高密度二氧化碳對酪蛋白結(jié)構(gòu)及物理特性的影響

周學府，鄭遠榮，鐘 宇，王丹鳳，鄧 云

（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 上海201100 乳業(yè)生物技術國家重點實驗室 上海乳業(yè)生物工程技術研究中心 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 上海 200436）

酪蛋白（Casein）是牛乳中關鍵蛋白質(zhì)之一，主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。在牛乳中大多數(shù)酪蛋白呈膠束球形顆粒，約10%～20%以溶解或非膠束的形式存在[1]。作為一種全蛋白，酪蛋白具有較高的營養(yǎng)價值，并具有良好的功能特性，因而被廣泛應用于食品工業(yè)[2]。

高密度二氧化碳（DPCD）是一種新型的非熱加工技術，它通過在溫度低于60 ℃，壓強低于50 MPa 的條件下，利用CO2的分子效應實現(xiàn)殺菌和鈍酶的目的，最大限度地保持食品感官和營養(yǎng)品質(zhì)，延長其保質(zhì)期[3]。DPCD 與傳統(tǒng)熱處理相比，具有能耗低，對食品品質(zhì)影響較小等優(yōu)勢，被公認為食品工業(yè)具有發(fā)展前景的冷殺菌技術[4]。

據(jù)報道，DPCD 能夠在殺滅微生物的同時，影響食品中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及物理特性[4-5]，從而引起食品品質(zhì)變化。研究表明[3，6]，DPCD 能使蝦肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊，并破壞肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)，與此同時也改變其溶解度、濁度、黏度等物理特性。目前關于DPCD 對乳制品特征蛋白結(jié)構(gòu)、功能和品質(zhì)的影響鮮有研究報道。本試驗研究DPCD 處理前、后酪蛋白結(jié)構(gòu)和物理特性的變化，探究其隨壓強、時間、溫度改變的規(guī)律，為乳制品的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 酪蛋白酸鈉（Casein Sodium，酪蛋白含量≥90%），Adamas 公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒，上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要儀器 間歇式高密度二氧化碳裝置（HKY-1），海安石油科研儀器有限公司；圓二色譜儀（J-815 spectrometer），日本分光公司；多功能酶標儀（M1000），瑞士帝肯公司；納米粒度分析儀（Zetasizer Nano S），英國Malvern 公司；流變儀（Haake RS 6000），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；均質(zhì)機（PT 10-35 GT），瑞士Kinematica 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酪蛋白酸鈉溶液制備 稱取0.5 g 酪蛋白酸鈉溶解于50 mL 去離子水，室溫下于磁力攪拌器上攪拌20 min，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的酪蛋白酸鈉溶液。

1.2.2 間歇式DPCD 處理 首先打開循環(huán)水泵和冷箱，使處理釜溫度升至設定值并使冷箱溫度降至4 ℃左右。將50 mL 蛋白溶液平均分裝于3 個離心管，并放置于DPCD 處理釜中。密封后打開真空泵抽取處理釜中多余氣體，打開CO2總閥、進氣閥以及加壓泵，待處理釜中壓強升至設定值后關閉閥門和加壓泵（升壓過程約持續(xù)7 min），樣品在恒定溫度和壓強下保持一段時間。處理結(jié)束后打開放氣閥緩慢泄壓（泄壓過程約持續(xù)3 min）。本研究針對壓強、溫度、時間3 種因素進行單因素重復試驗，設計方案如下：

1）固定溫度35 ℃，時間25 min，設置壓力梯度為5，10，15，20，25，30 MPa；

2）固定溫度35 ℃，壓強15 MPa，設置時間梯度為5，15，25，35，45 min；

3）固定壓強15 MPa，時間25 min，設置溫度梯度為35，34，55，65 ℃，并以相同溫度的單純熱處理作為對照。

1.2.3 圓二色譜分析 酪蛋白二級結(jié)構(gòu)通過圓二色譜儀進行測定[7]。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋至0.1 mg/mL。在25 ℃條件下，使用光程長度為1 mm 的石英比色皿在190～260 nm 的波長范圍內(nèi)以100 nm/min 的速率掃描，每次掃描進行3 次重復。使用相同濃度磷酸鹽緩沖液對所有測得的光譜進行基線校正。

1.2.4 表面疏水性（H0） 使用1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）測定酪蛋白的表面疏水性[8]，將每組蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋至5 個不同的質(zhì)量濃度（0.05～0.2 mg/mL），將10 μL ANS（8 mmol/L）添加至4 mL 樣品溶液中，靜置3 min。用熒光光譜儀在390 nm（激發(fā)波長）和470 nm（發(fā)射波長）下進行測定。熒光強度隨蛋白濃度變化的斜率即為相對表面疏水性，進行3 次重復。

1.2.5 溶解性 將酪蛋白樣品于25 ℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清液，通過Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定上清液可溶性蛋白含量。溶解度按以下公式計算：

1.2.6 動態(tài)光散射（DLS） 通過動態(tài)光散射測定蛋白樣品的粒徑，方法如下[10]：將蛋白樣品用去離子水稀釋至1 mg/mL，用納米激光粒度儀測定酪蛋白的粒徑，每組樣品測定3 次取其平均值。

1.2.7 表觀黏度 酪蛋白溶液的流變學特性通過流變儀評估[11]。通過流變儀測定酪蛋白溶液（10 mg/L） 表觀黏度與剪切速率的函數(shù)關系，試驗條件：平板間距：1 mm，溫度：25 ℃，剪切速率范圍：0.1～100 s-1。

1.2.8 乳化性 將6 mL 酪蛋白溶液 （10 mg/mL）和2 mL 玉米油混合，使用均質(zhì)機以10 000 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)1 min，從離心管底部吸取20 μL 新鮮配置的乳液，加入至5 mL 0.01 g/L SDS 溶液中，混合均勻，在500 nm 處測量吸光度，記為A0。乳液靜置30 min 后，以相同的方法吸取乳液稀釋于SDS溶液中，在500 nm 處測量吸光度，記為A30，以0.01 g/L SDS 溶液作為對照，試驗進行3 次重復。酪蛋白的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計算公式如下：

式中：T=2.303；N——稀釋倍數(shù)；C——乳狀液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL；Φ——乳狀液中油相的體積分數(shù)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示，并使用SPSS 16.0 軟件進行分析。使用單因素方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)，并進行Duncan的多范圍檢驗以確定平均值之間的差異。結(jié)果在P<0.05 時被認為有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 二級結(jié)構(gòu)

DPCD 對酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)影響如圖1和表1所示。從圖1看出，酪蛋白CD 光譜在波長為200 nm 附近均出現(xiàn)1 個明顯的負峰，表明酪蛋白含有大量的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[12]，Kong 等[12]也發(fā)現(xiàn)類似的二級結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)DPCD 處理后酪蛋白的CD 光譜信號強度顯著降低，意味著處理對酪蛋白二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。表1顯示了DPCD 處理前后酪蛋白的4 種二級結(jié)構(gòu)含量，能看出酪蛋白二級結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)呈無規(guī)則卷曲，這與CD 光譜特征峰分析結(jié)果一致。DPCD 能夠顯著降低酪蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量（P<0.05），尤其在高壓（30 MPa）和長時間（45 min）處理條件下其影響更為顯著，其α-螺旋含量從8.15%分別降低至5.65%和5.95%。α-螺旋含量減少，表明維持酪蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵部分斷裂，使得蛋白質(zhì)處于伸展狀態(tài)。但在溫度較高處理條件下（55 ℃、65 ℃），酪蛋白α-螺旋含量分別上升至10.1%和8.6%，可能是因為高溫和DPCD 的協(xié)同作用增強了酪蛋白分子相互作用，改變蛋白質(zhì)氫鍵取向從而生成更多氫鍵。另外，35 ℃下DPCD 使酪蛋白中的β-折疊含量顯著增大（P<0.05），無規(guī)則卷曲含量降低，說明其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲存在向β-折疊轉(zhuǎn)化的趨勢。DPCD 導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生此類轉(zhuǎn)變在其它蛋白質(zhì)中也有所報道，例如蝦肌球蛋白[6]和肌紅蛋白[13]。

表1 DPCD 對酪蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分含量影響Table 1 The effect of DPCD treatment on second structure fractions of casein

（續(xù)表1）

2.2 表面疏水性（H0）

DPCD 對酪蛋白表面疏水性影響如圖2所示。隨著DPCD 處理壓強增大以及溫度升高，酪蛋白表面疏水性先升高后下降，分別在處理壓強為20 MPa，溫度為45 ℃條件下達到最大值（18.49 和22.16）。而在一定范圍內(nèi)，處理時間越長其表面疏水性越大。

圖2 DPCD 對酪蛋白表面疏水性影響Fig.2 The effect of DPCD on the surface hydrophobicity of casein

總體而言，DPCD 能夠顯著增大酪蛋白的表面疏水性（P<0.05），暴露出埋藏于分子內(nèi)部的疏水性基團，其歸因于超臨界CO2作為疏水性溶劑，能通過與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中疏水性基團反應，對蛋白質(zhì)表面疏水性起修飾作用[14]。Ding 等[14]和Sheng等[15]的研究也存在相似結(jié)果，其研究表明，經(jīng)DPCD 處理后的蛋清和全蛋液的表面疏水性顯著上升。而在本研究中，高壓（25，30 MPa）以及高溫（55，65 ℃） 導致酪蛋白表面疏水性降低是因為高壓和高溫可導致疏水性基團相互結(jié)合而重新掩埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部[6]。

2.3 物理特性

2.3.1 溶解度 DPCD 對酪蛋白溶解度影響如表2所示。與未處理的酪蛋白相比，經(jīng)DPCD 處理后酪蛋白溶解度顯著降低 （P<0.05）。其原因是CO2降低了體系pH 值及其對酪蛋白堿性氨基酸的修飾作用[16-17]。

由表2可知，隨著處理壓強增大以及處理時間延長，酪蛋白溶解度呈降低趨勢，其歸因于升壓能增大CO2在水中的密度與溶解度以及長時間處理使CO2得以充分溶解與擴散，從而增強CO2分子效應。對于溫度影響而言，單純熱處理未能影響酪蛋白溶解度，而高溫條件（55，65 ℃）下DPCD 使其溶解度急劇下降，從93.98%分別降至38.62%和42.68%，這與酪蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的異常變化相關。溶解度作為酪蛋白重要的物理性質(zhì)之一，與其它功能性質(zhì)如乳化性、起泡性存在緊密聯(lián)系[18]。因此考慮到DPCD 對酪蛋白溶解度影響，在相同殺菌效果前提下，選擇較低的DPCD 處理壓強、溫度和較短處理時間對乳制品進行殺菌能減少酪蛋白的沉淀。

2.3.2 粒徑 表2顯示了DPCD 處理前后的平均粒徑，可用于分析酪蛋白的分子鏈構(gòu)象、聚集體尺寸及形態(tài)。由表2可知酪蛋白粒徑隨DPCD 處理壓強升高和處理時間延長先減小后增大；溫度方面，升高處理溫度能夠引起酪蛋白粒徑突增，尤其在55 ℃處理溫度下，其粒徑突變至1 030.43 nm。

表2 DPCD 對酪蛋白物理性質(zhì)的影響Table 2 The effect of DPCD treatment on physical properties of casein

以上結(jié)果表明，DPCD 對酪蛋白粒徑的影響是處于使其解離和聚集的動態(tài)平衡中[19]，在高壓（30 MPa）、長時間（45 min）以及較高溫（45，55，65℃） 的處理條件下，DPCD 對酪蛋白聚集效應大于解離效應而引起其粒徑增大，而其它條件下DPCD 對酪蛋白存在輕微解離效應。蛋白質(zhì)的解離可能是因為DPCD 處理過程中，溶液中不僅存在酪蛋白間的相互作用，同時也存在CO2與蛋白質(zhì)的相互作用，如疏水相互作用、氫鍵、靜電作用[20]等，從而導致蛋白間的相互作用減弱而解離[19]。高溫（55，65 ℃）下DPCD 誘導酪蛋白粒徑的突變與二級結(jié)構(gòu)、表面疏水性變化相符，再次印證高溫和DPCD 存在一定協(xié)同作用，共同引起酪蛋白聚集沉淀。蛋白質(zhì)粒徑可影響其吸收率和食品感官品質(zhì)[21]，蛋白較小粒徑賦予食品細膩的口感和更高的消化吸收率。因此，DPCD 對乳制品殺菌過程中應避免較高的處理溫度以及處理壓強。

2.3.3 表觀黏度 DPCD 處理前后的酪蛋白溶液的流動行為如圖3所示。酪蛋白在剪切速率（0.01～1 s-1） 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強的假塑性行為，而在（1～100 s-1）范圍內(nèi)其表觀黏度變化不顯著，近似于牛頓流體。雖然DPCD 對酪蛋白結(jié)構(gòu)具有破壞作用，但仍未改變其剪切稀化的流動行為。由圖3可知，DPCD 顯著降低酪蛋白的表觀黏度，其原因一方面來自于較小的粒徑導致酪蛋白體系流動性增強[22]。另一方面，蛋白質(zhì)黏度與其溶解度存在一定關系[23]，只有同時具備高溶解度以及強吸水性才能產(chǎn)生高黏度體系。因此受DPCD 影響，酪蛋白溶解度降低使得酪蛋白與水的體系表觀黏度下降，這也能解釋高溫處理條件下酪蛋白粒徑增大但表觀黏度降低的現(xiàn)象。范金波等[24]與Sheng 等[15]有相似的研究結(jié)果，全蛋液和蛋清液經(jīng)DPCD 處理后黏度也顯著降低。但由圖3可知，相比于溫度與時間因素對酪蛋白表觀黏度影響，處理壓強對其影響更為顯著。當壓強大于10 MPa 時，其表觀黏度急劇降低。乳制品的黏度與感官品質(zhì)之間存在相關關系[25]，過高或過低的黏度都不利于乳制品的加工，因此控制處理壓強是維持乳制品黏度的有效手段。

圖3 DPCD 對酪蛋白表觀黏度的影響Fig.3 The effect of DPCD treatment on viscosity profile of casein

2.3.4 乳化性 DPCD 對酪蛋白乳化活性（EAI）乳化穩(wěn)定性（ESI）影響如表2所示。乳化活性表征了乳劑形成過程中蛋白質(zhì)在油水界面快速吸附的能力[26]，由表2可知，總體上DPCD 處理降低了酪蛋白的乳化活性，這一現(xiàn)象可通過溶解度和表面疏水性變化解釋。蛋白質(zhì)乳化活性與其溶解度相關，DPCD 處理后酪蛋白較差的溶解性使其吸附于油水界面的分子數(shù)量減少，從而限制其乳化活性[27]。另外DPCD 對酪蛋白表面疏水性的修飾作用使其本身親水性/疏水性平衡被破壞，使酪蛋白在界面處的吸附能力降低，從而降低其乳化活性[28]。乳化穩(wěn)定性方面，DPCD 導致酪蛋白乳化穩(wěn)定性顯著降低（P<0.05），可歸因于由DPCD 引起的酪蛋白表觀黏度的下降導致分子分散于油水界面的穩(wěn)定性降低，不能有效阻止乳化液滴絮凝而使其乳化穩(wěn)定性下降。但隨著壓強升高和處理時間延長，其乳化性存在輕微上升趨勢，這可能與酪蛋白溶液濁度變化有關。由此可見，DPCD 對酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性存在不利影響，一定程度上影響了酪蛋白的加工特性。

3 結(jié)論

DPCD 通過影響酪蛋白二、三級結(jié)構(gòu)來改變其物理特性，從而影響乳制品品質(zhì)。35 ℃條件下DPCD 將酪蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊，并增大其表面疏水性。但高溫與DPCD 的協(xié)同作用可引起酪蛋白二、三級結(jié)構(gòu)相反的變化。基于其對酪蛋白結(jié)構(gòu)影響，35℃條件下DPCD 可降低酪蛋白溶解度并且能對蛋白分子起輕微解離作用，但高溫處理條件下酪蛋白溶解度降低趨勢更明顯且更容易發(fā)生聚集而發(fā)生粒徑的突變。而DPCD 對酪蛋白流動行為和界面特性影響表現(xiàn)在其引起酪蛋白表觀黏度和乳化性的降低?？偠灾?，高溫可增強酪蛋白對DPCD 的敏感性而使其品質(zhì)更容易被破壞，因此用DPCD 對乳制品進行殺菌時低溫（35 ℃）處理能有效維持酪蛋白的物理特性。然而，在實際生產(chǎn)過程中，還需和DPCD 的殺菌效果以及能耗相結(jié)合，實現(xiàn)在充分殺菌的同時，最低限度地影響乳制品品質(zhì)。