氟喹諾酮類獸藥殘留高通量檢測方法研究進展

劉 兵

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000）

一、引言

在家畜和水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，為了預(yù)防和醫(yī)治動物感染細菌性疾病，飼養(yǎng)過程中會大量使用各種抗生素[1]4183。其中，喹諾酮類抗生素在家畜和水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中，具有抗菌范圍廣，殺菌徹底，價格便宜等優(yōu)勢。喹諾酮類抗生素（Quinolones，QNS）現(xiàn)已經(jīng)發(fā)展到第四代，但目前我國家畜和水產(chǎn)品常用的是第三代氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）[2]81。由于農(nóng)戶的不合理用藥、過量用藥和使用違禁藥品等問題，F(xiàn)Qs通過食物鏈在人體中大量富集，對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝腎等器官產(chǎn)生的危害和毒性作用越來越明顯[3]180，并且最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Qs的不合理使用，造成人類的耐藥性，從而降低FQs類藥物在人類疾病中的療效[4]665。我國政府對FQs殘留非常重視，目前很多FQs類藥物在我國食品中已禁止使用。國標GB31650—2019規(guī)定了FQs藥物的最大殘留量，具體如表1所示。

表1 GB31650—2019中動物源性食品中氟喹諾酮藥物最大殘留量（單位：ng·g-1）

隨著科技的發(fā)展，用于動物源性食品的檢測方法越來越多，并且很多研究在這方便取得了顯著的進步，但FQs殘留的檢測技術(shù)大多還是集中在液相色譜及與其相關(guān)的檢測方法上。本文綜述了FQs類藥物殘留的前處理方法，以及常用的儀器檢測方法，以期為保障動物源性食品的氟喹諾酮類藥物用藥安全提供參考依據(jù)。

二、樣品前處理技術(shù)研究進展

動物源性食品檢測都需要對樣品進行前處理，才能進行進一步的檢測。傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取樣品前處理方法已不能滿足當(dāng)代檢測的需要，需要在傳統(tǒng)方法中融入新技術(shù)和新材料，比如：分子印跡固相萃取技術(shù)、QuEChERS、超臨界流體萃取技術(shù)等，給動物源性食品的藥物殘留檢測技術(shù)節(jié)省了時間和試劑，并且在回收率、準確度、重現(xiàn)性等方面也取得了很大的進步。

（一）液液萃取

液液萃取法（liquid liquid extraction，LLE）是利用不同物質(zhì)在溶劑中溶解度的不同，來達到分離提取被提取物的方法。孫紅洋等用1%的乙酸乙酯為提取液，對雞蛋、雞肝臟、雞腎臟和雞肉等樣品進行前處理，再用乙腈飽和正己烷對樣品中的多余脂肪進行清除，使樣品回收率達到75.5%—106%。處理后的樣品采用內(nèi)標法用HPLC-MS/MS法進行測定，兩種藥物都具有良好的線性（R2≥0.992），定量限達到5ng·g-1，通過添加四個濃度藥物，兩種藥物的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11.2%[5]57。從實驗結(jié)果可以看到，采用傳統(tǒng)的萃取法，具有操作方法簡單的優(yōu)點，此方法可以用于雞蛋和雞肉組織中喹諾酮類藥物的高通量快速檢測分析。王成真等先用含磷酸緩沖液的乙腈提取，然后利用蛋白質(zhì)加熱沉淀，用正己烷脫脂，對雞蛋樣品進行前處理，然后進行檢測，5種氟喹諾酮類藥物的定量下限均達到10ng·g-1以下，并且平均回收率達到92.2%—107.1%[6]617。本法用LLE和蛋白質(zhì)沉淀相結(jié)合的方式進行樣品前處理，方法簡單、環(huán)保、快捷和回收率高，能夠用于低成本大量雞蛋樣品的高通量分析，也適用于雞蛋樣品的快速檢測。徐佳等利用表面活性共滲透技術(shù)，并且結(jié)合液液萃取技術(shù)，對牛奶樣品進行前處理并測定，結(jié)果顯示，牛奶中喹諾酮含量的最低檢出限為0.3ng·mL-1—1.4ng·mL-1，并且在線性范圍內(nèi)，三個濃度的加標回收率為87.8%—109.0%[7]124。由此可見，隨著新技術(shù)新材料的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的液液萃取前處理技術(shù)開始和這些新技術(shù)和新材料相結(jié)合，在樣品前處理方面的應(yīng)用越來越多。

（二）固相萃取

固相萃取（solid phase extraction，SPE）樣品前處理技術(shù)，更多地是應(yīng)用在一些固體樣品的前處理方面，其原理是被測物與固定相萃取劑物質(zhì)的官能團通過疏水作用、離子交換作用、物理吸附作用等作用力的大小來達到分離的效果。相較于LLE樣品前處理方法，該方法操作簡便，環(huán)境污染小，能更好地達到分離和純化被測物的特點，應(yīng)用非常廣泛。并且隨著分子印跡和磁性多壁碳納米管等技術(shù)的發(fā)展，開始讓其和固相萃取相結(jié)合，在待測物前處理方面的應(yīng)用越來越多。

張林田等[8]85采用樣品先勻漿提取，后通過PRIME HLB小柱凈化，濃縮后測定的方法，建立了豬牛肉、蝦、魚食品中11種喹諾酮類藥物的測定方法。因在提取溶液時，采用乙腈為提取液，并加入了0.1%甲酸，提高了樣品的回收率，達到81.1%—115.9%。通過PRIME HLB小柱凈化，消除磷脂類化合物的干擾，大大降低了藥物的檢出限，定量限低至2.0 ng·g-1，滿足國標檢測需要。可以看出，采用SPE樣品前處理方法具有處理步驟簡單，所需時間短，回收率高和環(huán)保性強等特點，能夠用于低成本大量動物源性食品中的喹諾酮類藥物的高通量分析。

徐瀟穎等在傳統(tǒng)的固相萃取小柱凈化的基礎(chǔ)上，加入了磁性的MWCNTs，利用磁性吸收作用，簡化了SPE樣品前處理的過程，并且提高了回收率，實驗中17種喹諾酮類藥物的三個濃度的加標回收率為78.0%—101.1%，檢出限低至0.2 ng·g-1—2.0 ng·g-1[9]63?？梢钥闯?，在酸性環(huán)境下，加入的磁性多壁碳納米管可以消除蜂蜜中的大量糖分對回收率低的影響，并且將其融入到固相萃取技術(shù)中可以省時省力，并且節(jié)約能源，簡單快捷地達到樣品前處理的目的，能夠用于大量蜂蜜中的多組分喹諾酮類藥物的高通量分析。

楊艷菲等首先用pH值為5.0的磷酸二氫鉀溶液對樣品中的藥物殘留進行提取，然后通過MISPE柱進行凈化，并通過優(yōu)化MISPE的淋洗液比例，來提高其對喹諾酮類藥物的特異性吸附。實驗結(jié)果顯示，本實驗建立分子印跡固相萃取，對9種FQs有特異性吸附作用，檢測的定量限低至0.25ng·mL-1，三個濃度范圍的回收率為65.8%—112.2%[10]1067。由此可見，把分子印跡這種方法和固相萃取相結(jié)合，來對樣品進行前處理，具有操作簡單，對環(huán)境友好等特點，這種方法可以用于大批量樣品中喹諾酮藥物殘留高通量分析。

（三）QuEchERS前處理方法

QuEchERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safety)是在固相萃取的基礎(chǔ)上，融入現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展而來的，該方法通過加入填充材料對雜質(zhì)的吸附作用，從而達到分離凈化的目的。QuEchERS因其需要儀器少，操作簡單，對環(huán)境友好，并且能夠滿足實驗需要，被廣泛應(yīng)用于動物源性食品的前處理。

方從容等首先用提取液進行提取，再用冷凍脂質(zhì)過濾，最后采用DSPE的方法進行凈化，并建立同時檢測125種藥物殘留的檢測方法。結(jié)果顯示，通過外標法測定，在一定線性范圍內(nèi)，125種藥物殘留的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，并且能夠保持平均回收率在60.4%～119.3%范圍之內(nèi)[11]1124。由此可見，QuECh-ERS能夠有效地降低樣品中的基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高檢測準確度和精密度，并且QuEChERS整個操作過程簡便、快速，能夠用于大量的雞蛋中多組分喹諾酮類藥物的高通量快速分析。

張中印等為了降低樣品中蛋白質(zhì)對基質(zhì)的影響，采用加乙酸的乙腈溶液來提取樣品，加入無機鹽（Na2SO4和NaCl）促使藥物殘留進入有機相，最后通過優(yōu)化吸附劑組合（150mgC18-EC、50mgPSA、900mgNa2SO4），來減少基質(zhì)中的雜質(zhì)的影響，提高實驗的回收率。最終建立的HPLC-MS/MS檢測方法在0.1 ng·mL-1—100 ng·mL-1線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.99），14種喹諾酮類藥物的檢出限達到0.51ng·g-1—3.22 ng·g-1，定量檢出限達到1.69 ng·g-1—10.75ng·g-1。優(yōu)化后的QuEchERS處理方法的樣品回收率為80.4%—110.2%[12]244。由此可見，QuEchERS樣品前處理方法，對蜂蜜和蜂王漿樣品的處理具有省時、成本低等優(yōu)點，可以用于大量的蜂蜜中多組分喹諾酮類藥物的高通量快速分析。

薛榮旋等對樣品前處理方法進行優(yōu)化，最終采用1%的甲酸乙腈提取，再用50 mg PSA、150 mg C18和900 mg無水硫酸鈉組成的體系進行凈化。采用梯度洗脫的方式，用UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中6種喹諾酮類藥物，標準溶液的檢出限為0.30ng·g-1—0.80ng·g-1，定量標準曲線為1ng·mL-1—100ng·mL-1（R2≥0.999）。三種魚類的加標回收率為86.6%—120%[13]521。從實驗的結(jié)果可以看到，QuEchERS對水產(chǎn)品的樣品前處理方法的良好效果，藥物的基質(zhì)效應(yīng)的影響均小于20%，并且具有使用試劑量小、省時省力等特點，適合于水產(chǎn)品中抗生素類藥物快速高通量檢測。

（四）復(fù)合式處理方法

卞華等對樣品采用加入甲酸的乙腈進行提取，并比較采用各種萃取方法的萃取效果，最終發(fā)現(xiàn)采用復(fù)合法萃取效果最好，即先讓提取液通過Oasis PRIME HLB柱，再用正己烷對過濾液進行萃取，以達到凈化的目的，把處理后的樣品用UPLC-MS/MS的方法進行檢測。120種藥物殘留在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)達到0.995，其中92種藥物的最低檢出限達到2.0ng·g-1并且回收率很好，均滿足食品質(zhì)量規(guī)范技術(shù)要求[14]164。由此可見，采用固相萃取和液液萃取的方式，測定牛肉、雞肉和羊肉中的120種抗生素藥物殘留的方法，穩(wěn)定性強，回收率高，準確度和精密度也非常理想，能夠滿足多組分抗生素的快速測定。

薛煥等對比QuEChERS樣品前處理方法中，各種提取液、凈化填料的回收率等，結(jié)果顯示，以乙腈為提取溶劑，提取效率最高，以PSA和C18的混合填料比為1:2時，樣品的凈化回收率最好。所得樣品溶液，再結(jié)合纖維膜進一步進行凈化，最后建立UPLC-MS/MS檢測方法。由檢測結(jié)果可知，QuECh-ERS前處理方法具有分析速度快、檢測限低、實驗耗材少，并且能夠同時測定多種喹諾酮類藥物[15]389。因而，此方法能夠滿足對豬肉樣品高通量分析的要求。

三、檢測方法的研究進展

（一）高效液相色譜法

高效液相色譜技術(shù)（high performanceliquid chromatography，HPLC）是利用高壓泵，將流動相送入色譜柱中，樣品隨流動相浸入色譜柱，樣品在色譜柱中，各組分完成分離，最終進入檢測器得到各組分的響應(yīng)信號，從而計算出待測物的含量。HPLC因其檢測速度快、應(yīng)用廣、檢出限低、回收率高等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用到藥物殘留的高通量檢測中。

劉亞梅等采用液液萃取的方法對樣品進行前處理，并建立HPLC同時測定雞蛋中的3種氟喹諾酮藥物殘留的方法，測定結(jié)果顯示，三種藥物的標準溶液在濃度為0.005 mg·L-1—0.05mg·L-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)達到1，達氟沙星的檢出限更是低至0.1ng·g-1，樣品的6個水平加標回收率為91.5%—98.3%[16]306。由此可見，采用HPLC檢測方法測定禽蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，能夠滿足國內(nèi)外標準和法規(guī)的要求，能夠用于禽蛋中喹諾酮類藥物的高通量檢測。

Vakh等采用磁分散固相萃取的方式，對樣品進行預(yù)處理，建立HPLC測定嬰幼兒肉類食品中三種氟喹諾酮類藥物殘留。最終通過優(yōu)化實驗條件，使氟羅沙星、諾氟沙星和氧氟沙星三種藥物在一定濃度線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)達到0.99，樣品回收率達到86%—122%[17]62，并且該方法的最低檢出限低于國家標準要求，證明該方法可以用于嬰幼兒肉類食品中喹諾酮類藥物的高通量檢測。

（二）高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS/MS）是目前用于動物源性食品中獸藥殘留檢測方法最廣泛的一種。待檢測試樣首先通過高效液相色譜的色譜柱，達到各個組分分離的目的，然后進入質(zhì)譜，經(jīng)過分離和離子化，最終形成相應(yīng)的質(zhì)譜圖，進而可以對待測物進行含量分析。HPLC-MS/MS集合了色譜法和質(zhì)譜法的優(yōu)點，特別適用于在動物源性食品中獸藥殘留的檢測，具有分離能力強、藥物殘留檢測限低，檢測結(jié)果準確度高等特點，HPLC-MS/MS已成為氟喹諾酮類藥物殘留檢測的重要手段。

表2所示為不同基質(zhì)中氟喹諾酮類藥物的HPLC-MS/MS檢測方法的比較。通過對各種文獻中流動相的選擇對比可以發(fā)現(xiàn)，由于喹諾酮類抗生素一般帶有羥基，容易形成正離子，流動相的A溶液除了容易揮發(fā)的甲醇或者乙腈等有機物外，還會加入0.1%～0.2%左右的甲酸溶液，以提高離子化效率。為了縮短測定時間并更好地分離不同的FQs藥物殘留，一般采用梯度洗脫的方式。通過加酸和梯度洗脫的方式，來保障樣品在分析過程中的穩(wěn)定性，同時提高色譜的分離效率和縮短檢測時間。高效液相色譜可以對樣品中的成分達到很好的分離效果，從而對樣品進行定性定量的分析，質(zhì)譜可以通過大量碎片信息對定性結(jié)果進一步印證，從而使色譜串聯(lián)質(zhì)譜在樣品定性和定量方面的功能更加強大。近年來三分之二的FQs藥物殘留檢測方法均采用HPLCMS/MS的方法進行檢測。并且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的檢測方法應(yīng)用越來越廣泛。總體來說，HPLC-MS/MS的檢測方法不僅具備了色譜法的超強分離能力，同時還具有質(zhì)譜的超高靈敏度、定性分析能力，可以使測定結(jié)果的準確度更高，結(jié)果更可靠。但是由于HPLC-MS/MS的儀器價格昂貴，限制了它的推廣，導(dǎo)致這種方法在基層工作中難以普及。

表2 不同基質(zhì)中氟喹諾酮類藥物的HPLC-MS/MS檢測方法的比較

（三）超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜

飛行時間質(zhì)譜法是利用不同質(zhì)量的離子在空管無場區(qū)具有不同的速度，到達檢測器的時間不同，而達到分離和檢測的目的。飛行時間質(zhì)譜法具有掃描速度快、準確度高等特點。

李永利等采用優(yōu)化后的QuEChERS方法對牛奶樣品進行前處理，建立同時測定牛奶中多種FQs的UPLC-Q-TOF-MS檢測方法。實驗結(jié)果滿足痕量檢測需求，表明建立的方法可以用于牛奶樣品中氟喹諾酮類藥物的高通量檢測[26]410。宋偉等對待測樣品首先經(jīng)酸化乙腈提取，然后采用碳納米管進行凈化，最終采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法進行一級初篩及二級確證的方法進行測定，從而建立了一種簡便、快速、準確的高通量快速測定蟹肉中39種獸藥殘留的快速檢測方法，同時也為其他水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測提供方法參考[27]1267。鄭明明采用固相萃取的方法對牛奶、雞肉、雞蛋等樣品進行前處理，從而建立雞蛋、雞肉等食品中藥物殘留的UPLC-Q-TOF-MS檢測方法。樣品用聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體式柱進行萃取，并采用上述方法進行檢測。結(jié)果顯示，所采用的前處理方法良好，檢測結(jié)果中沒有基體的干擾，該方法可以用于多種食品中喹諾酮類藥物殘留的高通量檢測[28]7517。

四、小結(jié)和展望

動物源性食品中氟喹諾酮類藥物的高通量檢測方法中，樣品預(yù)處理方法和檢測條件優(yōu)化兩個方面對檢測結(jié)果的準確度和精密度起著至關(guān)重要的作用。一方面，樣品前處理時藥物殘留提取率較低。可以通過降低提取液中的基質(zhì)效應(yīng)，提高樣品中藥物殘留的回收率，提高實驗結(jié)果的準確度。為了解決這一瓶頸問題，常采用的前處理方法是在傳統(tǒng)樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，融入現(xiàn)代新技術(shù)。比如，超聲或微波技術(shù)、分子印跡技術(shù)或磁性吸附技術(shù)等，通過與新技術(shù)的結(jié)合提高了藥物殘留的提取率，降低了環(huán)境的污染，提高了最終測量結(jié)果的準確度。另一方面，選擇合適的檢測方法，提高檢測準確度。隨著新技術(shù)、新設(shè)備和新材料的不斷問世，HPLC、HPLCMS、UPLC-MS等方法被廣泛地應(yīng)用到氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。最常用的檢測方法是UPLC-MS，其具有檢測快速、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但同時因其儀器昂貴、對樣品前處理要求高等特點，在一定程度上限制了其在基層的推廣，同時在檢測過程中，基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果在定性定量方面影響較大。因而找到選擇性高，能有效降低基質(zhì)效應(yīng)的新型材料，并把其應(yīng)用到樣品提取上，同時研究出選擇性更高的色譜柱，分辨率更高的檢測器，是目前提高動物源性食品中氟喹諾酮類殘留高質(zhì)量檢測的重要途徑。