柴胡口服液抑制NF-κB-NLRP3通路緩解慢性熱應(yīng)激誘導(dǎo)的肉雞肺臟炎性損傷

劉逸雷，丁康寧，侯曉礁，秦俊杰，李偉豪，謝智江，劉玉清，何永明，唐陸平*

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東佛山 528000；2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102629)

熱應(yīng)激是動(dòng)物應(yīng)對(duì)周?chē)邷丨h(huán)境產(chǎn)生的一種非特異性反應(yīng)的總和，當(dāng)溫度過(guò)高或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，機(jī)體無(wú)法進(jìn)行適應(yīng)調(diào)整，則發(fā)生熱應(yīng)激[1]。長(zhǎng)期暴露在炎熱的環(huán)境，體內(nèi)過(guò)多的熱量積累會(huì)影響機(jī)體組織和器官[2]，肺作為機(jī)體最重要的散熱和氣體交換器官，在熱應(yīng)激時(shí)動(dòng)物的快速喘息容易造成肺的損傷，影響肺臟的通氣功能，進(jìn)而影響腦和胃腸道等重要組織器官[3]。隨著全球氣候變暖和集約化高密度的養(yǎng)殖方式，畜禽更易受到熱應(yīng)激危害，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

柴胡口服液(Radix bupleuri oral liquid，RBO)具有解表退熱功能，在臨床上緩解由高熱引起家禽的不良反應(yīng)具有一定的效用[5]。方中主要成分柴胡經(jīng)提取精致成中藥合劑[6]，其中含有柴胡皂苷、揮發(fā)油、多糖等有效成分[7]，可治療肺損傷和提高機(jī)體免疫功能。本文以肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物探索柴胡口服液對(duì)熱應(yīng)激肉雞肺損傷的緩解及作用機(jī)理，以期為臨床實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 柴胡口服液(清開(kāi)素)由北京生泰爾科技股份有限公司提供(批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字010125347)；解暑抗熱散(批號(hào)：20190613)，泰安市泰山神藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；白介素6(IL-6)、白介素2(IL-2)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；IL-6、TNF-α、IL-1β、NLPR3、NF-κB抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡健康肉雞120只，雌雄各半，購(gòu)于佛山市南海種雞場(chǎng)。肉雞購(gòu)回后常規(guī)飼養(yǎng)至21日齡時(shí)開(kāi)始試驗(yàn)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)，德國(guó)MICROM產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 將21日齡肉雞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、熱應(yīng)激組、熱應(yīng)激+陽(yáng)性藥物組、熱應(yīng)激+柴胡口服液低劑量、熱應(yīng)激+柴胡口服液中劑量組和熱應(yīng)激+柴胡口服液高劑量組，每組20只。正常對(duì)照組溫度控制在25℃±2℃，熱應(yīng)激各組溫度控制為：白天35℃±2℃(10：00～16：00)，其余時(shí)間(16：00到翌日10：00)則飼養(yǎng)在25℃±2℃環(huán)境中，相對(duì)濕度均保持在60%～70%。各組動(dòng)物分籠，均自由采食和飲水，其中陽(yáng)性藥物組每1 kg飼料添加10 g解暑抗熱散；柴胡口服液低劑量組每1 kg飲水添加0.75 mL柴胡口服液；中劑量組每1 kg飲水添加1 mL柴胡口服液；高劑量組每1 kg飲水添加1.25 mL柴胡口服液。分別于熱應(yīng)激第5天和第10天各剖殺一部分雞用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)肉雞血清中炎性因子水平 分別于熱應(yīng)激第5天和第10天從每組隨機(jī)挑選10只肉雞，進(jìn)行靜脈采血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 HE染色觀察肺組織病理變化 將肉雞于熱應(yīng)激第5天、第10天隨機(jī)處死后摘取肺組織用中性PBS沖洗，取部分肺臟置于40 mL/L多聚甲醛液中固定48 h。固定完成后取出，用流水沖凈固定液(6 h 以上)，取出肺組織依次用500、700、800、950、1000 mL/L酒精對(duì)組織進(jìn)行梯度脫水。脫水后將組織浸泡于二甲苯∶乙醇(1∶1)混合液中 15 min，取出后放入二甲苯中 15 min 進(jìn)行透明。將透明好的樣品置于熔融的石蠟Ⅰ中浸蠟1 h，隨后轉(zhuǎn)移至石蠟Ⅱ和石蠟Ⅲ中各浸蠟 1 h，完成浸蠟后取出組織于包埋框中包埋組織，做好標(biāo)記并切片。HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.4 檢測(cè)熱應(yīng)激肉雞肺臟器官指數(shù) 于熱應(yīng)激第5天、第10天隨機(jī)挑選10只雞，處死后摘取肺組織用中性PBS沖洗并用吸水紙擦干后稱(chēng)重，計(jì)算肺臟的器官指數(shù)，肺指數(shù)=肺臟重量(g)/體重(g)。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)肉雞肺臟組織炎癥相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平 將熱應(yīng)激第5天和第10天取得肺組織部分迅速投入液氮中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?00 mg肺組織加入RIPA裂解液并置于冰上裂解30 min，隨后于4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清進(jìn)行BCA定量，按1∶4體積加入5×SDS蛋白上樣緩沖液和上清液，充分混勻后煮沸變性10 min；取變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)50 mL/L脫脂牛奶封閉后洗滌室溫下孵育一抗(β-actin、p-p65、p65、NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α)3 h，再次洗滌后孵育相應(yīng)二抗，用ELC發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計(jì)和處理數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異比較；用Graph Pad Prism 8.0軟件對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激肉雞血清中炎性因子水平變化

慢性熱應(yīng)激第5天，血清中IL-6和TNF-α含量各組無(wú)明顯差異，熱應(yīng)激組的IL-2和IL-1β含量相對(duì)空白組顯著上升(P<0.01，P<0.05)，柴胡口服液各劑量組的IL-1β含量相對(duì)熱應(yīng)激組均顯著性降低。熱應(yīng)激第10天，各組肉雞血清中的IL-2和IL-1β含量無(wú)顯著差異，而熱應(yīng)激組IL-6和TNF-α含量相對(duì)空白組極顯著增加(P<0.01，P<0.01)；與熱應(yīng)激10天組相比，柴胡口服液各劑量均能顯著降低肉雞血清中IL-6和TNF-α水平(圖1)。

與空白組相比,#P<0.05，# #P<0.01；與熱應(yīng)激組相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01 ; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 熱應(yīng)激肉雞肺臟組織病理變化

空白組的肺臟肺泡結(jié)構(gòu)明顯，肺間質(zhì)無(wú)明顯充血；熱應(yīng)激第5天，肺泡結(jié)構(gòu)明顯擴(kuò)張，熱應(yīng)激第10天，組織間隙顯著出血；陽(yáng)性藥物組熱應(yīng)激第5天可見(jiàn)血管少量充血，第10天血管出血更加明顯；柴胡口服液各劑量組的肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，充血、出血現(xiàn)象較少(圖2)。

2.3 熱應(yīng)激肉雞肺組織重量變化

與正常組相比，熱應(yīng)激第5天與第10天均能顯著增加肉雞肺指數(shù)(P<0.01，P<0.05)，而陽(yáng)性藥物及柴胡口服液5天組均能顯著降低肉雞肺指數(shù)，陽(yáng)性藥物及柴胡口服液各劑量10天組對(duì)肺指數(shù)無(wú)明顯影響，說(shuō)明柴胡口服液5天組能顯著降低熱應(yīng)激引起肺水腫，對(duì)熱應(yīng)激肉雞肺臟有一定保護(hù)作用(圖3)。

2.4 熱應(yīng)激肉雞肺臟中IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)

與空白組相比，熱應(yīng)激第5天組肉雞肺臟中IL-6和TNF-α表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，而藥物組和柴胡口服液劑量組均能顯著降低肺組織中IL-6和TNF-α的含量。與空白組相比，熱應(yīng)激第10天組肉雞肺臟中IL-6表達(dá)量顯著上升，而TNF-α含量顯著下降；與熱應(yīng)激10天組相比，陽(yáng)性藥物組的IL-6含量顯著上升，僅柴胡口服液高劑量組的IL-6和TNF-α的表達(dá)呈顯著下調(diào)(圖4)。

A.空白對(duì)照組；B.熱應(yīng)激組；C.陽(yáng)性藥物組；D.柴胡低劑量組；E.柴胡中劑量組；F.柴胡高劑量組； A.Control group; B.Heat stress group; C.Positive group; D.RBO-low group; E.RBO-mid group; F.RBO-high group圖2 柴胡口服液對(duì)熱應(yīng)激肉雞肺組織病理學(xué)變化的影響(HE，40×)

2.5 熱應(yīng)激肉雞肺臟組織中NLRP3和IL-1β表達(dá)

與空白組相比，熱應(yīng)激5天組肉雞肺組織中NLRP3表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，IL-1β含量在熱應(yīng)激第5天和第10天時(shí)均顯著增加(P<0.01，P<0.01)；與熱應(yīng)激組相比，陽(yáng)性藥物組和柴胡口服液各劑量組均能降低第5天和第10天肉雞肺組織中NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)(圖5)。

2.6 熱應(yīng)激肉雞肺組織中NF-κB p65及磷酸化蛋白含量

與空白組相比，熱應(yīng)激第5天和第10天組肉雞肺組織中磷酸化p-65蛋白與非磷酸化p-65表達(dá)比例顯著增加，與熱應(yīng)激組相比，陽(yáng)性藥物組僅在熱應(yīng)激第5天下調(diào)了磷酸化p-65蛋白的表達(dá)，而柴胡口服液各劑量組均能顯著下調(diào)第5天和第10天熱應(yīng)激肉雞肺臟中磷酸化p-65的蛋白表達(dá)(圖6)。

3 討論

慢性熱應(yīng)激可導(dǎo)致雞肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，與鼠的急性肺損傷的得到的結(jié)果相似[8]，且隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)明顯的出血和充血現(xiàn)象，而經(jīng)柴胡口服液治療后，可減輕熱應(yīng)激所致的肺損傷，說(shuō)明柴胡口服液能預(yù)防和緩解熱應(yīng)激。

與空白組相比,#P<0.05，# #P<0.01；與熱應(yīng)激組相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應(yīng)激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P< 0.01,vs.heat stress group.

慢性熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響還體現(xiàn)在引起血清中IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的變化[9]以及提高IL-6和TNF-α等促炎基因mRNA的表達(dá)[10]。熱應(yīng)激第5天時(shí)，血清中IL-2和IL-1β的含量增加，而在熱應(yīng)激第10天時(shí)，IL-6和TNF-α的升高，說(shuō)明在熱應(yīng)激期間不同的炎性因子在不同時(shí)期起作用。IL-6具有誘導(dǎo)B細(xì)胞的分化產(chǎn)生免疫球蛋白[11]、激活NK細(xì)胞的功能 ，可以被IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)又能抑制IL-1β和TNF-α的過(guò)度表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中具有促炎及抗炎作用。IL-2可與IFN-β共同誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化殺傷細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，增加機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力，加速對(duì)外來(lái)病源體的清除。

核因子-κB(NF-κB)是機(jī)體中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，一般以?xún)蓚€(gè)蛋白亞基p65(RelA)和p50(NF-κB)組成異源二聚體的形式與IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，此時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)刺激或者體內(nèi)的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α刺激時(shí)，可活化NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)靶基因啟動(dòng)子特定基因序列結(jié)合，激活炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在肺臟炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。炎癥小體(NLRP3)的激活需要先經(jīng)過(guò)Toll樣受體識(shí)別危險(xiǎn)相關(guān)的分子模式或病原體相關(guān)的分子模式激活NF-κB的和誘導(dǎo)Pro-IL-1β的生成才能進(jìn)行啟動(dòng)，隨后在各種細(xì)胞外刺激下觸發(fā)炎癥復(fù)合體的組裝才能最終激活產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β[12]。本文證明熱應(yīng)激前期可明顯促進(jìn)肉雞肺臟NF-κB p65蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)，促進(jìn)炎性相關(guān)因子NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α的積累，表明慢性熱應(yīng)激可能激活了NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)下游IL-6和TNF-α的表達(dá)，同時(shí)還激活了NLRP3，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，柴胡口服液可通過(guò)抑制上述過(guò)程減輕熱應(yīng)激造成的炎性損傷。

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應(yīng)激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

#P<0.05，# #P<0.01，與空白組相比；*P<0.05，**P<0.01與熱應(yīng)激組相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

慢性熱應(yīng)激可誘導(dǎo)肉雞肺部炎性損傷，而柴胡口服液可能通過(guò)抑制NF-κB-NLRP3信號(hào)通路減少炎性因子表達(dá)從而緩解熱應(yīng)激引起的炎性損傷，表明柴胡口服液具有明顯的抗熱應(yīng)激效果，可用于臨床上家禽慢性熱應(yīng)激的預(yù)防和治療。