新疆6個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)豬圓環(huán)病毒3型感染調(diào)查和基因分析

李 靜，屈勇剛*，張家瑞，常軍帥，楊瑞鈺，周磊磊，王紫陽，孫瓊飛，張魯安

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830063)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為一種共價(jià)閉合、單股環(huán)狀DNA病毒，是目前發(fā)現(xiàn)最小的動(dòng)物病毒。2016年前只發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)兩種基因型[1]。PCV1可以感染豬但無致病性，PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)主要病原[2-3]。用宏基因組等技術(shù)從患有皮炎腎病綜合征和繁殖障礙母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)鑒定出一種新型的豬圓環(huán)病毒，能夠感染豬心臟和多系統(tǒng)炎性浸潤(rùn)等病理變化，被命名為PCV3[4]。PCV3基因組為2 000 bp，包括3個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)，其中ORF1基因編碼復(fù)制酶蛋白(Rep)，由297個(gè)氨基酸組成[5]；ORF2與ORF1方向相反，編碼衣殼蛋白(Cap)，由214個(gè)氨基酸組成[6]；ORF3 編碼的蛋白由231個(gè)氨基酸組成，其轉(zhuǎn)錄方向與ORF1一致，編碼蛋白的功能尚需驗(yàn)證。Cap蛋白是PCV3的主要結(jié)構(gòu)蛋白和抗原蛋白。根據(jù)PCV3全基因組序列和Cap蛋白突變氨基酸A24V和R27K，將PCV3分為PCV3a、PCV3b和PCV3c等3個(gè)基因型[7-9]。2016年起韓國(guó)、巴西、波蘭、意大利等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了PCV3，我國(guó)豬群感染PCV3的情況也很普遍，已有28個(gè)省市報(bào)告存在PCV3。為了調(diào)查新疆地區(qū)PCV3的感染情況，本文采集新疆部分地區(qū)449份豬組織樣品進(jìn)行PCV3核酸檢測(cè)，為新疆部分地區(qū)PCV3的防控工作提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2019年9月至2020年12月采集新疆6個(gè)地區(qū)(阿克蘇、巴州、石河子、奎屯、克拉瑪依、伊犁)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)豬樣品449份，有全血433份，組織16份(表1)。對(duì)石河子地區(qū)采集的163份樣品記錄了不同生長(zhǎng)階段(表2)。將樣品于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、Trans Script? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for PCR，北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Fast Pure? Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Taq Plus Master Mix、DL Marker Ⅰ，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，英國(guó)Bibby科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；低溫冰箱，海信容聲冰箱有限公司產(chǎn)品。

表1 PCV3樣品來源情況

表2 不同年齡段豬樣品情況

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[10-13]合成套式PCR檢測(cè)引物PCV3-F1/R1和PCV3-F2/R2，擴(kuò)增片段分別為620 bp和329 bp；PCV2檢測(cè)引物PCV2-F1/PCV2-R1擴(kuò)增片段487 bp；豬偽狂犬病病毒(PRV)檢測(cè)引物PRV-F1/PRV-R1擴(kuò)增片段295 bp；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)檢測(cè)引物PRRSV-F1/R1擴(kuò)增片段433 bp；根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)合成豬瘟病毒(CSFV)檢測(cè)引物CSFV-F1/F2，擴(kuò)增片段585 bp。引物均由北京華大基因科技有限公司合成，用前將引物濃度稀釋至10 μmol/L(表3)。

1.2.2 病毒核酸提取 取200 μL血液，不足200 μL可加緩沖液GA補(bǔ)足，病料組織研磨，處理為細(xì)胞懸液，10 000 r/min離心1 min，倒盡上清，加200 μL緩沖液GA，根據(jù)DNA/RNA提取試劑盒說明書對(duì)采集的樣品進(jìn)行病毒基因組DNA/RNA提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，取4 μL提取的總RNA為模板加入RNase-free Water 12 μL混勻，于65℃水浴鍋中孵育5 min，之后冰浴2 min，加入4 μL 5×Trans Script? All-in-One Super Mix for PCR 42℃孵育30 min，85℃水浴鍋中孵育5 s，反應(yīng)結(jié)束后置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 PCV3、PCV2、PRV的PCR檢測(cè) 用特異性引物對(duì)提取樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20 μL：ddH2O 7 μL，2×Taqplus Master Mix10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCV3 PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCV2 PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PRV PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 40 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后各取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析PCV3病毒的單獨(dú)感染和混合感染。

表3 引物序列

1.2.4 PRRSV、CSFV的RT-PCR檢測(cè) 用特異性引物對(duì)提取樣品的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系同1.2.3，PRRSV PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 60 s，72℃ 60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。CSFV PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 50 s，58℃ 60 s，72℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。電泳檢測(cè)及分析同1.2.3。

1.2.5 PCV3擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化及測(cè)序 將PCV3檢測(cè)陽性，其他病毒檢測(cè)為陰性的樣品，經(jīng)PCR擴(kuò)增后用Fast Pure? Gel DNA Extraction Mini Kit進(jìn)行凝膠回收純化，將回收產(chǎn)物連接至T載體，轉(zhuǎn)化入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌液送北京華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.6 測(cè)序分析 用Meg Align軟件對(duì)分離株與國(guó)內(nèi)外PCV3序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA7.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，所有參照序列的PCV3基因組從NCBI基因庫(kù)下載。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)PCV3 PCR檢測(cè)

對(duì)采自6個(gè)不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的449份血樣進(jìn)行PCV3基因檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)1條329 bp的陽性條帶，與目的片段大小一致(圖1)。共檢測(cè)出PCV3陽性樣品65份，平均陽性率為14.5%(65/449)。各地區(qū)均檢測(cè)到PCV3，陽性率為8.1%～16.0%，其中石河子地區(qū)16.0%，伊犁地區(qū)8.1%(表4)。對(duì)不同地區(qū)PCV3感染情況通過χ2檢驗(yàn)，P>0.05，即差異性不顯著。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 700；1～7.PCV3陽性樣品；N.陰性對(duì)照；P.陽性對(duì)照

表4 不同地區(qū)PCV3 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCV3與其他豬源病毒混合感染情況

對(duì)PCV3基因檢測(cè)為陽性的樣品(65份)同時(shí)進(jìn)行PCV2、PRV、PRRSV、CSFV基因檢測(cè)，除CSFV 外其余病毒均出現(xiàn)陽性條帶與預(yù)期結(jié)果一致，大小分別為487、295、433 bp(圖2)。對(duì)PCV3陽性樣品及其常見病原的基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，PCV3單獨(dú)感染率為33.8%(22/65)，PCV3與其他病原的二重感染中，PCV3+PRRSV感染率為16.9%(11/65)、PCV3+PCV2感染率為15.4%(10/65)；PCV3與其他病原的三重感染中，主要以PCV3+PCV2+PRRSV為主，感染率為15.4%(10/65)；PCV3與所調(diào)查的病原四重感染較少，PCV3+PCV2+PRV+PRRSV感染率為1.5%(1/65)(表5)。

2.3 不同生長(zhǎng)階段豬群PCV3 PCR檢測(cè)

石河子地區(qū)不同生長(zhǎng)階段豬群感染PCV3的平均陽性率為16.0%(26/163)，其中保育豬的陽性率為30.0%(12/40)，育肥豬陽性率為5.3%(2/38)(表6)。對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬群感染PCV3進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05，即差異顯著。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 700；1、4、7.PCV2、PRV、PRRSV陽性樣品；2、5、8.陽性對(duì)照；3、6、9.陰性對(duì)照。10～11.CSFV陰性樣品和陰性對(duì)照

表5 PCV3與其他常見病原混合感染情況

表6 不同年齡段PCV3 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 PCV3序列測(cè)定與分析

測(cè)序結(jié)果表明，樣品基因片段與目的片段大小一致(329 bp)，用NCBI、DNA Man、MegAlign軟件對(duì)獲得的PCV3核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外14株P(guān)CV3基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果本試驗(yàn)獲得的PCV3核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性為97.9%～100.0%，其中與中國(guó)河北株KY 354060.1PCV3-CN-Hebei-33-2016同源性為100%，與中國(guó)浙江株 MK033237.1 PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2016同源性為97.9%；與意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016同源性為99.7%，與俄羅斯株MG 679916.1PCV3-RU-TY17同源性為98.6%，PCV3-25為試驗(yàn)所得序列(圖3)。

用MEGA 7.0軟件將本試驗(yàn)獲得的PCV3基因序列與國(guó)內(nèi)外14株P(guān)CV3參考基因序列共同建立遺傳進(jìn)化樹。本試驗(yàn)獲得的PCV3-25與意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016、河北株KY354060.1 PCV3-CN-Hebei-33-2016、浙江株MK033223.1 PCV3-CN-ZJ-JH-2017、重慶株KY075991.1 PCV3-CN-Chongqing-148-2016、江西株KY075989.1 PCV3-CN-Jiangxi-62-2016、福建株MF589108.1 PCV3-CN-Fujian-FZ-2015、廣東株MF589103.1 PCV3-CN-Guangdong-HZ4-2015在同一分支，屬于3a亞群(圖4)。

圖3 PCV3核苷酸序列的同源性分析

3 討論

用PCR方法對(duì)2019年9月至2020年12月采自新疆6個(gè)地區(qū)共449份組織樣品進(jìn)行病毒的核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示PCV3平均陽性率為14.5%。新疆6個(gè)地區(qū)均檢測(cè)出了PCV3的存在，檢出率為8.1%～16.0%，其中石河子地區(qū)16.0%，伊犁地區(qū)8.1%，表明PCV3在新疆部分地區(qū)普遍存在，通過χ2檢驗(yàn)對(duì)新疆不同地區(qū)PCV3感染情況進(jìn)行分析，P>0.05，差異性不顯著，提示豬群感染PCV3與不同地區(qū)無關(guān)。PCV3單獨(dú)感染率為33.8%(22/65)，PCV3+PRRSV感染率為16.9%(11/65)；PCV3+PCV2+PRRSV感染率為15.4%(10/65)。石河子地區(qū)不同生長(zhǎng)階段豬群感染PCV3的平均陽性率為16.0%(26/163)，其中流產(chǎn)胎兒、哺乳仔豬、保育豬、育肥豬、經(jīng)產(chǎn)母豬中均檢測(cè)到PCV3，表明PCV3對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬群均可感染，不同生長(zhǎng)階段的PCV3陽性率差異顯著，其中保育豬感染最為嚴(yán)重為30.0%(12/40)。

本研究得到的PCV3核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性為97.9%～100.0%，其中與河北株KY354060.1PCV3-CN-Hebei-33-2016同源性為100%；與意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016同源性為99.7%。本試驗(yàn)獲得的PCV3-25與意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016、河北株KY354060.1 PCV3-CN-Hebei-33-2016、浙江株MK033223.1 PCV3-CN-ZJ-JH-2017、重慶株KY075991.1 PCV3-CN-Chongqing-148-2016、江西株KY0759 89.1PCV3-CN-Jiangxi-62-2016、福建株MF589108.1PCV3-CN-Fujian-FZ-2015、廣東株MF589103.1PCV3-CN-Guangdong-HZ4-2015在同一分支，遺傳關(guān)系較為接近，屬于3a亞群。

PCV3已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛流行，本試驗(yàn)結(jié)果顯示該病毒在新疆部分地區(qū)存在，且與其他豬源病毒之間存在混合感染，應(yīng)重視PCV3對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的威脅。