cGAS-STING信號通路在先天性免疫中的作用研究進展

于思慧，單朝萌，文雪霞，張 瑩

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 動物科學與醫(yī)學學院/東北畜禽疫病研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽 110161)

先天性免疫是動物機體抵抗病原微生物感染的第一道防線，同時也是激活適應性免疫的必要條件，對動物機體抵御外界微生物感染至關重要。當外界病原微生物入侵動物機體時，先天性免疫細胞通過其表面的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引發(fā)信號級聯(lián)反應，最終促進Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子表達上調，啟動細胞自主防御機制。

cGAS-STING信號通路是先天性免疫的重要組成部分。該信號通路包括環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)和干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)兩個主要因素。病原入侵宿主細胞時會釋放各種病原相關分子模式，病毒和細菌的雙鏈DNA是非常重要的PAMPs，它們可激活cGAS，使其構象發(fā)生變化，進而催化合成環(huán)鳥嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸(2′,3′-cyclic GMP-AMP，cGAMP)。cGAMP行使第二信使功能，結合并激活STING，活化的STING可招募并活化細胞內(nèi)TANK連接激酶1(TANK binding kinase-1，TBK1)。而TBK1可磷酸化干擾素調節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)，使其活化形成二聚體并易位至細胞核，從而激活I型干擾素基因的轉錄。此外，cGAS-STING信號通路也可通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)誘導炎性細胞因子產(chǎn)生。論文對cGAS-STING信號通路激活先天性免疫的分子機制及病毒通過該信號通路調控機體先天性免疫策略的研究進展進行綜述，以期為研究cGAS-STING信號通路及其與病毒間的相互作用提供參考。

1 cGAS-STING信號通路介導先天性免疫

1.1 cGAS的激活

宿主細胞的PRRs識別細胞不同部位的PAMPs，是觸發(fā)先天性免疫反應的第一步。cGAS作為一種模式識別受體，主要識別胞質DNA。外源病原微生物DNA是激活cGAS的主要誘因。除此之外，cGAS也可以識別各種類型的內(nèi)源性DNA，包括細胞核DNA和線粒體來源的胞質DNA[1]。cGAS通常存在于細胞質中，也定位于細胞膜和細胞核。但在細胞核中，cGAS暴露于染色體DNA時，如何區(qū)分染色體DNA和與感染相關的DNA，阻止其識別自身DNA，或使其駐留在核中卻保持失活的機制尚不清楚。

cGAS含有核苷酸轉移酶結構域和2個DNA結合結構域[2]。沒有DNA存在時，cGAS處于失活狀態(tài)。當與DNA結合后，cGAS形成二聚體，并與兩個雙鏈DNA分子形成2∶2復合物(圖1)，暴露出2個酶活性位點[2,3]。DNA結合并激活cGAS與其長度密切相關，DNA的長度越長，其激活cGAS的效力越強[4-6]。理論上，16 bp～18 bp的DNA足以激活cGAS。但是，在體外誘導cGAS催化活性時發(fā)現(xiàn)，小于20 bp的DNA與cGAS催化結構域的結合較弱。只有在cGAS濃度很高的情況下，小于20 bp的DNA才能有效誘導cGAS的催化活性[2,7]，較短的雙鏈DNA在低cGAS濃度時無法有效激活cGAS的原因可能是 cGAS濃度較低時不會形成二聚體。有意思的是，結合并激活不同物種cGAS活性的DNA長度存在差異。相較于人源cGAS，短的雙鏈DNA更易激活鼠源cGAS的催化活性[8]。研究表明，即使人源cGAS濃度很高，長度小于40 bp的DNA也無法激活人源cGAS的酶活性[4-5]。

cGAS被激活后催化生成2′,3′-cGAMP，該過程涉及在同一催化位點進行兩個不同的化學反應。第一步，cGAS以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和三磷酸鳥苷 (guanosine triphosphate,GTP)為底物，將ATP轉移到GTP的2′OH上，生成線性異二核苷酸磷酸酯pppG(2′-5′)pA。第二步，cGAS以線性pppG(2′-5′)pA為底物，將GTP部分分子轉移到腺苷磷酸核苷的3′OH上[1]。cGAMP是第一個在多細胞生物中發(fā)現(xiàn)的環(huán)二核苷酸，在胞質DNA識別過程中發(fā)揮第二信使的功能，可以結合并激活STING[9]。

環(huán)狀GMP-AMP合酶(cGAS)識別DNA配體并被其激活形成二聚體，活化的cGAS產(chǎn)生環(huán)狀二核苷酸2′,3′-環(huán)狀GMP-AMP(2′,3′-cGAMP)。cGAMP結合干擾素基因刺激物(STING)，使其激活TBK1磷酸化IRF3。IRF3磷酸化后形成二聚體易位至細胞核激活Ⅰ型干擾素基因的轉錄。cGAS-STING信號轉導也通過NF-κB(虛線)誘導促炎細胞因子基因的表達。方框中為本文介紹到的經(jīng)由該通路關鍵蛋白調控先天性免疫的病毒。Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)recognizes the DNA and then is activated to form dimers.The activated cGAS produces the cyclic dinucleotide 2′,3′-cyclic GMP-AMP (2′,3′-cGAMP),which binds to the stimulator of interferon genes (STING)to activate TBK1 to phosphorylate IRF3.After phosphorylation,IRF3 forms a dimer and translocates to the nucleus to activate the transcription of type I interferon genes.cGAS-STING signal transduction also induces the expression of pro-inflammatory cytokine genes through NF-κB (dotted line).These viruses that mentioned in this article are shown in box regulate innate immunity through key proteins in this pathway introduced.圖1 cGAS-STING信號通路及通過該通路關鍵蛋白調控先天性免疫的病毒Fig.1 cGAS-STING signaling pathway and viruses that regulate innate immunity through key proteins in this pathway

1.2 STING的激活

STING是一個多結構域的跨膜蛋白，主要定位于內(nèi)質網(wǎng)膜，部分定位于線粒體和線粒體相關膜上[10]。其中，N端4個跨膜結構域主要負責將其錨定于膜結構上，C端的球狀結構域包括二聚化結構域(dimerization domain，DD)和C端尾結構域(C-terminal tail，CTT)面向細胞質。結構域DD高度保守，對STING遷移至核周區(qū)域、活化下游信號通路非常重要；結構域CTT則主要負責招募、活化TBK1和IRF3[11]。STING以二聚體形式結合在內(nèi)質網(wǎng)膜上，兩個STING分子的跨膜結構域發(fā)生交換，并通過螺旋與朝向細胞質的C端結構域連接。STING二聚體的DD結構域形成一環(huán)狀二核苷酸的V形配體結合袋[12]。

cGAMP和STING的DD結構域結合后，STING二聚體構象發(fā)生變化，其DD結構域相對于跨膜部分順時針旋轉180°，這種構象變化促進STING分子并排進行側向寡聚化。研究發(fā)現(xiàn)，人源STING的寡聚化由連接跨膜結構域和DD結構域螺旋中148位半胱氨酸促進，表明STING活化幾乎不可逆[1]。STING的寡聚化決定STING在細胞內(nèi)亞定位的改變[13-14]。結合cGAMP后，STING發(fā)生寡聚化的同時，其在細胞內(nèi)的亞定位也從內(nèi)質網(wǎng)轉運至高爾基體，后又至細胞核周圍，并形成大的點狀結構。布雷非德菌素A能夠抑制STING的轉移，進而抑制下游信號通路的激活，這說明STING的易位對于其信號通路的激活非常必要[15]。STING易位在信號轉導中的重要性意味著STING的跨膜結構域在調節(jié)其活性中也發(fā)揮重要作用。

1.3 IRF3的激活

從內(nèi)質網(wǎng)轉移至核外周小體后，STING發(fā)生磷酸化修飾[15]。STING蛋白CTT結構域包含一高度保守的TBK1結合基序[16-17]，通過該基序STING可與TBK1結合。IRF3結合基序(pLxIS基序)緊鄰TBK1基序，與IRF3激活密切相關[18-19]。研究表明，穩(wěn)態(tài)條件下，定位于內(nèi)質網(wǎng)上的非活化STING二聚體上已結合了大量的TBK1[17]。但是，該狀態(tài)下存在空間位阻，阻止TBK1發(fā)生反式磷酸化，故這些TBK1未被激活[1]。

當STING和cGAMP結合發(fā)生寡聚化時，其CTT結構域上結合的“順式”TBK1分子與相鄰二聚體的“反式”TBK1分子緊鄰，“反式”TBK1分子的環(huán)可接近“順式”分子激酶結構域的催化中心，使得TBK1可以反式磷酸化并激活緊密相鄰的TBK1分子。活化的TBK1催化STING磷酸化，使其CTT結構域上pLxIS基序(p代表親水性氨基酸，L代表亮氨酸，x代表任意氨基酸，I代表異亮氨酸，S代表絲氨酸)的絲氨酸殘基磷酸化，pLxIS基序即成為IRF3的結合位點[19]。研究表明，TBK1僅能磷酸化相鄰STING二聚體的CTT結構域，而對與其結合STING二聚體的CTT結構域則無此作用。STING被磷酸化后，通過pLxIS基序與IRF3結合，由于pLxIS基序緊靠具有催化活性的TBK1分子，IRF3可被緊靠的TBK1磷酸化[13,16]。隨后，IRF3發(fā)生二聚化后進入細胞核，與共同活化因子CBP/p300(CREB binding protein/adenoviral E1A binding protein of 300 ku)結合發(fā)揮轉錄活性，最終激活I型干擾素基因的轉錄。

1.4 STING通路激活NF-κB

目前，STING介導的cGAS-STING通路激活NF-κB的機制尚不明確。一方面，研究表明TBK1在NF-κB活化的上游起作用[20-21]。另一方面，也有研究表明該功能不需要STING的CTT結構域[15,22]，說明激活NF-κB不需要TBK1發(fā)揮作用。激活不含CTT結構域的STING，仍會激活NF-κB。因此，STING活化NF-κB可能受到寡聚化STING的DD結構域的調控[15,22]。

2 病毒通過cGAS-STING信號通路調控先天性免疫

cGAS-STING信號通路由兩個重要因素構成，即cGAS和STING。病毒激活信號通路后，通過不同作用靶點影響信號通路發(fā)揮作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，許多病毒可靶向STING蛋白調控該信號通路誘導的先天性免疫反應。也有研究發(fā)現(xiàn)，一些病毒可通過該信號通路上蛋白分子cGAS、TBK1調控先天性免疫。

2.1 病毒靶向cGAS調控先天性免疫

cGAS是細胞質內(nèi)DNA感受器，許多DNA病毒，包括皰疹病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒等均可以調控cGAS-STING信號通路，但通過靶向作用于cGAS蛋白影響信號通路激活的病毒較少。人類皰疹病毒8型(Human herpes virus 8，HHV-8)，即卡波濟氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)為一種嚴重威脅人類健康的皰疹病毒。該病毒編碼的ORF52蛋白可通過與被感染宿主細胞的cGAS結合，直接抑制cGAS的酶活性[23]。ORF52蛋白也可與cGAS競爭性結合DNA底物[24]。cGAS活性受到抑制，cGAS-STING信號通路無法啟動，其下游STING-IRF3的功能不能發(fā)揮，先天性免疫受到抑制，導致機體清除病毒的能力減弱。其他皰疹病毒，如羅斯河病毒(Ross river virus，RRV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的ORF52蛋白同源物也具有類似作用[23]。

2.2 病毒靶向STING調控先天性免疫

許多病毒可通過和STING互相作用，導致下游信號轉導受阻，從而逃避機體先天性免疫，但不同病毒和STING相互作用機制不盡相同。下面分別從DNA病毒和RNA病毒兩方面闡述其具體機制。

皰疹病毒是一類具有囊膜的DNA病毒，已有研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒編碼的多種蛋白均可拮抗cGAS-STING通路的激活，從而逃避宿主先天性免疫。單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)是皰疹病毒的代表種，也是已報道的第一種在體內(nèi)外均可激活STING的DNA病毒，在試驗系統(tǒng)中被廣泛用作cGAS-STING通路的激活劑。敲除STING的小鼠感染HSV-1后，機體I型干擾素產(chǎn)生受到抑制，最終導致死亡[25]。除ORF52蛋白靶向cGAS外，KSHV編碼的另一蛋白，干擾素調節(jié)因子1也可與STING相互作用，阻止STING與TBK1結合，進而抑制STING磷酸化[26]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)聚合酶是唯一抑制STING介導的β干擾素(interferon-β，IFN-β)啟動子激活的HBV編碼蛋白。HBV聚合酶的逆轉錄酶或RNase H結構域可抑制STING信號轉導[27]。人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一種普遍存在的DNA病毒。HPV編碼的E7蛋白可與STING結合，從而有效抑制DNA激活的抗病毒反應，且研究發(fā)現(xiàn)，E7蛋白與成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)結合的LXCXE基序(L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸，C代表半胱氨酸，E代表谷氨酸)對于拮抗cGAS-STING通路的激活也是必需的。缺失E7蛋白的HPV毒株感染可誘導宿主產(chǎn)生大量的I型干擾素[28]。與HPV的E7蛋白類似，腺病毒編碼的E1A蛋白也可通過其LXCXE基序拮抗STING功能，抑制DNA病毒誘導的抗病毒反應[28]。

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類RNA病毒。研究發(fā)現(xiàn)，人冠狀病毒NL63(Human coronavirus NL63，HCoV-NL63)Nsp3蛋白膜定位的木瓜樣蛋白酶結構域2(papain like protease 2-transmembrane domain，PLP2-TM)與STING共定位并相互作用[29]。PLP2-TM可阻止STING二聚體的形成以及STING-TBK1相互作用，且可減弱STING的K63泛素化修飾。豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)編碼的Nsp3蛋白PLP2結構域也已報道可與STING相互作用并抑制STING的K63泛素化修飾。但是，兩種病毒Nsp3發(fā)揮抑制作用的機制稍有差異，HCoV-NL63的Nsp3蛋白不一定需要PLP2-TM的去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)活性，而對于PEDV而言，DUB活性則是必需的[30]。SARS冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)編碼的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(papain like protease，PLpro)也可抑制STING活化。與HCoV-NL63相似，SARS-CoV的PLpro也負調控STING二聚體形成和K63泛素化修飾，提示此功能可能為冠狀病毒科木瓜蛋白酶樣蛋白酶結構域的保守功能[29,31]。與冠狀病毒類似，黃病毒科病毒也是一類有囊膜的單正鏈RNA病毒。已有研究證明，黃病毒科病毒的NS4B蛋白可通過STING蛋白調控先天性免疫。黃熱病病毒(Yellow fever virus，YFV)的非結構蛋白NS4B可與STING共定位并相互作用，進而阻止STING和視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I)依賴的信號傳導[32]。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)NS4B蛋白與STING相互作用，阻止STING和TBK1結合[33]。NS4B也與內(nèi)質網(wǎng)中的STING共定位從而減弱STING-TBK1的相互作用。此外，同皰疹病毒一樣，黃病毒也進化出不同的機制來阻斷STING激活。登革病毒(Dengue virus，DENV)編碼的NS2B/3蛋白可作用于人源STING蛋白第93位至第96位氨基酸(LRRG)對其進行裂解和降解。鼠源STING蛋白無該氨基酸序列，故NS2B/3蛋白不能裂解鼠源STING蛋白，繼而也不可阻斷cGAS-STING信號通路誘導的IFN-β的產(chǎn)生[34]。

2.3 病毒靶向TBK1調控先天性免疫

細胞內(nèi)多條誘導先天性免疫的信號通路需要TBK1蛋白的參與。本文主要闡釋病毒通過cGAS-STING信號通路靶向TBK1調控先天性免疫應答的機制。HSV-1的皮層蛋白UL46是HSV-1拮抗宿主抗病毒免疫應答的重要蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，UL46在外源表達和病毒感染時均不能影響STING的表達，而是直接與STING下游TBK1相互作用，抑制TBK1的活化，削弱TBK1與IRF3的相互作用，阻礙TBK1對IRF3的激活，從而阻斷干擾素的產(chǎn)生[35]。

3 展望

cGAS-STING信號通路的發(fā)現(xiàn)和研究使人們對細胞感應、識別外源DNA從而誘導產(chǎn)生相應分子抑制外源微生物感染的機制有了更為全面和深入的理解和認識。雖然，關于該方面的研究不斷取得重要進展，但是仍有很多科學問題有待進一步闡釋。諸如，cGAS-STING信號通路不僅可識別病毒DNA，還可識別自身DNA。但是，目前尚不清楚cGAS在細胞核中如何區(qū)分染色體DNA和與感染相關的DNA，進而阻止對自身DNA的識別。病毒在感染宿主過程中，不斷進化出各種策略拮抗宿主的先天性免疫反應。深入研究不同病毒逃逸機體先天性免疫機制，一方面有利于解析病毒的致病機理，從而開發(fā)有效的疫苗和藥物；另一方面有助于全面透徹理解宿主的先天性免疫反應。