2型糖尿病和糖尿病腎病患者腸道菌群失衡模式及功能變化的研究

馮真真，錢 磊，趙 琳，霍劍鋒，倪 軍

中國人民解放軍陸軍第八十三集團軍醫(yī)院 1.檢驗科；2.血液內分泌科，河南 新鄉(xiāng) 453000

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是臨床比較常見的內分泌失調疾病，在疾病的發(fā)展過程中會出現各種不同程度的并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)則是其中的一種。在國外的研究中發(fā)現[1]，T2DM患者普遍存在腸道菌群失衡的問題，且腸道菌群失衡模式主要表現為優(yōu)桿菌屬和產丁酸菌、羅斯菌的降低。我國在針對此情況調查時也發(fā)現了T2DM存在腸道菌群失衡的問題，但其失衡模式主要表現為產丁酸鹽細菌的下降和機會致病菌的上升[2]。相關研究指出，T2DM患者出現腸道菌群改變后出現了慢性炎癥的癥狀，進而導致DKD的發(fā)生。DKD的發(fā)生率可達30%，比例相對較高，其患病后的生存周期僅為10年左右[3]。從相關研究中可發(fā)現，腸道菌群產物可通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)對腎臟功能產生影響[4]，并且DKD患者也出現了產短鏈脂肪酸細菌減少的情況。雖然T2DM患者和DKD患者均會出現菌群失調的情況，但其失衡程度以及相關性卻尚不清晰，因此，我們在本文中對T2DM和DKD患者進行了研究，并針對二者的腸道菌群失衡狀態(tài)以及功能的變化進行分析，具體研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2018年9月至2019年10月我院收治的T2DM和DKD患者作為研究對象，每組均納入30例，并設定其為T2DM組和DKD組，同時選取健康體檢者作為對照組，同樣納入30名。T2DM組患者年齡(61.5±2.6)歲(56～67歲)，男12例，女18例。DKD組患者年齡(62.3±2.8)歲(56～68歲)，男15例，女15例。對照組年齡(63.2±2.1)歲(56～70歲)，男15名，女15名。三組的一般資料相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可進行組間對比。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的審批(審批號：83YY2022001LLSP)。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集和處理：選用標本為新鮮糞便標本和血清標本。血清標本中的靜脈血白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的檢測方法為化學發(fā)光法，C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)的檢測方法為免疫比濁法[5]。血液標本采集樣本量為3 ml，將其使用無抗凝劑采血管保存，并以相對離心力1 000×g進行離心，離心時間為10 min，將血清成功分離后保存于冰箱內，環(huán)境為-80 ℃。糞便標本的采集：T2DM組和DKD組患者在入院后的48 h內采集新鮮糞便標本，對照組則在體檢當天進行鮮糞便標本的采集。糞便標本處理方法[5]：取糞便的中心部分5～10 g，將其放入無菌EP管內進行保存，保存環(huán)境為-80 ℃。實驗應用試劑盒均由恒瑞生物有限公司提供，操作時按照試劑盒使用說明書進行。

1.2.2 16S rDNA-V4區(qū)DNA擴增及測序：模板為糞便提取DNA，按照Qiagen試劑盒說明書(QiaAmp DNA Stool Mini Kit)，通過PCR對菌16S rDNA-V4可變區(qū)進行擴增[6]。擴增體系為20 μl，模板為2 μl。操作步驟：94 ℃進行預變性，時間為2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，將其保存在10 ℃環(huán)境下。反應結束后，將純化物統(tǒng)一收集，按照操作樣品制備試劑盒(IlluminaTruseqTMDNA)說明書操作進行測序準備，測序平臺為Illumina高通量測序平臺，根據其質量檢驗標準對比測定結果，如果實驗結果出現以下菌門為主則代表實驗質量較好，具體為擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門。

1.2.3 血清學指標檢測：使用Roche E601儀器和配套試劑檢測IL-6水平，使用SIEMENS BNP儀器和配套試劑檢測CRP。檢測時將質量控制在允許誤差范圍內。

1.2.4 數據處理和菌群結構分析：數據進行原始序列處理[QIIME(v1.9.1)]，將處理后的數據與Greengenes(v13_8)數據庫進行對照[7]，分析菌群結構的多樣性。菌群α多樣性分析：應用PD_whole_tree分析。采用LEfSe對三組中差異有統(tǒng)計學意義的腸道菌群進行比較。腸道菌群功能測定分析：采用PICRUSt宏基因組進行16S rRNA的基因序列測定，觀察基因組功能[8]。將其與京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和京都基因數據庫進行對比[9]，并進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 三組在門水平上菌群構成情況三組腸道主要菌群構成均為正常生理構成，但疣微菌門和梭桿菌門所占比例相對較低(見表1)。

表1 三組在門水平上菌群構成情況Tab 1 The composition of the flora at the phylum level in the 3 groups

2.2 T2DM組和DKD組患者腸道菌群α多樣性腸道菌群α多樣性對比顯示對照組較高，T2DM組和DKD組較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T2DM組與DKD組之間腸道菌群的α多樣性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖1A、1B和1C)。使用PCoA對三組之間以及T2DM組和DKD組的β多樣性變化進行評價，圖1D、1E和1F中的每個點代表了一個樣品，點與點之間距離代表不同的菌群結構，以腸道菌群是否出現偏差作為統(tǒng)計學意義標準，結果顯示，三組之間的腸道菌群差異出現了偏差，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但T2DM組與DKD組之間則未出現偏差，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A～C圖為α多樣性，D～F圖為β多樣性。

2.3 T2DM與DKD患者腸道菌群一致的變化信號與疾病特異性失衡模式使用LEfSe對T2DM組、DKD組、對照組之間的腸道菌群變化特征進行分析(見圖2)。T2DM組與DKD組變化存在大部分一致的情況(P<0.05)，共同特點為產丁酸菌數量的降低，同時兩組均出現了腸道菌群失衡模式，但T2DM以擬桿菌屬增多為主要特點，DKD組則以乳桿菌屬、史雷克菌屬、厭氧棒狀菌屬和腸球菌屬增多為主要特點。從門上來看，T2DM組和DKD組的藍藻細菌門和厚壁菌門明顯減少，從屬上看，主要表現為丁酸菌豐度下降，比較明顯的包括以下4種：① 柔嫩梭菌屬；② 糞球菌屬；③ 毛螺旋菌屬；④ 羅斯菌屬，以上4種菌屬在T2DM患者和DKD患者的腸道中數量明顯降低(P<0.05)。從變化信號上來看，雖然T2DM組和DKD組存在一定的一致性，但二者同時也存在一定的特異性，其中T2DM組特點為以下菌增加：① 擬桿菌屬；② 動球菌科；③ 明串珠菌科；④ 擬桿菌科；⑤ 梭菌科，同時奇異菌屬和多爾氏菌屬則體現為明顯下降(P<0.05)。DKD組患者的菌群失調模式特點如下：以下菌屬和科明顯增多，屬水平：① 發(fā)酵乳桿菌屬；② 嗜血桿菌屬；③ 史雷克氏菌屬；④ 厭氧棍狀菌屬；⑤ 腸球菌屬；科水平：① 紅蝽菌科；② 腸球菌科；③ 互養(yǎng)菌科；④ 韋榮菌科；⑤ 乳桿菌科，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；門水平：DKD患者中互養(yǎng)菌門顯著增多(P<0.05)(見圖2)。

2.4 T2DM組和DKD組患者腸道菌群功能變化通過PICRUSt對T2DM組和DKD組腸道菌群功能進行預測，并與KEGG數據庫比對后發(fā)現，相對于對照組來講，T2DM組和DKD組呈明顯的一致性，尤其腸道中一些菌群的功能顯著增強(P<0.05)，例如萘降解、鏈霉素生物合成、核苷糖代謝、氨基糖代謝、谷胱甘肽代謝以及蛋白質折疊。在一些功能上則呈顯著降低，具體包括：① 甘油磷酸酯代謝；② 細菌趨藥性；③ 信號傳導機制；④ 細胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸鹽形成；⑦ 輔酶A生物合成。

DKD組患者在以下代謝功能上更好(P<0.05)，具體包括：① 脂多糖生物合成；② 三羧酸循環(huán)；③ 糖基轉移酶；④ 糖異生；⑤ 鞘糖脂生物合成；⑥ 三羧酸循環(huán)；⑦ 糖基轉移酶代謝；⑧ 細菌毒素降解；⑨ 色氨酸代謝；⑩ 纈氨酸亮氨酸代謝；霍亂弧菌感染；磷酸轉運系統(tǒng)；無機物的運輸和代謝；聚糖生物合成；金黃色葡萄球菌感染；丙酸代謝；細胞運動和分泌；脂多糖生物合成蛋白；抗壞血酸；香葉醇代謝功能。

在以下代謝功能上則相對較差(P<0.05)，具體包括：① 硫胺素代謝；② 賴氨酸生物合成；③ 卟啉代謝；④ RNA轉運；⑤ 苯丙氨酸生物合成；⑥ 酪氨酸生物合成；⑦ 甲烷代謝功能；⑧ 鈣信號通路；⑨ 色氨酸生物合成功能。

注：藍色為對照組，紅色為T2DM組，綠色為DKD組。

3 討論

本文針對T2DM和DKD患者的腸道菌群情況進行了分析，結果發(fā)現，兩種患者的腸道菌群與健康人群相比，其α多樣性指數相對較低，此研究結果與相關學者的研究觀點一致[10]。本研究也受地域的影響，不同地域的飲食結構存在一定的差異，因此，代謝類疾病的腸道菌群失衡模式可能存在一定的差異。但大多數研究均顯示擬桿菌門所占比例呈上升狀態(tài)[11-13]，而厚壁菌門所占比例則呈下降狀態(tài)。在本研究中顯示，對照組與T2DM組和DKD組之間的腸道菌群結構上差異無統(tǒng)計學意義，但從研究數據中可發(fā)現厚壁菌門/擬桿菌門的比例上存在不同，但其比例的不同并不影響整體結構。其主要原因可能是兩組患者僅在厚壁菌門/擬桿菌門比例上存在差異，其余變化均比較一致，例如在門水平上，兩組患者均顯示為藍藻細菌門和厚壁菌門減少，在門水平上，則以厚壁菌門和藍藻細菌門數量較低為特點。從相關學者的研究中也可發(fā)現[14]，在T2DM患者腸道中出現了梭菌減少和乳酸桿菌富集的情況，有學者也指出[15]，T2DM患者的腸道中產生柔嫩梭菌屬、羅斯菌等丁酸鹽細菌的減少，而像多枝梭菌、糞擬桿菌、大腸埃希菌以及遲緩埃格特菌等致病菌則會顯著增加。有學者指出[16]，羅斯菌定值和高植物多糖飲食會增加腸道內丁酸的水平，并降低主動脈的炎癥因子的水平，在一定程度上減小動脈粥樣硬化斑塊的體積。

腸道菌群功能變化方面來看，結果顯示，T2DM組與DKD組患者腸道的功能變化存在一致性，其一致性主要表現在以下兩方面：一方面為相關菌群功能的增強，例如萘降解、鏈霉素生物合成、核苷糖代謝、氨基糖代謝、谷胱甘肽代謝以及蛋白質折疊等。另一方面為相關菌群功能的降低，主要表現在7種菌群的變化：① 甘油磷酸酯代謝；② 細菌趨藥性；③ 信號傳導機制；④ 細胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸鹽形成；⑦ 輔酶A生物合成。從兩方面的變化體現了T2DM和DKD患者腸道菌群功能變化存在一致性，從此結果也可發(fā)現DKD患者的菌群變化和糖尿病患者出現了同樣的菌群變化形式，只是在DKD患者中又出現了個別菌群的紊亂，例如腸球菌和棒狀桿菌的升高，此觀點與既往研究[17]結果相一致，即兩種菌在慢性腎病患者腸道中呈高表達水平，并且進行糞菌移植后的小鼠出現了腎功能損傷。此結果顯示了DKD患者菌群變化是在T2DM基礎上發(fā)生了其他關鍵特征性變化的，同時也加速了DKD的發(fā)展。

綜上所述，T2DM和DKD患者在腸道菌群失衡方面的變化比較一致，均表現為丁酸菌的減少，但同時也存在一定的特異性變化，從腸道菌群功能變化方面來看二者變化呈多數一致狀態(tài)。