基于IL-6/miR-155軸探討潰結(jié)寧膏穴位敷貼對脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的影響

陳凱，朱瑩，周牧之

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）主要臨床特征包括大便帶血、腹部疼痛，以及大便形狀、質(zhì)地等改變。腸黏膜損傷和潰瘍形成是UC常見病理表現(xiàn)，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸，也可延伸至降結(jié)腸甚至整個(gè)結(jié)腸[1]。UC在我國發(fā)病率逐年升高[2-3]，常用藥物有5-氨基水楊酸、激素、生物制劑及免疫調(diào)節(jié)劑，約一半患者服藥后癥狀有效緩解，但可能導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)，如嘔吐、貧血和全身水腫等。由于UC病因復(fù)雜、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，易伴發(fā)其他并發(fā)癥，已成為臨床亟需解決的難題。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體原因尚未完全明確。IL-6/miR-155軸在UC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，白細(xì)胞介素（IL）-6通過作用于下游信號(hào)因子促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3磷酸化，STAT3磷酸化入核后能誘導(dǎo)miR-155表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控UC炎癥反應(yīng)及Th17/Threg平衡[4-6]。潰結(jié)寧膏是朱瑩教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)，課題組運(yùn)用潰結(jié)寧膏穴位敷貼治療脾腎陽虛型UC臨床療效顯著[7]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，潰結(jié)寧膏能減輕UC大鼠及細(xì)胞模型炎癥反應(yīng)，降低腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1等促炎因子分泌[8-9]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，觀察潰結(jié)寧膏穴位敷貼對UC大鼠炎癥反應(yīng)及Th17/Threg平衡的影響，進(jìn)一步闡明其治療UC的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ZYFY20190814-1）。

1.2 藥物、試劑及儀器

潰結(jié)寧膏（由炮附子、延胡索、丁香、芥子、赤芍、細(xì)辛、生姜按1∶1∶1∶1∶1∶1∶2組成）、無藥物巴布劑基質(zhì)（由聚丙烯酸鈉、高嶺土、明膠、甘羥鋁、聚乙烯醇、蓖麻油、甘油組成），湖南省中醫(yī)院藥劑科提供。柳氮磺嘧啶（SASP）片，批號(hào)09190501，上海信誼天平藥業(yè)有限公司。番瀉葉，湖南然潤堂中藥有限公司。

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號(hào)2297，美國Sigma公司），腺嘌呤（批號(hào)A8626-25G，美國Sigma公司），大便隱血試劑（批號(hào)C027-1-1，珠海貝索生物技術(shù)有限公司），IL-8、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為I03050436、I0303471、I040347110，武漢華美生物工程有限公司），mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)CW2569，北京康為世紀(jì)），miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)CW2141，北京康為世紀(jì)），p-STAT3一抗（批號(hào)ab76315，英國Abcam），IL-6一抗（批號(hào)ab233706，英國Abcam），CD4-FITC抗體（批號(hào)11-0040-82，美國Invitrogen公司），IL-17A-PE抗體（批號(hào)12-7177-81，美國Invitrogen公司），Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）500×（批號(hào)00-4975-93，美國eBiosciences公司），人外周血淋巴細(xì)胞分離液（批號(hào)P8610，北京索萊寶公司），紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)C3702，北京索萊寶公司），CD25-PE抗體（批號(hào)17-0390-82，美國eBiosciences公司），F(xiàn)oxp3-APC抗體（批號(hào)12-5773-80，美國eBiosciences公司），β-actin抗體（批號(hào)66009-1-Ig，美國Proteintech），HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號(hào)SA00001-1，美國Proteintech），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)SA00001-2，美國Proteintech）。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)H1650R，湖南湘儀），多功能酶標(biāo)分析儀（型號(hào)MB-530，深圳匯松科技發(fā)展有限公司），全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（型號(hào)PW-812，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)DHP-500，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），熒光定量RCP儀（型號(hào)PIKOREAL96，美國Thermo），熒光PCR板（型號(hào)SPL0960，美國Thermo），搖床（型號(hào)TS-1，江蘇其林貝爾），電泳儀（型號(hào)DYY-6C，北京六一），電泳槽（型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一），轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)DYCZ-40D，北京六一），-80 ℃冰箱（型號(hào)DW-HW438，中國美菱）。

1.3 造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取12只大鼠正常喂養(yǎng)，剩余48只參照課題組前期方法[10]制備脾腎陽虛型UC大鼠模型，先予腺嘌呤10 mL/kg灌胃2周，第3周起用冰番瀉葉溶液10 mL/kg灌胃，連續(xù)2周，期間自由攝食飲水，每日灌胃30 min后將冰水噴至大鼠毛發(fā)，使肌肉等全身各處濕透，再用風(fēng)扇吹干。第29日大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，用石蠟油潤滑聚乙烯管后插入大鼠直腸，深度約8 cm，緩慢注入5%TNBS（100 mg/kg，加50%乙醇0.25 mL），提起大鼠尾巴倒置2 min。次日開始觀察大鼠一般狀況，隨機(jī)取模型組4只、空白組1只過量麻醉處死，驗(yàn)證造模效果。造模后大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯槁，體質(zhì)量降低，進(jìn)食減少，明顯黏液膿血便，肉眼可見結(jié)腸組織局部潰瘍、充血、糜爛，顯微鏡下可見中性粒細(xì)胞聚集，腺體排列紊亂，結(jié)合黏膜組織缺損提示造模成功。

1.4 分組及給藥

將正常喂養(yǎng)的11只大鼠作為空白組，44只成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、非穴位敷貼組、穴位敷貼組和SASP組，每組11只。取穴參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]，選擇“脾俞”“膈俞”“足三里”“大腸俞”“天樞”“腎俞”，模型組用無藥物巴布劑基質(zhì)敷貼穴位+生理鹽水灌胃，穴位敷貼組用潰結(jié)寧膏敷貼穴位+生理鹽水灌胃，非穴位敷貼組用潰結(jié)寧膏敷貼臀部肌肉豐厚處+生理鹽水灌胃，SASP組用無藥物巴布劑基質(zhì)敷貼穴位+SASP灌胃，兩側(cè)穴位交替進(jìn)行，1.5 h/次，1次/d，連續(xù)14 d。

1.5 取材

末次干預(yù)后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，血清保存于-20 ℃?zhèn)溆?。取血后脫頸處死大鼠，取距肛門6～10 cm結(jié)腸組織于多聚甲醛中固定，用于病理檢測，另取部分結(jié)腸組織于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 一般狀況及疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

觀察大鼠一般狀況（精神狀態(tài)、毛發(fā)、大小便等），干預(yù)結(jié)束后對大鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分，DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便隱血分?jǐn)?shù)）÷3。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.6.2 結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察及結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分

取病變部位結(jié)腸組織，于多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，60 ℃烤片12 h，切片脫蠟至水，蘇木精染色1～10 min，伊紅染色1～5 min，脫水，烤干，封片。顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化，并進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2[12]。

表2 CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.3 ELISA檢測

按試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品、洗液工作液、生物素標(biāo)記抗體工作液及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。將試劑在室溫平衡30 min，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔與待測樣品孔，加樣，棄液，加生物素標(biāo)記抗體工作液，棄液，加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，棄液，甩干，加底物，避光顯色，加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處光密度（OD值），根據(jù)樣品OD值計(jì)算血清IL-8、IL-17、IL-23含量。

1.6.4 RT-PCR檢測

用Trizol、異丙醇、三氯甲烷、乙醇提取結(jié)腸組織總RNA，紫光分光光度計(jì)測定波長260 nm與280 nm吸光度，計(jì)算RNA濃度和純度。配制反轉(zhuǎn)錄體系，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表3。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對表達(dá)量。

表3 各基因PCR引物序列

1.6.5 Western blot檢測

取結(jié)腸組織剪碎，加入RIRA裂解液，生物勻質(zhì)儀勻漿，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白濃度。制備15%分離膠及4.8%濃縮膠，蛋白樣品中加入loading buffer，煮沸，置于冰盒中備用。上樣，75 V電泳130 min，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉室溫封閉90 min。將膜與IL-6一抗（1∶750）、p-STAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000）于低溫孵育過夜。次日室溫放置30 min，加HRP-山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）、HRP-山羊抗兔IgG（1∶6 000）孵育60 min，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件分析蛋白相對灰度值。

1.6.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測

取抗凝全血，加入淋巴細(xì)胞分離液，800×g離心30 min，吸取白膜細(xì)胞層，400×g離心5 min，用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。按1∶500稀釋Cell Stimulation Cocktail（Plus protein transport inhibitors）后加入細(xì)胞懸液中，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。收集細(xì)胞，用1×Fixation/Permeabilization concentrate重懸細(xì)胞沉淀，避光固定破膜30 min，加入1×工作液，反復(fù)離心，PBS重懸細(xì)胞沉淀，加入CD4、IL-17A、CD25和Foxp3抗體孵育，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以-表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 潰結(jié)寧膏對模型大鼠一般狀況及疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響

干預(yù)過程中除空白組外，其余各組均有大鼠死亡，分別為模型組3只、穴位敷貼組1只、非穴位敷貼組2只、SASP組1只，死亡時(shí)間主要集中在造模后1個(gè)星期內(nèi)，考慮可能為結(jié)腸穿孔所致。

大鼠造模后精神狀態(tài)變差，攝食量減少，毛發(fā)逐漸稀薄、干枯，體質(zhì)量下降，形體消瘦，弓背蜷縮，喜扎堆，大便質(zhì)地稀薄，部分夾雜黏液膿血，小便清長。與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)潤澤，攝食量增加，體質(zhì)量上升，大便逐漸成形，黏液膿血便程度減輕。

與空白組比較，模型組大鼠DAI評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠DAI評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠DAI評(píng)分比較（-，分）

表4 各組大鼠DAI評(píng)分比較（-，分）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

DAI評(píng)分組別只數(shù)0 2.67±0.33*2.50±0.22 1.00±0.26#△0.83±0.31#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組6 6 6 6 6

2.2 潰結(jié)寧膏對模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠結(jié)腸組織表面光滑，呈淡粉白色，局部未見膨隆，結(jié)腸內(nèi)壁未見潰瘍、充血、水腫等表現(xiàn)；顯微鏡下腺體排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤，未見細(xì)胞變性及壞死。模型組和非穴位敷貼組大鼠結(jié)腸長度不同程度縮短、結(jié)腸周徑不一，局部可見紅腫膨脹，部分腸段質(zhì)地變硬，可見深淺不一的潰瘍，黏膜局部紅腫充血；顯微鏡下腺體排列紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞變性、壞死。穴位敷貼組和SASP組大鼠結(jié)腸長度有所增加，結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍明顯好轉(zhuǎn)，顯微鏡下腺體排列較前規(guī)則，細(xì)胞變性、壞死明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

與空白組比較，模型組大鼠CMDI評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠CMDI評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠CMDI評(píng)分比較（-，分）

表5 各組大鼠CMDI評(píng)分比較（-，分）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

CDMI評(píng)分0 2.83±0.31*2.67±0.21 1.33±0.22#△1.17±0.17#△組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組只數(shù)6 6 6 6 6

2.3 潰結(jié)寧膏對模型大鼠血清白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量明顯減少（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比較（-，pg/mL）

表6 各組大鼠血清IL-8、IL-17、IL-23含量比較（-，pg/mL）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

只數(shù)IL-23組別IL-8IL-17 0.88±0.02 3.93±0.08*3.74±0.26 1.39±0.12#△1.21±0.09#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組4 4 4 4 4 24.50±0.58 63.09±2.02*58.35±1.06 31.21±0.42#△28.43±2.43#△605.62±3.65 997.14±14.60*979.33±6.73 656.92±19.22#△645.71±16.22#△

2.4 潰結(jié)寧膏對模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23、miR-155、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達(dá)比較（-）

表7 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-23、miR-155、STAT3 mRNA表達(dá)比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

STAT3 0.99±0.15 4.73±0.52*4.08±0.33 1.45±0.12#△1.32±0.31#△組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組只數(shù)5 5 5 5 5 IL-6 0.47±0.08 2.45±0.15*2.00±0.14 0.88±0.18#△0.88±0.16#△IL-17 0.76±0.06 3.25±0.28*2.85±0.21 1.09±0.11#△1.11±0.07#△IL-23 0.66±0.10 3.85±0.18*3.65±0.19 1.15±0.15#△1.17±0.06#△miR-155 0.48±0.06 2.50±0.18*2.23±0.22 0.88±0.09#△0.93±0.12#△

2.5 潰結(jié)寧膏對模型大鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖2、表8。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白免疫印跡

表8 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（-）

表8 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

p-STAT3組別只數(shù)IL-6 0.15±0.02 0.55±0.04*0.53±0.03 0.25±0.03#△0.25±0.02#△空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組5 5 5 5 5 0.17±0.02 0.56±0.04*0.53±0.03 0.24±0.03#△0.25±0.01#△

2.6 潰結(jié)寧膏對模型大鼠血液Th17、Treg細(xì)胞比例的影響

與空白組比較，模型組大鼠血液Th17細(xì)胞比例升高，Treg細(xì)胞比例降低（P＜0.05），Th17/Treg細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05）；與模型組和非穴位敷貼組比較，穴位敷貼組和SASP組大鼠血液Th17細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞比例升高（P＜0.05），Th17/Treg細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。見表9。

表9 各組大鼠血液Th17、Treg細(xì)胞比例比較（-）

表9 各組大鼠血液Th17、Treg細(xì)胞比例比較（-）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與非穴位敷貼組比較，△P＜0.05

組別空白組模型組非穴位敷貼組穴位敷貼組SASP組Th17/Treg 0.11±0.02 7.82±1.01*4.42±0.40#0.18±0.04#△0.22±0.03#△只數(shù)5 5 5 5 5 Th17/%1.79±0.31 13.85±1.01*12.37±0.67 2.27±0.37#△2.65±0.33#△Treg/%15.58±0.73 1.87±0.21*2.86±0.22 12.93±0.90#△12.58±1.02#△

3 討論

根據(jù)UC臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“痢疾”等范疇，主要有濕熱下注、脾腎陽虛、肝郁脾虛等類型[13]。本研究用SD大鼠制備動(dòng)物模型，腺嘌呤灌胃2周后改為番瀉葉灌胃。腺嘌呤具有腎毒性，常作為腎陽虛證的造模藥物。番瀉葉苦寒，傷脾腎之陽氣，在灌胃同時(shí)進(jìn)行環(huán)境干預(yù)，進(jìn)一步損傷機(jī)體脾腎陽氣，最后以TNBS和乙醇復(fù)合物灌腸制備脾腎陽虛型UC模型。該病證結(jié)合模型經(jīng)前期研究證實(shí)可靠[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠造模后出現(xiàn)活動(dòng)遲緩、毛發(fā)枯槁、大便溏瀉、便中帶血等表現(xiàn)，結(jié)合腸道黏膜情況，提示造模成功。通過潰結(jié)寧膏穴位敷貼干預(yù)，能夠有效改善模型大鼠一般狀況。

UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與遺傳、環(huán)境、菌群失調(diào)和免疫功能障礙相關(guān)。腸道炎癥嚴(yán)重程度與促炎因子表達(dá)密切相關(guān)[14-15]。IL-6是由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的重要促炎因子，越來越多證據(jù)表明，IL-6水平能影響UC病情發(fā)展，改變疾病結(jié)局與預(yù)后。采用IL-6拮抗劑托珠單抗能減輕患者癥狀，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)[16-17]。IL-6能與其受體結(jié)合形成復(fù)合物，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)β受體gp130和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，其中最重要的是JAK/STAT通路。gp130相關(guān)的Janus激酶（JAK）特別是JAK1在配體結(jié)合后被激活，從而使STAT3磷酸化入核，靶向miR-155轉(zhuǎn)錄。目前染色質(zhì)免疫共沉淀已證實(shí)STAT3能夠直接與miR-155位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)IL-6、IL-17、IL-23等炎癥因子分泌。相反，miR-155通過JAK/STAT通路調(diào)節(jié)UC Th17/Treg平衡與炎癥反應(yīng)[5，18-19]。研究表明，IL-6/STAT3信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化、免疫、腸道炎癥的作用，阻斷STAT3可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，緩解腸道炎癥[20-21]。miR-155是具有不同功能的微小RNA，參與造血、炎癥和免疫反應(yīng)。炎癥因子及Toll樣受體能誘導(dǎo)miR-155表達(dá)，UC病變結(jié)腸組織miR-155表達(dá)升高，采用miR-155拮抗劑能降低其表達(dá)，減少炎癥因子分泌，改善UC癥狀及體征[22-23]。以上研究表明，IL-6/miR-155軸在UC發(fā)展中扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量增加，結(jié)腸組織IL-6/miR-155軸關(guān)鍵因子IL-6、STAT3、miR-155表達(dá)升高，潰結(jié)寧膏干預(yù)能減少模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量，抑制IL-6/miR-155軸相關(guān)因子表達(dá)，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。

穴位敷貼是常用醫(yī)外治法，具有療效顯著、不良反應(yīng)少、使用方便等特點(diǎn)，在臨床廣泛應(yīng)用。在中西藥內(nèi)服基礎(chǔ)上加用穴位敷貼能提高UC治療效果，減輕藥物不良反應(yīng)，臨床取穴主要為脾俞、腎俞、大腸俞、神闕等[24-25]。潰結(jié)寧膏依據(jù)臟腑經(jīng)絡(luò)理論選擇穴位，采用藥物外用刺激穴位，進(jìn)一步通過經(jīng)絡(luò)將藥效輸送至相應(yīng)部位，從而溫補(bǔ)脾腎、調(diào)節(jié)氣血。

綜上，潰結(jié)寧膏可降低脾腎陽虛型UC大鼠DAI評(píng)分和CMDI評(píng)分，修復(fù)結(jié)腸組織損傷，其機(jī)制與減少炎癥因子分泌，抑制IL-6/miR-155軸相關(guān)因子IL-6、p-STAT3、miR-155表達(dá)，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡有關(guān)。