豬源植生拉烏爾菌的鑒定及生物學特性

邢 柳，王 利，魏 勇，丁俊仁，袁定勝

(1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041；2.西南民族大學動物科學 國家民委重點實驗室，四川成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；4.四川省畜牧總站，四川成都 610100)

植生拉烏爾菌(Raoultellaplanticola)屬于腸桿菌科、拉烏爾菌屬。植生拉烏爾菌是一種需氧、無動力的革蘭氏陰性腸桿菌。該菌多存在于水、土壤和植物等自然環(huán)境中[1]，也可存在于動物黏膜和人體內，在免疫力低下的人群中也可發(fā)生感染[2]。拉烏爾菌屬與克雷伯菌屬親緣性較為密切，其先歸為克雷伯菌屬成員[3]。拉烏爾菌是一種條件致病菌，其致病特點和感染引起疾病的臨床癥狀與克雷伯菌類似，并與克雷伯菌屬生化反應極其相似[4]。該菌可引起人類的嚴重感染甚至休克，還可導致膽囊炎、肺炎、菌血癥、泌尿道感染等疾病[5]。植生拉烏爾菌某些菌株有較強毒力，抗菌藥物治療效果不佳[6]。從新生兒呼吸道、人泌尿道、外科手術感染和敗血癥感染中均有報道，鴨糞便樣本中也分離到該菌[7]。本研究從四川地區(qū)某規(guī)?；i場采集的樣品中分離到1株豬源植生拉烏爾菌，將分離菌株進行鑒定和致病性試驗，為該病的臨床診斷和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和實驗動物 樣品來源于四川省成都市某豬場內患病豬的組織病料，無菌采取病死豬的肝臟、心臟和肺臟等臟器。SPF級小鼠20只，購自四川省成都市中醫(yī)藥研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 LB和Mueller-Hinton Agar培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司產品；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產品；PCR聚合酶細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生物有限公司產品；細菌生化鑒定管和藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產品；標準革蘭氏染色試劑盒，北京雷根生物技術有限公司產品。PCR儀，德國Eppendorf公司產品；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 無菌操作臺從患病豬樣品中取樣,劃線接種于LB培養(yǎng)基,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,在培養(yǎng)基上挑取單一的菌落進行純化培養(yǎng)，并進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察,記錄純化菌落的形態(tài)特征,并將獲得的菌株命名為XL-01。

1.2.2 生化鑒定 參照生化管使用說明書，將已純培養(yǎng)的菌液，用接種環(huán)分別穿刺接種于細菌生化鑒定管中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結果。參照《伯杰細菌鑒定手冊》和杭州微生物試劑有限公司提供的《非發(fā)酵細菌生化鑒定編碼冊》進行結果判斷。

1.2.3 16S rRNA擴增及進化樹分析 將純化細菌接種于LB液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng),置37℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)16 h,離心菌液收集沉淀,根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細菌總DNA。用16S rRNA通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)對其擴增。PCR反應體系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反應條件：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2 min。對PCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測為陽性PCR產物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序完成后，將得到的序列在NCBI的Blast系統(tǒng)進行序列比對，提交至GenBank獲取登錄號。在ClustalX2.1軟件中進行同源性比對，并使用MEGA5.0軟件中的N-J法構建系統(tǒng)進化樹[8]。

1.2.4 毒力基因的檢測 根據文獻[9-10]設計毒力基因，設計ompX、cpa、hly、sip、fimH、papC和papA共7種毒力基因，用提取的DNA模板進行擴增，PCR擴增條件依據參考文獻，對PCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。

1.2.5 小鼠致病性試驗 將20只小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組10只。試驗前小鼠禁食、禁水24 h，試驗組每只小鼠腹腔注射活菌液0.15 mL，調整菌液濃度為1×109CFU/mL；對照組每只小鼠腹腔注射無菌生理鹽水，劑量和方法同試驗組。兩組分開正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d并對各組小鼠的發(fā)病和死亡情況進行統(tǒng)計。

1.2.6 病理組織切片制作 剖檢死亡小鼠，取腸道、肺臟、肝臟和脾臟等組織，浸泡在40 mg/mL多聚甲醛溶液中，脫水、HE染色，光學顯微鏡下觀察[11-12]。

1.2.7 藥敏試驗 用美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的紙片擴散法(KB)測定,用藥敏試劑盒的抗菌藥物對細菌作藥敏性和耐藥表型測定。

1.2.8 耐藥基因檢測 按文獻[13-14]設計磺胺類抗菌藥物耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3，氨基糖苷類抗生素基因ant(3″) -Ⅰa、aac(6′) -Ⅰb和aph(3′) -Ⅱa，β-內酰胺類抗生素基因TEM的引物對其DNA進行擴增，PCR擴增條件依據參考文獻，對PCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定及生化鑒定結果

菌株XL-01在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，形成較小的單一菌落，革蘭氏染色后為紅色(圖1)，呈現單個或成對排列，形態(tài)為短桿狀，表明XL-01菌株為革蘭氏陰性菌。生化結果顯示，分離菌株XL-01對蜜二糖、鳥氨酸、鼠李糖、賴氨酸和山梨醇反應為陽性，對苦杏仁苷、精氨酸雙水解酶、枸櫞酸鈉、蔗糖和氧化酶反應為陰性。菌株XL-01與腸桿菌具有相似的表型特征，符合革蘭氏陰性菌的特征。

圖1 XL-01菌株革蘭氏染色結果(1 000×)

2.2 16S rRNA基因序列分析

分離XL-01菌株的16SrRNA基因，經PCR擴增結果見圖2，將得到獲得的16SrRNA基因正反測序拼接結果，獲得1 458 bp的片段，提交NCBI后獲得GenBank登錄號為MW433720。用得到的菌株XL-01序列在NCBI中采用Blast進行分析，構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，菌株XL-01(圖中“●”標記)的16S rRNA序列與植生拉烏爾菌聚為一個分支，相似性高達100%。菌株XL-01與植生拉烏爾菌(GenBank登錄號：NR112011.1)同源性達95.9%。綜合判斷菌株XL-01為植生拉烏爾菌。

2.3 毒力基因檢測結果

PCR擴增檢出ompX和fimH兩種毒力基因，cpa、hly、sip、papC和papA的基因并未檢出。表明植生拉烏爾菌菌株攜帶這2種毒力基因(圖4)。

2.4 臨床癥狀及死亡情況

第1天試驗組小鼠表現精神沉郁，被毛粗亂，飲食下降，眼角有分泌物，眼睛迷離、弓腰，對照組小鼠健康存活。試驗組小鼠第2天開始陸續(xù)死亡，共死亡7只，發(fā)病率為100%，病死率為70%。表明該菌株致病性較強。剖檢死亡小鼠,采集病樣再次進行細菌分離鑒定，結果判定為植生拉烏爾菌感染。

2.5 病理組織學結果

剖檢試驗組死亡小鼠，可見小鼠腹腔皮下出血，腦水腫，腸道內容物呈現淡黃色液體，肝臟腫大。病理組織學觀察可見心臟和脾臟無明顯病變，肺臟間質充血、肺泡壁增厚、斷裂(圖5A)；肝細胞腫脹、變性，肝竇隙擴張充血(圖5B)；腸道絨毛脫落、毛細血管擴張充血(圖5C)；腎臟中腎小管管腔狹窄，上皮細胞腫脹變性、有脫落現象(圖5D和圖5E)；腦部可見淋巴細胞和中性粒細胞彌散性浸潤(圖5F)。從臨床癥狀與病理變化的結果發(fā)現，XL-01菌株為致病菌，且對動物具有較強的致病性。

2.6 藥敏試驗結果

對菌株XL-01進行抗菌藥物敏感性檢測，菌株XL-01對諾氟沙星、阿米卡星、磷霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和拉氧頭孢敏感，菌株XL-01對阿莫西林、氨芐西林、頭孢克肟、青霉素、鏈霉素和甲氧芐氨嘧啶耐藥。

2.7 耐藥基因檢測結果

對植生拉烏爾菌的DNA進行PCR擴增，耐藥基因擴增結果見圖6，擴增出耐藥基因TEM、Sul1、Sul2、Sul3、aac(6′)-Ⅰb和ant(3″)-Ⅰa與預期相符，耐藥基因aph(3′)-Ⅱa未檢出。

M.DNA 標準DL 2 000;1.菌株 XL-01；2.陰性對照 M.DNA Marker DL 2 000;1.Strain XL-01；2.Negative control

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

M.DNA 標準DL 2 000;1.ompX1；2.fimH M.DNA Marker DL 2 000;1.ompX；2.fimH

3 討論

植生拉烏爾菌作為一種罕見的機會性病原體，常侵襲免疫功能低下的患者，有時甚至引起致命感染[15]。與克雷伯菌屬相似，可感染人的各種器官，如胰腺、皮膚、肝臟、前列腺、結膜和膽囊[16]。由于植物拉烏爾菌與嚴重的胃腸道感染有關，腸移位是一種可能的感染方式[17]。已有報道醫(yī)院環(huán)境中的非細菌液體洗手液被植生拉烏爾菌污染[18],其臨床特征和結果仍有待調查。本試驗腹腔攻毒死亡小鼠均出現腹腔皮下出血、腦水腫、腸道內容物呈淡黃色液體和肝臟腫大等病變，表明該植生拉烏爾菌具有較強的致病性。本試驗病理組織學觀察可見，肝臟中肝細胞腫脹、變性，肝竇隙擴張充血，肺臟中肺間質充血、肺泡壁增厚、斷裂，與相關報道類似[1，3]，但考慮到菌株的致病性強弱可能與分離地點和分離宿主等不同而異。

從腹腔壁壞死性筋膜炎患者分離的植生拉烏爾菌對氨芐西林和阿莫西林耐藥[19]，從中國臺灣地區(qū)的肺炎和菌血癥患者中分離的植生拉烏爾菌對氟喹諾酮類和氨基糖苷類敏感[20]，從重癥膀胱炎患者分離得到的植生拉烏爾菌對氨芐西林、環(huán)丙沙星、氨基糖苷類、碳青霉素類和磺胺類抗生物敏感[21]。2017年報道有2例心外科術后病人感染植生拉烏爾菌而休克[22]。本研究中植生拉烏爾菌對13種抗菌藥物有不同程度的耐藥。對7種耐藥基因進行檢測，該菌的氨基糖苷類和磺胺類耐藥表型與耐藥基因型結果大體一致，而與β-內酰胺類不一致。這可能是檢測到的耐藥基因未能表達轉化為具有生物活性的蛋白質分子，也可能存在其他耐藥機制或該菌對試驗未測試β-內酰胺類有耐藥表型。

A.肺臟,肺間質充血、肺泡壁增厚、斷裂；B.肝臟,肝細胞腫脹、變性，肝竇擴張充血；C.腸,腸絨毛脫落、毛細血管擴張充血；D～E.腎臟,腎小管管腔狹窄，上皮細胞腫脹變性、有脫落現象；F.腦,可見淋巴細胞和中性粒細胞彌散性浸潤

M.DNA 標準DL 2 000;1.TEMS；2.ul1；3.Sul2；4.Sul3；5.aph(3′)-Ⅱa；6.aac(6′)-Ⅰb；7.ant(3″)-Ⅰa；8.陰性對照

本研究從豬肺臟中分離出1株有較強的致病性植生拉烏爾菌，對常見的抗菌藥物具有較強耐藥性，為今后開展植生拉烏爾菌的致病機制和耐藥性研究提供參考。