樟芝深層發(fā)酵菌絲體提取物對(duì)食源性致病菌的抑制作用

李華祥，石 蠫，蔣文浩，王娟娟，陸春雷，高亞軍，賈祿強(qiáng)，楊振泉*

（1 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇揚(yáng)州 225127 2 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫 214122）

樟芝（Antrodia camphorate 或Taiwanofungus camphoratus），又名牛樟芝、牛樟菇等，是一種大型珍稀藥食兩用真菌，屬于擔(dān)子菌綱、多孔菌目、薄孔菌屬，素有“藥芝之王”、“森林紅寶石”之美譽(yù)[1-2]。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)樟芝在保肝、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、降血壓、降血脂、緩解疲勞及調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著功效[3-5]。隨后，研究者們從樟芝子實(shí)體及發(fā)酵菌絲體中分離出百余種活性物質(zhì)，主要包括三萜類、多糖類及苯環(huán)類等，具有較大的研究潛力及開(kāi)發(fā)價(jià)值[6]。

國(guó)外學(xué)者Geethangili 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，樟芝的氯仿及正己烷提取物均能顯著抑制幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori）的生長(zhǎng)。Lien 等[8]發(fā)現(xiàn)，樟芝的3種有機(jī)溶劑（乙醇、氯仿及乙酸乙酯）提取物均對(duì)口腔細(xì)菌變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果，其MIC 值為4～16 μg/mL。國(guó)內(nèi)學(xué)者楊淑賢等[9]及汪雯翰等[10]發(fā)現(xiàn)，樟芝的3 種有機(jī)溶劑（甲醇、氯仿及正丁醇）提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果。李娟等[11]發(fā)現(xiàn)，樟芝乙酸乙酯提取物對(duì)7 種多重耐藥性人體致病細(xì)菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制效果。

有關(guān)樟芝菌絲體提取物在抑制食源性致病菌方面的研究較少，尤其是對(duì)副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）等弧菌和阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）的生長(zhǎng)抑制效果研究尚顯不足。本文以成本低廉且較易獲得的樟芝深層發(fā)酵菌絲體[12]為原料，研究樟芝菌絲體不同提取物對(duì)15 種食源性致病菌的抑制作用，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善樟芝活性物質(zhì)在抑菌方面的研究，為開(kāi)發(fā)新型安全高效、功能多樣的食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 本文所用樟芝及所有食源性致病菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株[13]。

1.1.2 試劑 本文中培養(yǎng)樟芝斜面所用的PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)食源性致病菌所用的LBS 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基，上海生工；用于配制樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基的相關(guān)試劑及其它常規(guī)試劑（分析純），國(guó)藥集團(tuán)（中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 樟芝菌絲體的收集 根據(jù)樟芝深層發(fā)酵的前期研究成果，采用5 L 發(fā)酵罐按照文獻(xiàn)[14]中的培養(yǎng)基配方（葡萄糖2%，酵母浸出粉0.2%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，pH 4.5）和發(fā)酵條件（接種量為1×106spore/mL，26 ℃，150 r/min，發(fā)酵10 d）進(jìn)行樟芝深層發(fā)酵，結(jié)束后用4 層紗布過(guò)濾并收集樟芝菌絲體。

1.2.2 樟芝活性物質(zhì)的提取 將樟芝菌絲體與甲醇、乙醇、乙酸乙酯或蒸餾水按料液比為1∶10 的比例混合，超聲處理45 min 后，靜置過(guò)夜。然后離心（8 000 r/min，10 min，4 ℃）收集上清液，即得樟芝菌絲體提取液[15]。

將樟芝有機(jī)溶劑提取液70 ℃水浴蒸干后，稱重并用DMSO 溶劑復(fù)溶；將樟芝水提取液真空冷凍干燥，稱重后用水復(fù)溶。最終獲得已知濃度的樟芝菌絲體提取液。

1.2.3 致病菌的培養(yǎng)及稀釋 參照石瑀等[16]的方法，將食源性致病菌分別接種于LBS 培養(yǎng)基（弧菌）及LB 培養(yǎng)基（非弧菌）中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋（梯度為10，共稀釋10個(gè)梯度）并吸取100 μL 各稀釋菌液均勻涂布于平板上，培養(yǎng)10～12 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。最后，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果將每個(gè)測(cè)試菌的培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到1×105CFU/mL 備用。

1.2.4 抑菌譜的測(cè)定 測(cè)定樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜時(shí)，我們采用的是牛津杯法[17]，具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)。

1.2.5 最小抑菌濃度的測(cè)定 測(cè)定樟芝菌絲體提取物對(duì)食源性致病菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 時(shí)采用二倍稀釋法[18]，具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，設(shè)置生理鹽水空白對(duì)照組及DMSO 溶劑對(duì)照組，每個(gè)組均設(shè)置6 個(gè)生物重復(fù)。我們將溶劑無(wú)抑菌效果（即根據(jù)分光光度計(jì)檢測(cè)及肉眼觀察結(jié)果，判斷抑菌率為0） 且樟芝菌絲體提取物完全抑菌（即根據(jù)分光光度計(jì)檢測(cè)及肉眼觀察結(jié)果，判斷抑菌率為100%）時(shí)所對(duì)應(yīng)的樟芝菌絲體提取物最低添加濃度視為相應(yīng)的最小抑菌濃度。

1.2.6 抑菌效果驗(yàn)證 測(cè)定樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)各測(cè)試菌的抑菌率時(shí)，我們采用的是平板菌落計(jì)數(shù)法[19]。根據(jù)最小抑菌濃度的檢測(cè)結(jié)果，我們選取副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌及最小弧菌3 株菌株作為測(cè)試菌以驗(yàn)證樟芝甲醇提取物的抑菌效果。具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，此處以檢測(cè)樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果的操作為例進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。即采用20 mL 玻璃試管為容器，LB 培養(yǎng)基的裝液量為5 mL，接入100 μL 濃度為1×105CFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液，再加入400 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液（此濃度在最小抑菌濃度檢測(cè)試驗(yàn)中抑菌效果理想且對(duì)應(yīng)的溶劑無(wú)抑菌效果），將試管置于37 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)，并于8，10，12 h 分別取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以相同體系中添加400 μL 無(wú)菌生理鹽水代替樟芝菌絲體甲醇提取液的試管作為空白對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)測(cè)試菌株的抑菌率。檢測(cè)樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)副溶血性弧菌及最小弧菌的抑菌率時(shí)，除了將LB 培養(yǎng)基替換成LBS培養(yǎng)基以外，其余操作均與檢測(cè)樟芝菌絲體提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率操作相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟芝菌絲體提取物的抑菌譜

按1.2.2 節(jié)中的方法，獲得質(zhì)量濃度分別為49.6，17.6，44.0，82.0 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液（ME）、乙醇提取液（AE）、乙酸乙酯提取液（EE）及水提液（WE）。分別吸取500 μL 上述4 種樟芝菌絲體提取液并將質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至15 mg/mL 后，按1.2.4 節(jié)中的方法檢測(cè)樟芝菌絲體不同提取物對(duì)15 株食源性致病菌的抑制效果，獲得各樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，4 種樟芝菌絲體提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及6 株阪崎腸桿菌均無(wú)明顯抑制作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均呈現(xiàn)顯著抑制作用。此外，樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)5 株弧菌及蠟樣芽孢桿菌均有較好的生長(zhǎng)抑制效果；樟芝菌絲體乙醇提取物對(duì)河流弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長(zhǎng)抑制效果；樟芝菌絲體乙酸乙酯提取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有較為顯著的抑制效果；樟芝菌絲體水提物對(duì)霍亂弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長(zhǎng)抑制效果。可見(jiàn)，樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，能顯著抑制15 株測(cè)試菌中7 株菌株的生長(zhǎng)。

表1 樟芝菌絲體不同提取物的抑菌譜Table 1 The antibacterial spectrum of different extracts from mycelia of Antrodia camphorata

2.2 樟芝菌絲體提取物的最小抑菌濃度

在檢測(cè)出不同樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜后，我們進(jìn)一步檢測(cè)了4 種樟芝菌絲體提取物對(duì)其所對(duì)應(yīng)測(cè)試菌株的最小抑制濃度，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，DMSO 對(duì)食源性致病菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但抑制效果隨濃度的降低而減弱，直至幾乎無(wú)抑菌效果。將用DMSO 溶解的樟芝菌絲體提取物的抑菌效果與相同濃度的DMSO（表中同一列數(shù)據(jù)）抑菌效果相比較后得出，4 種樟芝菌絲體提取物均對(duì)7 株測(cè)試菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，且最小抑菌質(zhì)量濃度在0.3～41.0 mg/mL 之間。其中，樟芝菌絲體乙醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度最低，為0.3 mg/mL；樟芝菌絲體水提物對(duì)弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度最高，為41.0 mg/mL。

表2 不同樟芝菌絲體提取物對(duì)測(cè)試菌的抑制作用Table 2 The antibacterial activity of extracts from mycelia of Antrodia camphorata on test bacteria

（續(xù)表2）

2.3 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果驗(yàn)證

由于樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，抑菌效果最好。因此選擇樟芝菌絲體甲醇提取物及3 株致病菌（金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌） 作為樟芝代表提取物及測(cè)試菌代表菌株，用20 mL 試管體系培養(yǎng)，并用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證樟芝菌絲體提取物對(duì)測(cè)試菌的抑制效果。

2.3.1 測(cè)試菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 首先測(cè)定了金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌21613的生長(zhǎng)曲線，以確定最佳取樣時(shí)間，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，副溶血性弧菌和最小弧菌的遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0～4 h，4～10 h 和10～12 h；金黃色葡萄球菌的遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0～6 h，6～10 h 和10～12 h?？梢?jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)8 h 和10 h 時(shí)，3 種菌均處于對(duì)數(shù)期中期及對(duì)數(shù)期末期；培養(yǎng)12 h 時(shí)，3 種菌均處于穩(wěn)定期。因此，后續(xù)檢測(cè)樟芝甲醇提取物的抑菌率時(shí)，我們分別取培養(yǎng)8，10 h 及12 h 的菌液進(jìn)行涂布及菌落計(jì)數(shù)。

圖1 測(cè)試菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of test bacterias

2.3.2 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果 采用平板菌落計(jì)數(shù)法，檢測(cè)樟芝甲醇提取物在最小抑菌濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌不同培養(yǎng)時(shí)間的抑菌率，以進(jìn)一步驗(yàn)證其抑菌效果，結(jié)果如表3所示。

表3 樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)測(cè)試菌的抑菌率Table 3 The antibacterial rate of methanol extracts from mycelia of Antrodia camphorate on test bacterias

由表3可知，樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)兩株弧菌的抑菌率在對(duì)數(shù)期中期達(dá)到最大值；而樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果隨培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的增加而增強(qiáng)，在穩(wěn)定期時(shí)抑菌率達(dá)到最大值。上述結(jié)果表明，樟芝菌絲體甲醇提取物確實(shí)能顯著抑制金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌的生長(zhǎng)，且最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果較為理想，從而進(jìn)一步證實(shí)了抑菌譜試驗(yàn)及最小抑菌濃度試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

3 結(jié)論

樟芝菌絲體提取物對(duì)15 株食源性致病菌中的7 株（霍亂弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、最小弧菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌）具有較好的抑制效果，且不同提取物對(duì)測(cè)試菌的最小抑菌質(zhì)量濃度范圍在0.3～41.0 mg/mL 之間。其中，樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，抑菌效果最顯著；平板菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，樟芝菌絲體甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌的最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果極其顯著，進(jìn)一步證實(shí)了樟芝菌絲體提取物的抑菌效果。本研究結(jié)果較具開(kāi)發(fā)價(jià)值及應(yīng)用前景。