羌活活性成分阿魏酸對豬細小病毒增殖及炎癥因子表達的影響

郭振環(huán)，李向輝，張志強，胡光遠，趙 麗，馬 霞,3*，劉永錄

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省中獸藥經(jīng)典名方傳承與創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046； 3.鄭州市中獸藥免疫藥理學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450046)

豬細小病毒病是由豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一種豬繁殖障礙性疾病[1]，不同年齡、性別的豬均易感，病毒可通過胎盤垂直傳播，帶毒仔豬帶毒排毒時間很長甚至終身。感染種公豬通過配種傳染給易感母豬。懷孕母豬易發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎等，臨床上給母豬接種PPV疫苗預(yù)防該病毒的感染，但預(yù)防效果不理想。從中藥中尋找藥理作用明確的抗病毒成分防控PPV具有重要意義。羌活為傘形科植物羌活的根莖及根，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛及抗血栓形成等作用。主要化學(xué)成分為羌活醇、異歐前胡素、異歐前胡內(nèi)酯、紫花前胡苷元、綠原酸、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯及揮發(fā)油等成分，其中阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是主要有效成分之一，具有清除自由基、抗血栓、抗炎等作用，其衍生物多為脂類、酮類、鹽類等，研究發(fā)現(xiàn)蜂膠中阿魏酸具有抗豬細小病毒的作用。本試驗檢測羌活中分離的有效活性成分阿魏酸對豬細小病毒增殖及其介導(dǎo)炎癥因子的影響，探究阿魏酸的抗炎效應(yīng)，為抗病毒藥物的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 PK-15細胞系由本實驗室凍存保存，PPV病毒滴度1.0×10-6TCID50/mL，由山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院沈志強課題組贈送。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基,2.5 g/L胰酶-EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗、RI-PA裂解液，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。MTT試劑盒、熒光定量SYBR Premix ExTaq試劑盒，諾唯贊生物工程(南京)有限公司產(chǎn)品；羌活有效活性成分阿魏酸由鄭州市中獸藥有效成分免疫藥理學(xué)重點實驗室制備提供(純度>95%)。

1.1.3 主要儀器 CKX53倒置顯微鏡，奧林巴斯株式會社產(chǎn)品；FormaTMSteri-CultTM二氧化碳培養(yǎng)箱，Varioskan LUX 多功能酶聯(lián)免疫檢測儀，Life Technologies 7500Fast熒光定量PCR儀，賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸對PK-15細胞安全濃度的測定 取對數(shù)期PK-15細胞，調(diào)細胞懸液濃度約為1.0×106個/mL，加入96孔板培養(yǎng)24 h，吸去上清培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(PBS)洗2遍，加入全培養(yǎng)基2倍稀釋阿魏酸有效活性成分為0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 000 μmol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μLCCK-8溶液和90 μL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定各孔OD450nm值，試驗設(shè)空白組與陰性對照組。

細胞存活率(%)=(試驗組OD450nm值-空白組OD450nm值)/(陰性對照OD450nm值-空白組OD450nm值)

1.2.2 阿魏酸最佳給藥方式 根據(jù)1.2.1篩選的阿魏酸安全濃度，將阿魏酸用全培養(yǎng)基分別配制成10、20、30、40、50 μmol/mL，方式1：藥液與PPV(MOI=1)混勻后，37℃培養(yǎng)箱中4 h，再接種到已長成單層細胞的96孔板。方式2：向長滿PK-15細胞的96孔板中每孔加入PPV(MOI=1)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后加入藥液；方式3：向長滿PK-15細胞的96孔板中每孔加入藥液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，加入PPV(MOI=1)。均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取上清液提取病毒DNA，RT-qPCR方法檢測病毒增殖情況，PCR反應(yīng)體系SYBR Premix ExTiqⅡ(2X)10 μL,DNA 模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s～34 s，35個循環(huán)。

1.2.3 阿魏酸對PPV病毒增殖的抑制試驗 根據(jù)篩選的最佳給藥方式，將長滿PK-15細胞的96孔板感染PPV(MOI=1)培養(yǎng)4 h后給予羌活有效活性成分阿魏酸30 μmol/mL，分別在0、6、12、24、36、48 h收集病毒上清液，提取病毒DNA，用RT-qPCR方法檢測病毒增殖在PK-15細胞中的增殖情況。

1.2.4 阿魏酸對PPV病毒感染PK-15細胞因子的mRNA表達水平影響 將長滿PK-15細胞的6孔板感染PPV(MOI=1)培養(yǎng)4 h后給予羌活有效活性成分阿魏酸10、20、30 μmol/mL。培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，收集細胞，用常規(guī)trizol法提取樣品總RNA，用微量核酸蛋白定量儀NanoDropTMOne/OneC檢測總RNA濃度和純度。以1 μg的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系及條件參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒提供的方法進行。檢測IL-1β、IL-2、 IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、TGF-β1、PGK1(表1)的動態(tài)表達，結(jié)束反應(yīng)運用2-△△Ct法分析基因的mRNA表達量。

表1 引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進行分析，結(jié)果以平均值士標準差 (Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對PK-15細胞的安全濃度

用0～1 000 μmol/mL的羌活有效活性成分阿魏酸分別處理PK-15細胞(圖1)，在濃度低于160 μmol/mL時對PK-15細胞無毒性作用(P>0.05)，當(dāng)濃度大于160 μmol/mL,細胞活力顯著下降(P<0.05，P<0.01)。阿魏酸對PK-15細胞的安全濃度為0～160 μmol/mL。

*P<0.05，**P<0.01

2.2 不同給藥方式對PPV病毒的抑制效果

給藥方式1和3對PPV無明顯抑制作用(P>0.05)。給藥方式2可有效抑制PPV復(fù)制，且呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)阿魏酸給藥濃度為30 μmol/mL，病毒抑制率出現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，達到40%以上。說明阿魏酸對PPV有一定的抑制作用，主要作用于病毒感染后期(圖2)。

2.3 阿魏酸對PPV病毒抑制效果

PPV隨時間的增長表達量升高(圖3A)，但阿魏酸濃度為30 μmol/mL能有效抑制(圖3B)。與PPV(MOI=1)相比，給藥組在24 h和36 h顯著抑制PPV的復(fù)制(P<0.05，P<0.01，圖3C)。

圖2 3種不同給藥方式對PPV病毒抑制效果

圖3 阿魏酸對PPV病毒抑制效果

2.4 阿魏酸對IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17和IL-18mRNA表達的影響

PPV感染PK-15細胞顯著升高IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18和降低IL-17的表達(P<0.01)。在阿魏酸處理PPV感染組中，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001),IL-17顯著升高(P<0.05，P<0.01)(圖4)。

2.5 阿魏酸對TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1mRNA表達的影響

PPV感染PK-15細胞顯著升高TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1表達(P<0.01)。阿魏酸處理PPV感染組中，TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

3 討論

豬細小病毒主要引起母豬繁殖障礙性疾病[2-3]，還與豬化膿性心肌炎、豬消瘦綜合征及斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征有關(guān)[4-5]，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。蜂膠提取物具有良好的抗豬細小病毒活性[7-8]，阿魏酸是蜂膠抗豬細小病毒主要活性成分[9]。

細胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、促進細胞生長以及修復(fù)組織損傷等多種功能。病原體侵入機體后，能夠觸發(fā)炎癥反應(yīng)，激活淋巴細胞和巨噬細胞分泌細胞因子來抵抗病原體，從而減輕感染病原體引起的機體損傷，其中機體產(chǎn)生大量的致炎性細胞因子，如IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-8、TNF-α 及 IFN-γ等可消除病原微生物，且致炎性細胞因子能進一步激活中性白細胞、內(nèi)皮細胞等，并產(chǎn)生氧自由基、氮氧化物、蛋白酶、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等；同時機體也產(chǎn)生大量的內(nèi)源性抗炎細胞因子，如IL-4及 TGF-β 等參與炎癥反應(yīng)，可見致炎性細胞因子和抗炎性細胞因子在調(diào)節(jié)病毒感染誘導(dǎo)的免疫平衡方面起到至關(guān)重要的作用。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)羌活有效活性成分阿魏酸能夠顯著降低PPV感染PK-15誘發(fā)IL-1β、IL-2、IL-8、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α的表達，而顯著升高PPV感染PK-15誘發(fā)IL-17的表達，且與阿魏酸的給藥劑量呈正相關(guān)。表明阿魏酸顯著降低PPV感染細胞激活細胞炎癥因子的表達水平，推測羌活有效活性成分阿魏酸具有良好的抗炎活性，可減輕炎癥反應(yīng)對機體的損傷從而具有抗豬細小病毒的作用。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.01圖4 阿魏酸對IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18、IL-17 mRNA表達的影響

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，###P<0.01圖5 阿魏酸對TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1 mRNA表達的影響