細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的研究

摘要：以本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的產(chǎn)纖維素酶的細(xì)黃鏈霉菌作為出發(fā)菌株，對不同初始pH、不同碳源、不同氮源對纖維素酶的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶最高時(shí)的最適初始pH為7.2、最適碳源為1%羧甲基纖維素鈉和0.3%糖蜜、最適氮源為0.3% 硫酸銨和0.3%酵母浸膏，在此條件下纖維素酶的活力能達(dá)到8.10U/毫升。為今后將細(xì)黃鏈霉菌更好地開發(fā)成農(nóng)用微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：細(xì)黃鏈霉菌；纖維素酶；農(nóng)用

近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人口的迅猛增長，人們對糧食數(shù)量和質(zhì)量的要求也越來越高，農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物也隨之大量產(chǎn)生。目前，我國有機(jī)廢棄物的總排放量達(dá)到41.3～43.3×108噸/年。在大量生成的農(nóng)業(yè)廢棄物中，從有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分資源來講，占首位的是農(nóng)作物的秸稈。

農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢棄物，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年秸稈資源產(chǎn)出量約為10億噸。纖維素作為農(nóng)作物秸稈的主要成分，利用微生物對其進(jìn)行降解，能夠生成可被植物吸收利用的肥料，提高秸稈利用率的同時(shí)能夠很大程度地緩解環(huán)境污染，這已成為近年來的研究熱點(diǎn)。利于微生物降解纖維素已經(jīng)取得了一定的成果。

能分解纖維素的菌通?？煞譃榧?xì)菌、放線菌和真菌三大類。細(xì)菌以枯草芽孢桿菌為主，但是細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶大多為內(nèi)切酶，不易分泌到胞外，并且纖維素酶活性較低。放線菌和真菌等真核微生物所分泌的纖維素酶主要是胞外酶，—般對纖維素的降解效果好并且酶活力較高。

目前國內(nèi)對放線菌產(chǎn)纖維素酶的相關(guān)研究較少，本研究從實(shí)驗(yàn)室所保存的細(xì)黃鏈霉菌中選擇產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株，作為出發(fā)菌株，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化對產(chǎn)酶情況的影響進(jìn)行了研究，為其在實(shí)際中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces？microflavus002由微生物肥料技術(shù)研究推廣中心分離保藏。？

1.2 培養(yǎng)基

（1）纖維分解鑒定培養(yǎng)基：剛果紅纖維素培養(yǎng)基。

（2）種子培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，KNO3？0.1%，K2HPO4？0.05？%，MgSO4？0.05%，F(xiàn)eSO4？0.001%，NaCl？0.05？%，pH7.0～7.4。

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO4？0.5克，MgSO4·7H2O？ 0.25克，明膠2克，羧甲基纖維素2克，蒸餾水1000毫升，pH7.2。

（4）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC？ 10.0克，糖蜜3.0克，酵母浸膏3.0克，（NH4）2SO4？3.0克，KH2PO4？2.0克，MgSO4·7H2O？ 0.5克，pH7.2，蒸餾水1000毫升。

1.3 試驗(yàn)方法

種子培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)黃鏈霉菌在剛果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基進(jìn)行分離，29℃溫度下培養(yǎng)3～5天。選取透明圈較大的菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

將上面篩選出的菌種接種至高氏一號種子培養(yǎng)液（裝液量100毫升的500毫升三角瓶），29℃、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)36小時(shí)。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基？（裝液量200毫升的1000毫升三角瓶），30℃、200轉(zhuǎn)/分鐘發(fā)酵培養(yǎng)96小時(shí)。

菌株酶活的測定：

粗酶液的制備，取適量培養(yǎng)液，4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清即為粗酶液。

酶活力的測定，取粗酶液，加入含有50毫克羧甲基纖維素納（CMC）或50毫克濾紙、并且pH為4.4的緩沖液中，55℃保溫l小時(shí)或20分鐘，之后再加入二硝基水楊酸（DNS），置于沸水中保溫顯色10分鐘后，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)于波長為？550納米下測其OD值，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將每分鐘產(chǎn)生1微摩爾的葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位，以U表示。

發(fā)酵工藝優(yōu)化：

pH對纖維素酶活力的影響。將培養(yǎng)基初始pH調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種后于29℃、200轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)96小時(shí)，測定發(fā)酵液中纖維素酶的酶活。

碳源對纖維素酶活力的影響。將培養(yǎng)好的種子液接種于不同碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液中纖維素酶的酶活。

氮源對纖維素酶活力的影響。將培養(yǎng)好的種子液接種于不同氮源的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定細(xì)黃鏈霉菌發(fā)酵液中纖維素酶的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶的細(xì)黃鏈霉菌的培養(yǎng)

菌株在經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，選擇在剛果紅培養(yǎng)基上的透明圈較大的細(xì)黃鏈霉菌作為產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn)菌株。

2.2 纖維素酶活力的測定

根據(jù)1.3的方法測定纖維素酶的活力，其結(jié)果見圖1、圖2、？圖3。

以pH為橫坐標(biāo)、纖維素酶活力為縱坐標(biāo)作曲線。結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，初始pH為7.2時(shí)，細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的活力最高，達(dá)到6.68U/毫升，pH為7.0次之，隨著初始pH的升高酶活下降。

本試驗(yàn)在以1%的硫酸銨為氮源的前提下，對幾種常見碳源下產(chǎn)生的纖維素酶的活力進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，不同碳源對酶活的影響較大。當(dāng)羧甲基纖維素鈉（CMC）和糖蜜作碳源時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)第5天產(chǎn)纖維素酶的活力最高，可能因?yàn)樘敲壑泻心撤N微量元素利于菌體纖維素酶的產(chǎn)生；發(fā)酵培養(yǎng)第4天，CMC和葡萄糖作碳源下產(chǎn)纖維素酶的活力最高，可能是因?yàn)槠咸烟菫樗傩荚?，前期利于菌體的快速生長和纖維素酶的分泌；CMC作為碳源時(shí)，纖維素酶的活力最低。因此本試驗(yàn)中細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源為CMC和糖蜜。

在可溶性淀粉和糖蜜為碳源的情況下，對幾種常見氮源下所產(chǎn)生的纖維素酶的酶活進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，不同氮源對纖維素酶酶活的影響較大。當(dāng)硫酸銨和酵母浸膏作氮源時(shí)，產(chǎn)纖維素酶的活力最高，可能因?yàn)榻湍附嘀泻心撤N微量元素利于菌體纖維素酶的產(chǎn)生；而硫酸銨、豆餅粉等作為氮源時(shí)，產(chǎn)纖維素酶的活力相對較低。因此本研究中細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的最佳氮源為硫酸銨和酵母浸膏。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)黃鏈霉菌酶活較高的最適初始pH為7.2、最適碳源為1%的CMC和0.3%？糖蜜、最適氮源為0.3%？硫酸銨和0.3%？酵母浸膏，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)5天，纖維素酶的活力能達(dá)到8.10U/毫升。

本試驗(yàn)從初始pH、碳源、氮源3個(gè)方面對細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的情況進(jìn)行了研究，為今后利用細(xì)黃鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶提供了相關(guān)理論依據(jù)。由于細(xì)黃鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的活性較低，并且影響酶產(chǎn)生及酶活力的因素較多。因此篩選得到的試驗(yàn)菌株細(xì)黃鏈霉菌的產(chǎn)酶條件有待進(jìn)一步優(yōu)化。

作者簡介：申術(shù)霞（1989-），女，碩士研究生，中級工程師。主要從事微生物發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的研究。