羥基紅花黃色素A對大鼠避水應(yīng)激所致結(jié)腸高動力的抑制作用及其機(jī)制

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種慢性復(fù)發(fā)性的功能性胃腸道疾病，最常發(fā)生在20～30歲的人群中

。IBS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為：反復(fù)發(fā)作的腹痛，過去3個(gè)月內(nèi)每周發(fā)作至少1 d，腹痛與排便有關(guān)，或伴有大便性狀或頻率的改變。在診斷前，癥狀至少出現(xiàn)6個(gè)月且近3個(gè)月癥狀必須符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；且無任何可識別的器質(zhì)性病變

。目前IBS的病因及機(jī)制仍不明確，被認(rèn)為是一種生物-心理-社會紊亂，其關(guān)鍵因素是腦-腸相互作用的改變，腦-腸互動異常與腸道運(yùn)動障礙、內(nèi)臟高敏和自主胃腸反應(yīng)紊亂有關(guān)。目前，隨著城市化進(jìn)程的加快，人們的生活節(jié)奏加快、生活壓力驟增、生活成本增加，抑郁、焦慮等精神心理障礙人群增加，故各種急慢性心理及生理應(yīng)激刺激在IBS發(fā)病中的重要作用日益得到研究者的重視。

羥基紅花黃色素A(hydroxy safflower yellow A,HSYA)是從紅花中提取出來的主要成分之一，已被證實(shí)具有活血化瘀、通脈止痛等功效

。HSYA可能參與調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動，但證據(jù)不足，其潛在機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)屬于模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，是天然免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)是TLRs家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員之一，Tak-242是一種選擇性的TLR4信號傳導(dǎo)抑制劑。目前有研究表明，HSYA通過作用于TLR4信號通路發(fā)揮其作用

，也有研究表明，TLR4信號通路的激活與IBS腸道炎癥、屏障功能障礙、內(nèi)臟超敏反應(yīng)(visceral hypersensitivity,VH)和IBS癥狀密切相關(guān)

。

歷朝有宵禁制度，只有在諸如元宵節(jié)這樣的特殊日子里，才允許普通百姓夜間出外走動。那么，古代的宵禁制度從何時(shí)開始，又走過了怎樣的發(fā)展歷程呢？

因此，我們推測HSYA可能通過作用于結(jié)腸組織中的TLR4信號通路，發(fā)揮其結(jié)腸平滑肌舒張作用。在本研究中，我們研究了：(1)HSYA對避水應(yīng)激大鼠胃腸動力的影響；(2)HSYA是否通過TLR4受體介導(dǎo)通路影響胃腸動力。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察HSYA對大鼠離體結(jié)腸平滑肌作用的影響及其可能機(jī)制，以確定HSYA舒張結(jié)腸平滑肌的作用，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：體質(zhì)量為130～150 g的雄性清潔級Wistar大鼠15只，購自湖北省疾病控制中心動物室[動物許可證編號：SYXK(鄂)2015-0027，湖北]，飼養(yǎng)于清潔級實(shí)驗(yàn)室(SPF)環(huán)境中，置于溫度(22 ℃)正常的明暗周期控制室中，并提供食物和水。在適應(yīng)1周后，大鼠接受實(shí)驗(yàn)方案。所有方案均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物保護(hù)與使用制度委員會批準(zhǔn)，并遵循國際疼痛研究協(xié)會倫理指南。

1.2.2 動物模型建立：將大鼠置于貼于有機(jī)玻璃籠(45 cm×25 cm×25 cm)的透明水箱正中心的木板平臺(10 cm×8 cm×8 cm)上，籠內(nèi)灌滿室溫水(25±2)℃，距平臺最高點(diǎn)1 cm，每次1 h，連續(xù)10 d，建立避水應(yīng)激模型。SWAS組大鼠被放在同樣規(guī)格的有機(jī)玻璃籠中心的木板平臺上，但籠內(nèi)不裝水。WAS+HSYA組大鼠于每天進(jìn)行避水應(yīng)激前半小時(shí)，以60 mg/kg的HSYA對其進(jìn)行灌胃，而WAS組以相同的生理鹽水灌胃，SWAS組則不做處理。這些操作于每天早上9點(diǎn)進(jìn)行。

2.4 病理學(xué)特征 癌變易發(fā)生于單側(cè)卵巢，肉眼與MCT很難區(qū)分，囊性腫瘤內(nèi)可見毛發(fā)、脂肪、頭皮等。鱗癌變的畸胎瘤囊壁較厚，囊壁與卵巢組織界限不清，術(shù)中分離困難，結(jié)節(jié)、斑塊、乳頭或菜花樣物長入囊腫壁，作為惡性腫瘤指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞浸潤的模式最早在1997年Kikkawa等[13]提出，分為 3種模式：α模式指腫瘤細(xì)胞與正常基質(zhì)之間有明確的邊界；γ模式指腫瘤和基質(zhì)沒有明顯邊界，呈相互浸潤及擴(kuò)散；β模式介于兩者之間。

如圖5所示，Tak-242(30 μmol/L)孵育15 min顯著阻斷HSYA對大鼠結(jié)腸環(huán)行肌和縱行肌自發(fā)性收縮活性的抑制作用。

為了使PCB實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量、高效率和低成本的生產(chǎn)，必須對SMT的成產(chǎn)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。該軟件的設(shè)計(jì)可以用于對焊膏印刷機(jī)實(shí)時(shí)運(yùn)行狀態(tài)、故障、任務(wù)及其它制造信息進(jìn)行靈活的統(tǒng)計(jì)、分析。對于采集到的制造數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將其轉(zhuǎn)換成動態(tài)曲線的形式顯示出來。實(shí)現(xiàn)了設(shè)備信息深層次分析，加強(qiáng)了對生產(chǎn)過程的監(jiān)管力度，提高了監(jiān)控生產(chǎn)過程的能力。本軟件可以廣泛的用在含有焊膏印刷機(jī)的電子電路制造平臺上。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：將選用的15只Wistar大鼠稱量體質(zhì)量后按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，分別為：SWAS組(假性避水應(yīng)激)、WAS(避水應(yīng)激)組、WAS+HSYA組，每組5只。

“56歲”的美加凈和“59歲”的大白兔奶糖跨界合作，前一段時(shí)間在網(wǎng)上的討論度是盛況空前。兩者推出聯(lián)名款——美加凈牌大白兔奶糖味潤唇膏，完美保留大白兔奶糖的經(jīng)典味道。9月20號十點(diǎn)整在天貓旗艦店限量銷售920套，不到半秒被搶空。據(jù)悉，這款潤唇膏10月正式推出，“雙十一”之前面市。

1.1.2 主要試劑：HSYA凍干粉(貨號：PS0782-0100)購自成都普思生物科技股份有限公司；河豚毒素(TTX)(貨號：X2254-10MG)、二甲基亞砜(DMSO)(貨號：D2650)、葡萄糖(Glucose)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、Tris-HCl、NaOH購自美國Sigma公司；Tak-242(貨號：HY-11109)購自美國MCE(MedChem Express)公司；0.9%氯化鈉注射液購自廣西裕源藥業(yè)有限公司；NaCl、KCl、CaCl

、MgCl

、磷酸二氫鈉(NaH

PO

)、磷酸氫二鈉(Na

HPO

)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑(滬試)有限公司。

麻省理工學(xué)院研究人員約爾·福林克及其同事，此次從一塊較大的聚合物預(yù)制件著手，將半導(dǎo)體器件嵌入預(yù)制件的中空通道。然后，一邊將導(dǎo)線穿進(jìn)中空通道，一邊加熱并拉伸該預(yù)制件，從而形成延展的纖維束。這樣一來，電連接的光發(fā)射或光探測二極管在纖維束內(nèi)軸向均勻地分布開來。該工藝具有內(nèi)在可擴(kuò)展性，可以制造出數(shù)百米長的功能性纖維。一旦經(jīng)過拉伸處理，這些纖維就可以很容易地織進(jìn)織物中。研究團(tuán)隊(duì)將這些二極管纖維放進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的家用洗衣機(jī)中轉(zhuǎn)十圈，發(fā)現(xiàn)其性能沒有受損，證明了它們的耐用性。他們還表明，可以在包含光探測和發(fā)光纖維的兩種紡織品之間建立起雙向光通訊鏈接。不僅如此，這種智能紡織品也可用于測量穿戴者的心率。

1.2.4 大鼠結(jié)腸肌條收縮活性測定：(1)于實(shí)驗(yàn)第11天，將三組大鼠分別斷頸處死后剖腹，在距回盲瓣1 cm處取約3 cm長的結(jié)腸，置入充有體積分?jǐn)?shù)為95%的O

和5%的CO

混合氣體的臺氏緩沖液中，沿腸系膜處剪開腸管并漂洗干凈，黏膜面朝上并用細(xì)銀針固定于硅膠板(在直徑為10 cm的玻璃平皿上鋪sylgard硅膠)上，解剖顯微鏡下迅速剝離黏膜和黏膜下層，沿腸管縱軸走向剪取縱行肌條(3 mm×8 mm)，沿橫軸走向剪取環(huán)行肌條(3 mm×8 mm)。整個(gè)取材過程盡量輕柔，避免肌條活性喪失。將肌條置于盛有恒溫(37 ℃)臺式緩沖液的浴槽中(容積約6 ml)，并持續(xù)充有體積分?jǐn)?shù)為95%的O

和5%的CO

的混合氣體，肌條的一端固定在HSS1(B)型恒溫浴槽底部掛鉤，另一端用絲線固定于TD-1125型張力換能器上。給肌條一定的前負(fù)荷(環(huán)行肌1.0 g前負(fù)荷，縱行肌1.5 g前負(fù)荷)，孵育1 h，臺式液每隔30 min予以更換。每只大鼠選取出現(xiàn)規(guī)律收縮的環(huán)行肌和縱行肌各一根記錄機(jī)械收縮信號，用RM6240多通道生理信號系統(tǒng)(成都)記錄各條帶的收縮幅度和頻率。(2)另取正常大鼠結(jié)腸制備環(huán)行肌條和縱行肌條并在器官浴槽系統(tǒng)進(jìn)行肌條實(shí)驗(yàn)，當(dāng)出現(xiàn)一段規(guī)律收縮信號后，可進(jìn)行其他的相關(guān)處理：(1)每間隔5 min向浴槽內(nèi)依次加入濃度梯度的HSYA溶液(終濃度分別為0.6、1.2、1.8 mol/L)，觀察并記錄其自發(fā)性收縮的幅度和頻率的變化；(2)提前用TTX溶液(終濃度為1 μmol/L)孵育肌條10 min，再以相同濃度梯度的HSYA溶液(終濃度分別為0.6、1.2、1.8 mol/L)間隔5 min處理肌條，觀察并記錄其自發(fā)性收縮的幅度和頻率的變化；(3)提前用Tak-242溶液(終濃度為30 μmol/L)孵育肌條15 min，再以相同濃度梯度的HSYA溶液(終濃度分別為0.6、1.2、1.8 mol/L)間隔5 min處理肌條，觀察并記錄其自發(fā)性收縮的幅度和頻率的變化。

2.1.1 避水應(yīng)激使大鼠糞球排出量顯著增加：避水應(yīng)激導(dǎo)致大鼠腸道運(yùn)動活動顯著增加。在實(shí)驗(yàn)期間，連續(xù)10 d，每日WAS組大鼠的平均每小時(shí)排出的糞便顆粒數(shù)量均高于SWAS組(見圖1A)。在10 d的周期內(nèi)，WAS組大鼠的每小時(shí)排出的糞便顆粒數(shù)顯著高于SWAS組[(4.20±0.47)顆

(1

60±0

14)顆，

=5，

<0.05](見圖1B)。

1.2.3 排便數(shù)量測定：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對每組大鼠的24 h排出糞球顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。此操作固定于每天造模結(jié)束時(shí)，對各組大鼠籠內(nèi)糞便顆粒數(shù)量進(jìn)行測定。計(jì)算各組每天平均每小時(shí)排出糞球量，可評估大鼠的結(jié)腸動力狀況。

慢性阻塞性肺疾病在中醫(yī)學(xué)中是喘證、咳嗽、哮病等多種肺系疾病進(jìn)展成的“肺脹”，中醫(yī)學(xué)者多認(rèn)為本病是因久病肺虛、肺不斂降、痰濁潴留、氣還肺間、肺氣脹滿，復(fù)感外邪所致[8-10]。慢性阻塞性肺疾病患者病程遷延，日久可累及腎臟、脾臟等，導(dǎo)致腎臟、肺臟、脾臟虧虛，而脾肺腎三臟氣化功能失調(diào)，可致痰濁水濕內(nèi)停，逐漸成瘀，最終形成血瘀、痰濁、水飲交錯(cuò)相雜的病癥。其中，穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病屬于本虛標(biāo)實(shí)之癥，并以虛癥為主，往往兼雜痰濕、血瘀。

2 結(jié)果

陳振豪[32]等結(jié)合上海地區(qū)實(shí)行的峰谷電費(fèi)差價(jià)政策，提出了一套適用于空氣源熱泵熱水器的控制方案。該控制方案采用多模式流程控制，用戶可以根據(jù)需求不同和季節(jié)變化自行選擇不同的工作模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該流程控制方案可以顯著地提高系統(tǒng)的能效比和經(jīng)濟(jì)性，具有推廣價(jià)值。

2.1.2 避水應(yīng)激使大鼠近端結(jié)腸的收縮活性顯著增加：避水應(yīng)激使大鼠近端結(jié)腸自發(fā)收縮顯著增加。與SWAS組大鼠相比，WAS組大鼠的環(huán)行肌條和縱行肌條的平均收縮幅度均顯著升高(環(huán)行?。?.90±0.08

0

45±0

07，

<0

05；縱行肌：1

30±0

10

0

70±0

10，

<0.05)(見圖2)。

2.2.1 HSYA顯著降低慢性避水應(yīng)激大鼠的糞球排出量：HSYA顯著降低避水應(yīng)激大鼠的結(jié)腸活動。在實(shí)驗(yàn)期間，連續(xù)10 d，每天HSYA+WAS組大鼠的平均每小時(shí)排出糞便顆粒數(shù)量均低于WAS組(見圖1A)。與WAS組比較，HSYA+WAS組大鼠的平均每小時(shí)排出糞便顆粒數(shù)顯著降低[(2.76±0.42)顆

(4

20±0

47)顆，

=5，

<0.05](見圖1B)。

2.2.2 HSYA顯著降低避水應(yīng)激大鼠的結(jié)腸動力：HSYA顯著降低避水應(yīng)激大鼠的結(jié)腸活力。與WAS組比較，HSYA+WAS組大鼠的環(huán)行肌條和縱行肌條的平均收縮幅度均顯著降低(環(huán)行肌：0.60±0.09

0

90±0

08，

<0

05；縱行?。?

90±0

12

1

30±0

10，

<0.05)(見圖2)。

如圖3所示，HSYA以劑量依賴的方式抑制正常大鼠的縱行肌條和環(huán)行肌條的自發(fā)收縮。浴槽中加入HSYA前，環(huán)行肌條的平均振幅為(0.74±0.09)g，浴槽中加入濃度梯度的HSYA溶液(終濃度分別為0.6、1.2、1.8 mol/L)后環(huán)行肌條的平均振幅分別為(0.52±0.07)g、(0.33±0.06)g和(0.22±0.04)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0

05)。同樣，縱行肌條在添加HSYA前的平均收縮幅度為(1.10±0.12)g，而在以濃度梯度的HSYA溶液(終濃度分別為0.6、1.2、1.8 mol/L)加入浴槽后時(shí)，平均收縮幅度分別為(0.72±0.11)g、(0.43±0.05)g和(0.30±0.07)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

<0

05)。TTX(終濃度為1 μmol/L)預(yù)孵育10 min不影響HSYA對正常大鼠離體肌條自發(fā)性收縮活性的抑制作用(見圖4)。

3 討論

在本研究中，我們研究了HSYA在體內(nèi)和體外對大鼠結(jié)腸自發(fā)性收縮動力的影響及其潛在機(jī)制，本研究結(jié)果表明：(1)慢性避水應(yīng)激大鼠胃腸動力增強(qiáng)，假性避水應(yīng)激對胃腸動力幾乎無影響；(2)HSYA顯著抑制結(jié)腸肌條(環(huán)行肌和縱行肌)的收縮活性，且呈濃度梯度依賴性；(3)TTX不能阻斷HSYA對結(jié)腸收縮的抑制作用；(4)Tak-242能完全阻斷HSYA對結(jié)腸收縮的抑制作用。因此，我們推測HSYA對大鼠結(jié)腸運(yùn)動的抑制作用可能是通過TLR4受體通路。

隨著生活節(jié)奏的加快，競爭加劇、生活成本增加等社會因素，IBS患者呈現(xiàn)年輕化、群體化發(fā)展，故應(yīng)激在其發(fā)病機(jī)制中的作用越來越引起重視

，HSYA與胃腸道運(yùn)動密切相關(guān)，但對于其在IBS中的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。避水應(yīng)激模型很好地模擬了對于困境的恐懼及適應(yīng)，對于求生的渴望及求生技能的熟練掌握，對于承受突發(fā)打擊的敏感，很好地模擬了現(xiàn)實(shí)生活的應(yīng)激環(huán)境，是目前國際比較成熟且公認(rèn)的IBS模型

。研究表明，避水應(yīng)激通過TLR4和促炎細(xì)胞因子途徑誘導(dǎo)內(nèi)臟觸痛和結(jié)腸高通透性，形成大鼠IBS模型

。在本研究中，我們采用經(jīng)典IBS避水應(yīng)激模型以模擬現(xiàn)實(shí)生活中應(yīng)激環(huán)境，造模期間大鼠糞

便排瀉被計(jì)量以評估其結(jié)腸動力變化；其次，我們運(yùn)用肌條實(shí)驗(yàn)評估各組大鼠結(jié)腸動力變化及HSYA對于正常大鼠結(jié)腸平滑肌肌條自發(fā)性收縮的影響，并觀察以神經(jīng)阻滯劑TTX阻滯神經(jīng)作用后對于結(jié)腸平滑肌收縮的影響；從在體動物實(shí)驗(yàn)、離體肌條實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面來探討避水應(yīng)激及HSYA對結(jié)腸動力的作用。

HSYA是從紅花中提取出來的主要成分之一，由Meselhy等

于1993年首次從紅花中分離得到。其具有多種生物學(xué)活性，已被證實(shí)具有活血化瘀、通脈止痛等功效，系統(tǒng)評價(jià)表明，HSYA注射劑對心絞痛和腦梗死均有顯著療效

。除了對心血管疾病的作用外，HSYA還具有神經(jīng)保護(hù)

、抗癌特性

、代謝調(diào)節(jié)

以及對肝、肺和內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

。另有多項(xiàng)研究表明，HSYA對平滑肌表現(xiàn)有舒張作用：李琳等

對離體豬冠狀動脈血管實(shí)驗(yàn)表明，HSYA通過內(nèi)皮-NO-cGMP途徑發(fā)揮血管平滑肌的舒張作用，且能阻斷血管平滑肌上的電壓依賴性鈣通道。史向華等

對小鼠離體子宮平滑肌實(shí)驗(yàn)表明，HSYA具有舒張子宮平滑肌的作用。然而，HSYA對結(jié)腸平滑肌的調(diào)節(jié)作用及對結(jié)腸運(yùn)動影響的研究較少。

最近實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-6、IL-1β和TLR4通路介導(dǎo)了WAS誘導(dǎo)的內(nèi)臟改變

，這與LPS誘導(dǎo)的IBS模型類似。這些結(jié)果表明TLR4細(xì)胞因子信號通路對IBS意義重大

。HSYA對腸蠕動的影響不確定，其具體作用機(jī)制尚不清楚。在我們的研究中證明了HSYA以濃度梯度依賴地抑制了離體結(jié)腸肌條(包括環(huán)行肌和縱行肌)的自發(fā)性收縮活性。為了研究腸神經(jīng)元是否參與HSYA誘導(dǎo)的結(jié)腸肌條抑制作用，我們用TTX阻斷神經(jīng)作用。結(jié)果表明，抑制作用未被TTX預(yù)處理阻斷，HSYA對結(jié)腸肌條的抑制作用仍然存在，說明HSYA可直接作用于結(jié)腸平滑肌細(xì)胞而影響結(jié)腸平滑肌收縮。TLR4受體拮抗劑Tak-242完全阻斷了HSYA對大鼠結(jié)腸平滑肌自發(fā)性收縮的抑制作用，提示HSYA可能是通過TLR4信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其作用。

（1）[薛素姐]把狄希陳的雙手拶上，叫他招供。拶得狄希陳喬聲怪氣的叫喚。（明·西周生《醒世姻緣傳》第63回）

然而，我們的研究可能還存在一些問題。首先，大鼠在體外器官浴研究前未禁食，因此腸道內(nèi)容物可能改變體外收縮力；其次，盡管我們的操作一直很溫和且符合操作規(guī)范，大鼠結(jié)腸取材和清洗過程中也可能影響體外肌條的活性。在我們的研究中，TLR4受體拮抗劑Tak-242完全阻斷了HSYA對大鼠結(jié)腸平滑肌自發(fā)性收縮的抑制作用。因此，關(guān)于是否存在另一種途徑，答案可能是肯定的，因?yàn)槲改c動力受多種因素調(diào)控，而HSYA是一種多靶點(diǎn)藥物。此外，HSYA還有眾所周知的降壓作用

，有研究表明，HSYA的血管舒張作用是通過受體介導(dǎo)的Ca

通道阻斷Ca

內(nèi)流造成的

。盡管如此，這些機(jī)制是否能夠解釋腸道運(yùn)動調(diào)控的抑制作用仍需進(jìn)一步研究。

雖然HSYA調(diào)控大鼠結(jié)腸運(yùn)動的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但其對大鼠結(jié)腸自發(fā)性收縮的抑制作用仍需得到肯定。此外，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其病理生理機(jī)制包括結(jié)腸運(yùn)動能力的改變和內(nèi)臟過敏。IBS以腹痛和結(jié)腸黏滯性為主要特征。在我們的研究中，我們用慢性避水應(yīng)激建立了一個(gè)高運(yùn)動性大鼠模型，并證明HSYA顯著抑制離體結(jié)腸肌條自發(fā)性收縮活性。也就是說，HSYA作為一種治療腹瀉，尤其是IBS的新藥具有開發(fā)潛力，但仍有許多工作需要做。

綜上所述，我們的研究證明HSYA能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激性腸道動力亢進(jìn)，這種效應(yīng)可能與TLR4受體通路有關(guān)，本研究可為臨床用藥提供理論依據(jù)。

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