劑盒來(lái)檢測(cè)蛋白。

1.4 藥物、試劑與儀器

以上的模型只是總模型，該模型需要根據(jù)口譯的特點(diǎn)進(jìn)行修改。從模型本身所引出的研究問(wèn)題有：什么因素能夠促成學(xué)生的涌流體驗(yàn)？學(xué)生在的涌流體驗(yàn)是怎么樣的？涌流體驗(yàn)帶來(lái)怎樣的學(xué)習(xí)表現(xiàn)？通過(guò)研究這些問(wèn)題，旨在提升學(xué)生在學(xué)習(xí)口譯時(shí)的體驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)口譯的興趣。

選定地塊后，應(yīng)考慮土壤生態(tài)環(huán)境對(duì)黃芩生長(zhǎng)的影響，張向東等研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤緊實(shí)度增大，黃芩根系活力降低，加速植株衰老[25]；土壤中有重金屬元素累積時(shí)，黃芩中重金屬含量與土壤中重金屬含量成正比[26]。黃芩連作障礙來(lái)自于生長(zhǎng)年限延長(zhǎng)，土壤中真菌含量隨之增加，且根際真菌增長(zhǎng)幅度顯著高于非根基區(qū)域[27]，提高根腐病發(fā)病幾率[6]。

1.5.4 CCK-8檢測(cè)RA-FLS的細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種到96孔板中并培養(yǎng)24 h。然后在指定的時(shí)間點(diǎn)（第24、48、72 h）將CCK-8（10μL）裝載到每個(gè)孔上，然后在37 ℃下再次培養(yǎng)4 h。使用微孔板讀取器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測(cè)量值。根據(jù)值繪制細(xì)胞活力曲線。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

Western blot結(jié)果顯示3個(gè)不同序列HPV16 E6 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PRDM5表達(dá)上調(diào)見(jiàn)圖3。應(yīng)用Realtime-PCR檢測(cè)3個(gè)不同序列HPV16 E6 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HPV16 E6的表達(dá)水平，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)第3個(gè)HPV16 E6 shRNA3干擾HPV16 E6的表達(dá)比較穩(wěn)定，將這一質(zhì)粒留用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

熒光顯微鏡（Motic，BA410E）；普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司，K960）；熒光定量PCR 儀（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR）；酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司，RT-6000）。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 RT-qPCR 檢測(cè)circRNA 0003353 的表達(dá) Trizol提取各組RA-FLS總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32 凝膠圖像分析軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，以β-actin表達(dá)量為參照采用2進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5.2 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-17 收集各組RA-FLS培養(yǎng)上清液，1000 r/min離心10 min，棄去沉淀。將上清液加入酶標(biāo)板中（100 μL/孔），37 ℃孵育1.5 h，采用ELISA方法，嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

RA原代成纖維樣滑膜細(xì)胞經(jīng)SV40過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染而成的永生化細(xì)胞系。在青霉素（終濃度為100 U/mL）和鏈霉素（終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL）的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%CO、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%即可傳代。根據(jù)制造商的說(shuō)明，將pcDNA3.1-circRNA 0003353與其陰性對(duì)照用Li-pofectamine2000轉(zhuǎn)染至RA-FLS中，繼續(xù)孵育24 h。pcDNA3.1-circRNA 0003353與其陰性對(duì)照由上海GenePharma公司合成。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均采用2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)；納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷；均簽署知情同意書(shū)；一般資料齊全；排除標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)完全喪失功能者；合并有其他器官功能病變或免疫性疾?。蝗焉锘虿溉槠趮D女；觀察期間應(yīng)用免疫抑制劑和生物制劑者。

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；Fluoromount-G 熒光封片劑（SourthernBiotech）；Human IL-4/IL-6/IL-17 ELISA試劑盒（RX106128H/RX106126H/RX106160H，泉州市睿信生物科技有限公司）；JAK2/p-JAK2/STAT3/p-STAT3（ab39636/ab32101/ab68153/ab32143,Abcam）。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TNF-α組相比，TPL組RA-FLS 中circRNA 0003353 表達(dá)降低（＜0.05）；與TPL 組相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 組RA-FLS中circRNA 0003353表達(dá)升高（＜0.05），可逆轉(zhuǎn)TPL對(duì)RA-FLS作用（圖7）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較，符合正態(tài)性和方差齊性，則采用兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，反之，則采用秩和檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)。相關(guān)性分析中，符合正態(tài)性的連續(xù)變量數(shù)據(jù)采用Pearson分析，反之，則采用Spearman分析。＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TPL試劑購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司（編號(hào)B20709）。本團(tuán)隊(duì)前期用CCK-8檢測(cè)來(lái)評(píng)估不同濃度TPL處理RA-FLS活力，結(jié)果顯示，當(dāng)TPL濃度為10 ng/mL干預(yù)后，RA-FLS細(xì)胞活力降低至50%左右。因此，本文研究采用10 ng/mLTPL作為最佳濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 circRNA0003353在RA患者PBMCs中的表達(dá)升高

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，circRNA 0003353在RA患者PBMCs中表達(dá)升高（＜0.05）；ROC曲線結(jié)果顯示，circRNA 0003353 可以作為協(xié)助診斷RA 的分子標(biāo)志物（AUC=90.5%，＜0.001，95%:0.83-0.98）（圖1）。

2.2 circRNA 0003353與RA濕熱痹阻證患者炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA濕熱痹阻證患者circRNA 0003353 與ESR、RF、DAS28 呈正相關(guān)（＜0.05，圖2）。

2.3 TPL降低RA-FLS中circRNA0003353表達(dá)

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0、24、48、72 h，最佳濃度TPL降低RA-FLS中circRNA 0003353表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性（＜0.05，圖3）。

2.4 TPL抑制RA-FLS細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移能力

CCK-8 法檢測(cè)最佳濃度10 ng/mL TPL 處理RAFLS 24、48、72 h的活力。結(jié)果顯示，在24、48、72 h內(nèi)，TPL抑制RA-FLS的細(xì)胞活力（＜0.05），且呈時(shí)間依賴性；在48 h時(shí)，RA-FLS細(xì)胞活力為0.547，最接近50%（圖4A）。因此，選擇48 h為最佳作用時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步的研究。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)TNF-α刺激后，在24、48、72 h，RA-FLS 的細(xì)胞遷移數(shù)量增多，而TPL可以抑制RA-FLS的細(xì)胞遷移（＜0.05，圖4B、C）。

2.5 TPL升高RA-FLS抑炎細(xì)胞因子IL-4，降低促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-17

ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0、24、48、72 h，最佳濃度TPL升高RA-FLS抑炎細(xì)胞因子IL-4（0.05），降低促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-17，且呈時(shí)間依賴性（＜0.05，圖5）。

2.6 TPL降低RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)TNF-α刺激，RAFLS 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)升高（＜0.01），JAK2、STAT3 總蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（＜0.05）；最佳濃度TPL可降低TNF-α刺激后RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)（0.01），JAK2、STAT3總蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（＜0.05，圖6）。

2.7 轉(zhuǎn)染circRNA 0003353質(zhì)粒后，TPL降低RA-FLS中circRNA0003353表達(dá)

1.5.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RA-FLS 細(xì)胞遷移 將RAFLS細(xì)胞消化后，洗滌、重懸調(diào)整細(xì)胞密度至2×10/mL，取細(xì)胞懸液200μL至Transwell小室中，下室加趨化因子培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定、PBS洗滌后，加0.5%結(jié)晶紫染色20 min，擦去未遷移細(xì)胞。使用微孔板讀取器（Bio-Rad，Hercules,CA,USA）測(cè)量值。根據(jù)值繪制圖表。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.8 TPL通過(guò)circRNA 0003353抑制RA-FLS細(xì)胞活力和遷移能力

將circRNA 0003353 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLS中，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TPL可抑制RA-FLS細(xì)胞活力（＜0.05）；與TPL組相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353組RA-FLS細(xì)胞活力升高（＜0.05），可逆轉(zhuǎn)TPL對(duì)RAFLS作用（圖8A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPL可抑制RA-FLS細(xì)胞遷移能力（＜0.05）；與TPL組相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353組RA-FLS細(xì)胞遷移能力升高（＜0.05），可逆轉(zhuǎn)TPL對(duì)RA-FLS作用（圖8B、C）。

2.9 TPL通過(guò)circRNA 0003353升高RA-FLS抑炎細(xì)胞因子IL-4，降低促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-17

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TNF-α組相比，TPL組RAFLS中IL-4升高（＜0.05），IL-6、IL-17降低（＜0.05）；與TPL 組相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 組RA-FLS中IL-4降低（＜0.05），IL-6、IL-17升高（＜0.05），可逆轉(zhuǎn)TPL對(duì)RA-FLS作用（圖9）。

英國(guó)肉用家畜委員會(huì)下屬有25%以上的豬場(chǎng)應(yīng)用液體飼料飼喂。英國(guó)Wheyfeed有限公司每年向整個(gè)英國(guó)銷售運(yùn)輸超過(guò)20萬(wàn)噸液體副產(chǎn)品。荷蘭小麥淀粉、土豆皮、乳清粉和酵母濃縮蛋白質(zhì)等高水分副產(chǎn)品年產(chǎn)量約575萬(wàn)噸，不宜遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，主要用在豬飼料上。荷蘭約60%的規(guī)?；i場(chǎng)使用液體飼喂技術(shù)[2]。隨著乙醇工業(yè)的發(fā)展，加拿大安大略省約有20%的生長(zhǎng)育肥豬飼喂含玉米酒糟和濃縮浸出水溶物配制的液體飼料[3]。

2.10 TPL 通 過(guò)circRNA 0003353 降 低RA-FLS 中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TNF-α組相比，TPL組RA-FLS 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)升高（＜0.05），JAK2、STAT3總蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（＜0.05）；與TPL 組相比，pcDNA3.1-circRNA 0003353 組RA-FLS中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)升高（＜0.05），JAK2、STAT3 總蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化（＞0.05），p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值升高（＜0.05，圖10）。

軒轅明擺擺手，“誰(shuí)說(shuō)我們要自己帶啦？你們別忘了，每到一列山系的盡頭，我們都要用祭祀山神的方式和校長(zhǎng)互相傳遞信物啊！”

3 討論

RA患者主要以關(guān)節(jié)和周圍組織炎癥病變?yōu)橹?，骨質(zhì)破壞，甚至關(guān)節(jié)畸形的免疫性疾病，其中RA-FLS異常增殖、遷移、侵襲和炎癥反應(yīng)在RA進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。中藥材雷公藤具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效，可以有效緩解關(guān)節(jié)腫脹、晨僵等。其中TPL是從雷公藤中最主要的活性物質(zhì)，可以通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路，改善滑膜炎癥環(huán)境，調(diào)節(jié)骨代謝。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)circRNA 0003353與RA炎癥反應(yīng)相關(guān)，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)circRNA 0003353臨床研究較少，其與炎癥指標(biāo)是否存在調(diào)控作用及與TPL之間的影響尚未可知，故本文選擇circRNA 0003353、JAK2/STAT3組合，從炎癥和細(xì)胞遷移角度研究TPL對(duì)RA治療作用。

本文通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RA-PBMCs 中circRNA 0003353 表達(dá)上調(diào)，且與炎癥指標(biāo)ESR、RF、DAS28呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MK5-AS1在RA中表達(dá)上調(diào)，且與ESR、CRP、RF、anti-CCP呈正相關(guān)。circRNA 0088194在RA-FLS中表達(dá)上調(diào)，并與DAS28相關(guān)，這與本研究結(jié)果類似，lncRNAs和circRNAs同為非編碼RNA，都參與了RA發(fā)生發(fā)展，在RA患者中異常表達(dá)，且與炎癥指標(biāo)顯著相關(guān)，此外，本文還通過(guò)ROC 曲線計(jì)算得到AUC=90.53%，表明circRNA 0003353是RA的危險(xiǎn)因素，可以作為協(xié)助診斷RA的分子標(biāo)志物。故circRNA 0003353 可能通過(guò)調(diào)控ESR、RF、DAS28等炎癥指標(biāo)參與RA發(fā)病，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)TPL可以通過(guò)非編碼RNA干預(yù)RA-FLS，故本研究接下來(lái)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)構(gòu)建circRNA0003353過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLS中，探究其機(jī)制變化及TPL干預(yù)作用。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPL 呈時(shí)間依賴性抑制RAFLS中circRNA0003353表達(dá)、升高抑炎細(xì)胞因子IL-4，降低促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-17和細(xì)胞活力和遷移能力，研究表明TPL通過(guò)下調(diào)lncRNA ENST00000619282促進(jìn)RA-FLS的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。TPL對(duì)輔助T細(xì)胞增殖及其相關(guān)細(xì)胞因子具有抑制作用。這與本研究結(jié)果相同，TPL都可降低非編碼RNA的表達(dá)，且抑制FLS的炎癥反應(yīng)。且FLS細(xì)胞增殖、遷移能力與RA患者關(guān)節(jié)腫脹、形變相關(guān)，TPL可以抑制RA-FLS的遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外挽救實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染circRNA0003353過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，circRNA0003353可以逆轉(zhuǎn)TPL對(duì)免疫炎癥、細(xì)胞活力、遷移的抑制作用。JAK2/STAT3是多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)通路，參與RA炎癥反應(yīng)、增殖和凋亡。本研究通過(guò)檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)TPL 可通過(guò)circRNA 0003353 抑制p-JAK2、p-STAT3 表達(dá)，降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值。研究表明TPL通過(guò)lncRNARP11-83J16.1介導(dǎo)URI1和β-catenin 信號(hào)通路，降低RA-FLS 增殖、侵襲和炎癥。TPL可以通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)和FLS細(xì)胞增殖，這與本研究結(jié)果類似，TPL可以通過(guò)抑制非編碼RNA抑制炎癥信號(hào)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)。URI1和β-catenin與JAK2/STAT3信號(hào)通路都是RA經(jīng)典炎癥信號(hào)通路，可以影響RA疾病發(fā)展。

綜上所述，circRNA 0003353在RA患者中表達(dá)上調(diào)，與炎癥指標(biāo)存在相關(guān)性，TPL可通過(guò)調(diào)控circRNA 0003353，干預(yù)JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制RA-FLS炎癥反應(yīng)和細(xì)胞遷移，發(fā)揮治療RA作用。接下來(lái)我們將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究TPL在RA模型大鼠中是否存在對(duì)非編碼RNA和下游靶基因的調(diào)控作用。