長鏈非編碼RNA HOTAIR對胰腺癌細胞增殖、遷移能力的影響

成洪杰，張 曉，崔培林

1.首都醫(yī)科大學大興教學醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 102600；2.北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院；3.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院國際醫(yī)療部綜合內(nèi)科

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高。根據(jù)最新中國癌癥城市報告[1]，2013年中國城市居民中，胰腺癌發(fā)病率為6.95/10萬，死亡率為6.18/10萬，且發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢。胰腺癌的早期診斷困難，就診時，只有不足20%的患者適合接受手術(shù)治療；晚期治療困難，進展期胰腺癌患者的中位生存時間不足6個月[2]。鑒于胰腺癌惡性程度高、早期診斷難、晚期治療難、易發(fā)生局部浸潤和全身轉(zhuǎn)移，深入探索胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，發(fā)現(xiàn)潛在臨床治療靶點尤為重要[3]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子總稱。研究[4-6]顯示，lncRNA在多種腫瘤中存在異常表達，與肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等密切相關(guān)，lncRNA可通過調(diào)控基因表達，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預后等。近年來，有關(guān)lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了越來越多的關(guān)注。研究[2-3]表明，多種lncRNA在胰腺癌組織中存在異常表達，lncRNA可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。HOTAIR、MALAT1、H19、gas5、HOTTIP、PVT-1等多種lncRNA與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后有明顯相關(guān)性。

HOX的反義基因間RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)與胰腺癌有關(guān)的lncRNA分子，長度為2 158 bp，位于染色12q13.13的HoxC位點。近年來研究表明，HOTAIR在乳腺癌、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌等存在異常表達[7-11]，HOTAIR高表達增加了腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。研究[2-3]表明，HOTAIR可能是一種原癌基因，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。研究[12]發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在胰腺癌組織中表達水平顯著上調(diào)，與胰腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處浸潤密切相關(guān)，并且異常表達HOTAIR還是影響胰腺癌患者臨床預后的重要因素之一，高表達水平的HOTAIR預示著較短的生存期。

目前，關(guān)于HOTAIR在胰腺癌中作用的報道仍然較少，研究尚處于初步階段，HOTAIR在胰腺癌中的生物學功能尚不明確，具體發(fā)揮作用途徑和分子機制更是知之甚少。因此，本研究體外培養(yǎng)胰腺癌細胞，旨在研究HOTAIR對胰腺癌細胞增殖、遷移等影響，為胰腺癌的臨床靶點治療提供可能的方向和實驗依據(jù)，為胰腺癌的診斷和治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1和Panc-1購自美國ATCC細胞中心；DMEM高糖培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、青鏈雙抗購自美國Gibco公司；Trizol試劑、質(zhì)粒表達載體pcDNA3.1、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；小干擾RNA(siRNAs)和陰性對照siRNA(si-NC)由北京健坤禾潤科技有限公司代購；CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所；Transwell小室購自美國Millipore公司；GoScriptTMReverse Transcription System A5001購自美國Promega公司；GoTaq?qPCR Master Mix A6001購自美國Promega公司；RQ1 Rnase-Free Dnase M610A購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人胰腺癌細胞(Panc-1、AsPC-1)用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，補充含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，當細胞融合度為80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 獲取目的基因和構(gòu)建質(zhì)粒：查閱基因文庫，發(fā)現(xiàn)并找到人胰腺癌細胞目的基因HOTAIR轉(zhuǎn)錄mRNA核苷酸序列，利用qRT-PCR技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA再擴增形成一個全長的HOTAIR片段，用于擴增的HOTAIR的寡核苷酸序列為：上游：5′-CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3′，下游：5′-ACTCT-CGAGCCACCACACACACACAACCTACAC-3′，分別包含外源性Hind Ⅲ和Xho Ⅰ位點。驗證PCR的產(chǎn)物并亞克隆至哺乳動物表達載體pcDNA3.1中。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞：取對數(shù)生長期胰腺癌細胞接種于細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁且融合度為40%～60%時，通過Lipofectamine 2000進行載體及對照組的轉(zhuǎn)染，具體方法參見產(chǎn)品說明書。注意轉(zhuǎn)染前更換為無血清培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后6 h更換含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清培養(yǎng)液。第一步轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOTAIR至人胰腺癌細胞(Panc-1、AsPC-1)中，以空白pcDNA載體(pcDNA3.1-NC)作陰性對照(陰性對照組)，空試劑做空白處理(試劑空白組)。第二步轉(zhuǎn)染HOTAIR基因小干擾RNA(siRNA-HOTAIR)至人胰腺癌細胞(Panc-1、AsPC-1)中。應(yīng)用3條獨立的小干擾RNA(siRNA-HOTAIR-1187、siRNA-HOTAIR-83、siRNA-HOTAIR-1524)分別轉(zhuǎn)染兩株胰腺癌細胞，尋找并發(fā)現(xiàn)HOTAIR干擾敲低率最佳的siRNA。以陰性siRNA(si-NC)作對照，空試劑做空白處理。3個獨立的HOTAIR siRNA靶序列分別為：siRNA-HOTAIR-1187：5′-GCACUGUCUCUCAAAUAAUTT-3′；siRNA-HOTAIR-83：5′-GCACAUUCUGCCCUGAUUUTT-3′；siRNA-HOTAIR-1524：5′-GCCUUUGCUUCGUGCUGAUTT-3′。

1.2.4 qRT-PCR檢測HOTAIR表達量：收集轉(zhuǎn)染后48 h的胰腺癌細胞，按Trizol試劑說明書提取HOTAIR總RNA。使用GoScriptTMReverse Transcription System和GoTaq?qPCR Master Mix進行qRT-PCR分析，檢測HOTAIR表達水平，結(jié)果用磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)的表達量進行標準化。HOTAIR的PCR上游引物：5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。分析qRT-PCR的結(jié)果并計算其相對于臨界循環(huán)次數(shù)的值，然后轉(zhuǎn)換為相對GAPDH的倍數(shù)改變，采用2-ΔΔCt法進行標準化。

1.2.5 CCK8法檢測細胞增殖活力：取對數(shù)生長期的胰腺癌細胞以起始1.0×103個/孔接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μl，24 h后轉(zhuǎn)染，每株胰腺癌細胞均設(shè)立實驗組和陰性對照組(NC)，每組設(shè)置5個復孔。向每孔加入10 μl CCK溶液，注意不要在孔中生成氣泡，否則會影響吸光度值(OD)的讀數(shù)。分別于轉(zhuǎn)染后0 d、1 d、2 d、3 d和4 d檢測細胞增殖。

1.2.6 Transwell細胞遷移實驗：胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染后48 h進行Transwell細胞遷移實驗。將胰腺癌細胞消化后鋪在transwell小室上層，起始數(shù)量為2.0×104個/100 μl。含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl位于下層。24 h取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)壁一面細胞，外側(cè)細胞結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照。之后2% SDS裂解細胞(600 μl)。之后移入96孔板檢測OD值。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在人胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1和Panc-1的表達情況

2.1.1 AsPC-1細胞：HOTAIR轉(zhuǎn)染成功過表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AsPC-1的敲低取得成功，siRNA-1187檢測到最高敲低率，約為89.6%。其余兩條分別為 43.8%(siRNA-83)，74.3%(siRNA-1524)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1、圖1)。PCR擴增曲線和熔解曲線良好，擴增產(chǎn)物特異性良好(以AsPc-1過表達為例，見圖2)。

2.1.2 Panc-1細胞：HOTAIR轉(zhuǎn)染成功過表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Panc-1的敲低取得成功，siRNA-83敲低率最高，相對陰性白質(zhì)粒對照組平均值，敲低效率約為62.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2、圖3)。PCR擴增曲線和熔解曲線良好，擴增產(chǎn)物特異性良好。

表1 AsPC-1細胞中HOTAIR相對表達量Tab 1 The relative expression of HOTAIR in AsPC-1

圖1 AsPC-1細胞HOTAIR過表達(A)和敲低(B)Fig 1 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in AsPC-1

圖2 AsPC-1過表達擴增曲線(A)和AsPC-1過表達熔解曲線(B)Fig 2 Amplification curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (A) and melting curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (B)

表2 Panc-1細胞中HOTAIR相對表達量Tab 2 The relative expression of HOTAIR in Panc-1

2.2 HOTAIR對人胰腺癌細胞AsPC-1和Panc-1增殖的影響

2.2.1 AsPC-1細胞：HOTAIR過表達組與空載體對照組相比，細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖4A)，這可能與HOTAIR本身在AsPC-1細胞中的高表達相關(guān)。但HOTAIR敲低實驗中，3組HOTAIR敲低表達的細胞增殖能力普遍弱于陰性對照組，0～2 d此趨勢較明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖4B)。

2.2.2 Panc-1細胞：跟蹤細胞生長狀況表明，相比陰性對照組，0～3 d過表達HOTAIR組呈生長優(yōu)勢；相比陰性對照組，HOTAIR敲低效率較高的siRNA-83和siRNA-1187組增殖能力減弱(見圖5)。

圖3 Panc-1細胞HOTAIR過表達(A)和敲低(B)Fig 3 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in Panc-1

圖4 AsPC-1細胞HOTAIR過表達(A)和敲低(B)對細胞增殖的影響Fig 4 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in AsPC-1

圖5 Panc-1細胞HOTAIR過表達(A)和敲低(B)對細胞增殖的影響Fig 5 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in Panc-1

2.3 HOTAIR對人胰腺癌細胞AsPC-1和Panc-1遷移的影響

2.3.1 AsPC-1細胞：Transwell結(jié)果表明，相比陰性對照組，過表達HOTAIR組細胞遷移能力增強。siRNA-1187轉(zhuǎn)染的細胞遷移能力明顯下降，而siRNA-83和siRNA-1524變化相對陰性對照組不明顯(見圖6)。

2.3.2 Panc-1細胞：Transwell結(jié)果表明，相比陰性對照組，過表達HOTAIR組細胞遷移能力增強。敲低效率較高的siRNA-83和siRNA-1187轉(zhuǎn)染的細胞遷移能力明顯下降，而siRNA-1524變化相對陰性對照組不明顯(見圖7)。

注：A1為HOTAIR過表達組，A2為A1的陰性對照組，B1為siRNA-1187組，B2為B1的陰性對照組，圖片均放大100倍。

注：A1為HOTAIR過表達組，A2為A1的陰性對照組,B1為siRNA-83組，B2為B1的陰性對照組，圖片均放大100倍。

3 討論

胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早，早期診斷困難，晚期治療困難，預后較差。目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療為主，雖然患者術(shù)后中位生存期延長，但生存質(zhì)量并未得到顯著提高。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展機制和靶向治療尤為重要。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子總稱。近年來研究[7-11]表明，lncRNA與肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，HOTAIR高表達可能增加了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，HOTAIR高表達常常提示腫瘤患者不良的預后。

近年來，有關(guān)lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了越來越多的關(guān)注，為臨床上胰腺癌的早期診斷、治療和預后提供了新的方向。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在胰腺癌組織中表達水平顯著上調(diào)，與胰腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處浸潤密切相關(guān)，并且高表達水平的HOTAIR常預示著較短的生存期。但關(guān)于HOTAIR在胰腺癌中作用的報道仍然較少，研究尚處于起步階段。

HOTAIR由Rinn等[13]于2007年首次發(fā)現(xiàn)并描述，是第一個被發(fā)現(xiàn)以反式轉(zhuǎn)錄干預基因表達的lncRNA。HOTAIR僅存在于哺乳動物中，由2 185個核苷酸組成，位于染色體12q13.13的HOXC11與HOXC12之間，包括6個外顯子[14]。

HOTAIR有分子骨架的作用，具有特異性雙向結(jié)合能力，能同時結(jié)合兩種不同的組蛋白修飾復合體，并可能起到協(xié)調(diào)兩者功能的作用。其5′端與多梳抑制復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的核心組成部分之一EZH2結(jié)合，可使組蛋白H3第27位的賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，介導PRC2至特定位點來沉默HOXD基因座及相關(guān)抑癌基因如HOXD10、JAM2、PCDH的轉(zhuǎn)錄從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移復發(fā)；而3′端與賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶復合體(LSD1/CoREST/REST)結(jié)合，可使組蛋白H3第4位的賴氨酸去甲基化(H3K4deme)[15]，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性，在染色體層面調(diào)控目的基因活性[16]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可以通過PRC2依賴性和PRC2非依賴性兩種途徑來介導下游基因表達調(diào)控，但HOTAIR發(fā)揮調(diào)控作用的機制仍不完全清楚。

本研究體外培養(yǎng)胰腺癌細胞，通過調(diào)控HOTAIR在胰腺癌細胞中的表達水平，對其增殖、遷移能力進行分析。本研究發(fā)現(xiàn)，在HOTAIR過量表達實驗中，HOTAIR過量表達可增強Panc-1細胞增殖能力，但對AsPC-1細胞增殖無影響，我們分析可能與HOTAIR在AsPC-1細胞本身呈高表達狀態(tài)相關(guān)，進一步上調(diào)HOTAIR在AsPC-1的表達水平，其促進胰腺癌細胞增殖的作用和效果可能不顯著；同時，過表達的HOTAIR可以同時增強AsPC-1細胞、Panc-1細胞的遷移能力。在HOTAIR敲低實驗中，通過下調(diào)HOTAIR在胰腺癌細胞的表達水平，可以顯著抑制AsPC-1細胞、Panc-1細胞的增殖和遷移能力，這與前人研究結(jié)果相吻合，提示HOTAIR可能促進了胰腺癌的發(fā)展，HOTAIR高表達可能與預后不良相關(guān)[12]。

綜上所述，本研究表明，HOTAIR高表達可以增強胰腺癌細胞的增殖和遷移能力，下調(diào)HOTAIR表達會抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移能力，但由于人胰腺癌細胞種類較多，本研究只對AsPC-1和Panc-1兩株胰腺癌細胞進行了研究，將來的研究可能涉及更多不同種類的胰腺癌細胞系，研究結(jié)果可能與本研究有所差異。此外，本研究僅是體外實驗，研究結(jié)果尚需要進一步體內(nèi)實驗和臨床試驗的證實。