煙葉廢棄物中綠原酸的提取與應(yīng)用研究進(jìn)展

景浩 郭得敏 熊巍

摘要 綠原酸是煙葉中含量最高的多酚類物質(zhì)，中國作為煙草種植大國，每年烤煙生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的低次等廢棄煙葉，從廢棄煙葉中提取與純化出具有廣泛應(yīng)用價值的綠原酸是煙葉綜合利用的重要途徑。綜述了煙草中綠原酸的提取、純化和檢測方法，對比分析了不同提取工藝、純化方法和檢測方法的應(yīng)用以及各自的優(yōu)勢與不足，并對綠原酸的生物活性和藥理活性作用進(jìn)行了詳細(xì)綜述，以期為后續(xù)煙草等植物中綠原酸的提取與利用提供科學(xué)的方法與理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 煙草;綠原酸;提取工藝;生物活性;研究進(jìn)展

中圖分類號 TS 49? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）06-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research Progress on Extraction and Application of Chlorogenic Acid from Tobacco Waste

JING Hao，GUO De-min，XIONG Wei （Tobacco Monopoly Bureau of Tibet Autonomous Region，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract Chlorogenic acid is the highest content of polyphenols in tobacco leaves.As a large tobacco planting country，China produces a large amount of low-grade waste tobacco during the production process of flue-cured tobacco every year.Extracted and purified from waste tobacco leaves has a wide range of applications.Chlorogenic acid is an important way for comprehensive utilization of tobacco leaves.The extraction，purification and detection methods of chlorogenic acid in tobacco are reviewed，and the application of different extraction processes，purification methods and detection methods as well as their respective advantages and disadvantages are compared and analyzed.The biological and pharmacological activities of chlorogenic acid are analyzed.A detailed review is provided in order to provide scientific methods and theoretical guidance for the subsequent extraction and utilization of chlorogenic acid in tobacco and other plants.

Key words Tobacco;Chlorogenic acid;Extraction process;Biological activity;Research progress

基金項目

中國煙草總公司西藏自治區(qū)公司科技創(chuàng)新項目（QJ- JG-2021-04）。

作者簡介 景浩（1988—），男，河南鞏義人，助理工程師，從事煙草及煙草制品檢驗工作。*通信作者，博士，從事煙草檢驗分析研究。

收稿日期 2021-05-08;修回日期 2021-07-10

綠原酸（chlorogenic acid）是植物有氧呼吸過程合成的一種苯丙素類化合物，是由奎尼酸與咖啡酸組成的縮酚酸。綠原酸是杜仲、金銀花和茵陳等中藥材的主要有效成分之一[1]，具有抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂等多種藥理作用[2-3]，近年來在醫(yī)藥、化工和食品[4]等領(lǐng)域都有應(yīng)用。

綠原酸易溶于甲醇、丙酮和乙醇等有機(jī)溶劑，難溶于乙醚、苯和氯仿。由于綠原酸的分子結(jié)構(gòu)中含有不飽和雙鍵和酯鍵以及多元酚，分子中的鄰二酚羥基極易被氧化，受熱、見光都能使其生物學(xué)活性喪失，在酸性環(huán)境較堿性環(huán)境中更穩(wěn)定[3]。由于其不穩(wěn)定、難溶于水，使得應(yīng)用受到一定限制。目前，提取和純化綠原酸的方法主要有溶劑提取法、微波/超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法等提取方法和柱層析、大孔樹脂吸附法和膜超濾法等純化方法[5]。

綠原酸是烤煙煙葉中含量最高的多酚類物質(zhì)，每年烤煙生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量的廢棄煙葉和煙桿等[6-7]，若能從中提取和純化得到綠原酸等活性物質(zhì)，會大大增加廢棄煙葉的利用價值。該研究綜述綠原酸的提取、純化和檢測方法與綜合利用現(xiàn)狀，以期為從廢棄煙葉中獲取純度更高的綠原酸樣品提供方法和理論支撐，也為煙葉中綠原酸的提取與綜合應(yīng)用提供參考。

1 煙草綠原酸的提取方法

1.1 有機(jī)溶劑提取法

綠原酸的極性較大，根據(jù)“相似相溶”的規(guī)律，可以利用丙酮、甲醇、乙醇等極性較強的有機(jī)溶劑提取。研究表明，選取67%的乙醇水溶液在61 ℃下可以較好地從廢棄煙葉中提取綠原酸與蕓香苷，2種化合物的理論提取量之和可達(dá)到43.59 mg/g[6]。將浸提溫度升高到90 ℃，可以顯著縮短浸提時間，廢次煙葉中綠原酸的提取率可達(dá)0.714%[8]。增加浸提液中甲醇的比例，即使溫度降低，提取時間縮短，烤煙中綠原酸的平均提取率也可達(dá)到90.38%[7]。也有研究表明，浸提劑中甲醇比例的增加尤其是當(dāng)甲醇濃度超過80%后，綠原酸的提取率會顯著下降[9]。

1.2 微波/超聲波輔助提取法

微波/超聲波輔助可以增加煙葉中綠原酸的提取效率[10]，超聲輻照條件下，采用95%乙醇作為浸提劑，可以使得煙草中綠原酸的提取率達(dá)93.65%[11];采用氯化膽堿-蘋果酸組成的深共熔溶劑體系作為提取溶劑，30 min的提取時間，綠原酸的提取量為（16.95±0.69） mg/g[12]。微波輔助提取技術(shù)在提取煙草廢棄物中的綠原酸中也有應(yīng)用，與傳統(tǒng)的回流萃取相比，微波萃取提取率更高、時間更短。吳曉瓊[13]以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇水溶液為提取劑，在微波功率400 W和溫度60 ℃下，萃取90 s，煙葉廢棄物中綠原酸的提取率可達(dá)1.22%。

1.3 超臨界流體提取法

超臨界流體提取法能在較低溫度下提取煙葉中的綠原酸，從而解決綠原酸熱穩(wěn)定性差、在較高提取溫度下容易分解的問題，該方法將萃取和蒸餾分離合并，可以簡化流程、節(jié)省能源消耗，提取的綠原酸純度可以在90%以上，但是也存在設(shè)備昂貴和維護(hù)費用高等缺陷，目前綠原酸的超臨界流體提取還沒有大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用[14]。

2 煙草綠原酸的分離純化方法

2.1 膜分離法

超濾法是利用具有一定通透性的超濾膜，在壓力作用下，將大分子蛋白、糖類等雜質(zhì)分離出來的膜分離法，小分子物質(zhì)可透過膜從而達(dá)到分離和純化的目的。該方法具有操作簡單、分離效率高、能耗低、無污染等優(yōu)點，但也存在對提取液的預(yù)處理要求高、膜被污染后難以清洗的缺點，該方法的產(chǎn)量也受膜分離效率等的制約。研究對比了醇沉法和膜分離法對綠原酸的純化效果，超濾法分離純化后綠原酸的回收率可達(dá)99%，而用70%的醇沉法純化綠原酸的回收率約為68%[15]。

2.2 柱層析法

柱層析法廣泛應(yīng)用于分離純化煙草提取物中的綠原酸，該方法主要利用具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子樹脂對煙草中綠原酸的吸附分離性能，通過洗脫溶液的共同作用，能夠得到純度較高的綠原酸。該方法具有操作簡單、分離效率高、機(jī)械強度高、穩(wěn)定性好和可再生等優(yōu)點，缺點是耗時較長，使用后樹脂清洗較困難。目前，廣泛應(yīng)用于綠原酸分離純化的樹脂主要有XDA-1樹脂（吸附和解析效果俱佳，綠原酸總回收率可達(dá)80.06%）[11]、HPD-400大孔樹脂（柱層析回收率72.30%）[16]和D101大孔樹脂（動態(tài)回收率為70.37%）[17]等。

2.3 制備色譜法

現(xiàn)代制備色譜可以用于分離純化出純度較高（純度>95%）的綠原酸產(chǎn)品，是綠原酸應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域不可缺少的分離手段[18]。制備色譜法具有分離速度快、選擇性強、產(chǎn)品純度好、自動化程度高的優(yōu)點，但是也存在產(chǎn)量低、分離設(shè)備造價高昂、技術(shù)要求高、對操作人員的素質(zhì)要求較高的缺點，目前該方法僅用于試驗中制備高純度的綠原酸。

3 煙草綠原酸的檢測方法

目前，已見報道的綠原酸檢測方法有極譜法[19]、薄層光密度法、紫外分光光度法、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）[20-21]、流動注射電致化學(xué)發(fā)光法、分子印記法、氣相色譜法、高效液相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用法等。

3.1 液相色譜法

目前，涉及綠原酸含量的分析測試方法中，HPLC法的應(yīng)用最為廣泛，一般選取反相色譜柱分離煙草基質(zhì)樣品中的綠原酸，該方法測定綠原酸分離效果顯著，方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性都較好[22]，由于HPLC配備的檢測器不同，其對綠原酸及其異構(gòu)體的選擇性還存在一定的局限性。基于此，2006年發(fā)布的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)就選取HPLC法作為煙草及煙草制品中綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[23]。易小麗等[24]建立了煙葉中綠原酸及其異構(gòu)體的HPLC-UV檢測方法，選取甲醇-水溶液萃取煙葉中的綠原酸，采用反相C18色譜柱作為分離柱，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，方法的檢出限范圍為0.013～0.028 mg/L，回收率在92.0%～104.0%。王晉等[25]采用UPLC法測定煙草中的綠原酸等8種多酚類化合物，方法的檢出限為0.35～1.03 μg/g，樣品分析時間為6 min，選取了一種集樣品提取、固相萃取凈化、過濾和轉(zhuǎn)移為一體的樣品萃取瓶，提升了樣品處理效率。李力等[26]也選取UPLC法同時快速測定烤煙中的6種多酚，方法的檢出限為3.7～9.9 μg/g，回收率為94.4%～106.8%，該方法的前處理簡單，分析時間短，適合于烤煙中綠原酸等多種多酚含量的測定。由于綠原酸不穩(wěn)定、易發(fā)生水解，在流動性中加入一定比例的乙酸或磷酸能夠抑制綠原酸的羥基解離，有效改善目標(biāo)色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）是最為常用的復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量化合物的分析方法，該方法也廣泛應(yīng)用于煙草及煙草廢棄物中綠原酸等多酚類物質(zhì)的準(zhǔn)確定量分析。王海燕等[27]采用HPLC-PDA-MS法對煙草中的多種多酚類化合物的定性分析，選取53%的甲醇作為提取劑，在微波作用下提取，該方法下總多酚得率為22.38 mg/g（干重）。LC-MS/MS還可以實現(xiàn)煙葉中10多種多酚類物質(zhì)的同時定量測定，各目標(biāo)化合物的檢出限均低于200 ng/mL[28]。沈丹紅等[29]采用HPLC-UV/MS同時測定煙葉中綠原酸等25種多酚類物質(zhì)，各目標(biāo)化合物的檢出限均低于132 ng/mL，回收率為91.0%～112.4%。Ncube等[30]采用基于源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離的UPLC-QTOF-MS/MS法測定了煙草組織中的綠原酸和相關(guān)的肉桂酸代謝物，該方法可以檢測解析綠原酸及其代謝物的異構(gòu)體。

3.3 其他新檢測方法

綠原酸的快速檢測方法也是近年來的一個研究方向，基于分子印記聚合物的高選擇性、壓電石英晶體傳感器的響應(yīng)靈敏性能，吳靈等[31]研制出分子印記聚合物壓電模擬生物傳感器測定煙草中的綠原酸的方法，檢出限達(dá)到2.5×10-8 mol/L，回收率為96.7%～105.0%，RSD為3.7%，該方法具有選擇性好、線性范圍寬、靈敏度高、準(zhǔn)確度好等特點。

4 煙草綠原酸的生物活性及應(yīng)用

綠原酸作為金銀花和茵陳等中藥材的主要藥理活性物質(zhì)之一，具有廣泛的生物活性，目前，對綠原酸生物活性的研究已深入到醫(yī)藥、保健、食品和日用化工等眾多領(lǐng)域。

4.1 抗炎癥反應(yīng)作用

綠原酸含有一定量的R-OH基，能夠形成氫自由基，產(chǎn)生抗氧化作用，以消除超氧陰離子和羥基自由基等的活性，從而保護(hù)組織免受氧化損害，因此，綠原酸是一種較為有效的酚型抗氧化劑。Shi等[32]的研究也顯示，綠原酸能夠通過激活Nrf2信號通路和抑制NLRP3因子，達(dá)到降低極性肝損傷后的炎癥反應(yīng)作用。丹參酚B和綠原酸的聯(lián)合使用會有效抑制因多氯聯(lián)苯暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，這也是通過激活Nrf2信號通路來實現(xiàn)的[33]。新綠原酸能夠通過上調(diào)Nrf2/HO-1和AMPK信號通路來抑制脂多糖[34]或過氧化氫[35]引起的炎癥反應(yīng)，也可以用來抑制巨噬細(xì)胞過多導(dǎo)致的急性或慢性的炎癥反應(yīng)，這一作用機(jī)理在MC3T3-E1細(xì)胞試驗中也得到了驗證[35]。一項基于牛乳房上皮細(xì)胞的體外試驗也表明，綠原酸的使用能夠降低炎癥反應(yīng)，預(yù)示綠原酸能夠作為一種潛在的治療金黃色葡萄球菌引起的牛乳房炎癥的手段[36]。綠原酸能夠通過抑制typeⅡ5-α還原酶的活性抑制良性前列腺增生小鼠的前列腺增生[37]。

4.2 神經(jīng)保護(hù)作用

綠原酸的使用能夠防止氧化應(yīng)激作用引起的腦神經(jīng)退化，這一作用在很多體外和體內(nèi)試驗中得到證實[38-39]?；谌X缺血再灌注大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有神經(jīng)保護(hù)作用，主要是通過抑制或下調(diào)腦缺血相關(guān)的分子標(biāo)志物實現(xiàn)的[40]。Shi等[41]的研究顯示，綠原酸有緩解抑郁的作用，這主要是通過保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗皮質(zhì)酮引起的神經(jīng)毒性來實現(xiàn)的。此外，綠原酸還可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)水平使得6-羥基多巴胺導(dǎo)致的神經(jīng)毒性降低，這也預(yù)示綠原酸應(yīng)該能夠有效降低帕金森病人體內(nèi)氧化應(yīng)激水平和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平[42]。de Lima等[43]對比了綠原酸對遭受慢性束縛應(yīng)激的小鼠腦內(nèi)各種標(biāo)志物的變化，發(fā)現(xiàn)綠原酸的使用會下調(diào)應(yīng)激小鼠海馬體和大腦皮層中膠質(zhì)纖維酸性蛋白和紋狀體中腫瘤壞死因子α（TNFα）的過表達(dá)。綠原酸及其相關(guān)化合物還能夠保護(hù)大鼠皮層神經(jīng)元免受谷氨酸鹽引起的興奮中毒和氧化應(yīng)激[44]。

4.3 抗菌和抗病毒作用

綠原酸具有抗菌作用，因為綠原酸能夠與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)合，破壞膜結(jié)構(gòu)，損耗膜內(nèi)電位，釋放胞內(nèi)大分子物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[45]。綠原酸對金黃色釀膿葡萄球菌有抑制作用[46]。

綠原酸能夠通過調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)降低銅綠假單胞菌毒性，因此，綠原酸是一種潛在的抗銅綠假單胞菌感染的藥物[47]。Su等[48]研究了綠原酸對食源性病原體銅綠假單胞菌的抗菌活性和機(jī)理，認(rèn)為綠原酸能夠提高細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性，導(dǎo)致線粒體外模的剝落，擾亂細(xì)胞內(nèi)的代謝，最終導(dǎo)致銅綠假單胞菌的死亡。Martínez等[49]研究顯示，綠原酸是一種致病性真菌的殺菌劑，這主要源于綠原酸能夠促進(jìn)真菌的細(xì)胞溶菌作用，還會使得真菌孢子的膜滲透性增加，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。

綠原酸對流感病毒H1N1和H3N2具有抑制作用[50]，能夠有效緩解流感病人肺部的炎癥反應(yīng)，這也顯示綠原酸能夠作為神經(jīng)氨酸苷酶阻滯劑抑制細(xì)胞和動物模型中的甲型流感病毒（H1N1/H3N2），因此，綠原酸可以作為流感感染的潛在治療手段[50]。

4.4 對心血管作用

綠原酸具有清除自由基和抗氧化的作用，在一定程度上抑制由過氧化氫導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血小板的激活，達(dá)到防治血栓的功效。體外試驗顯示：綠原酸能夠通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的SIRT1因子和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK/PGC-1信號通路，從而降低oxLDL引起的氧化應(yīng)激水平和線粒體功能障礙[51]。綠原酸能夠通過抑制溶血磷脂酰膽堿處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中瞬間受體電位通道蛋白1（TRPC1）來限制鈣池操縱的鈣通道的作用和活性氧自由基的產(chǎn)生，抑制溶血磷脂酰膽堿帶來的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而有效防止動脈粥樣硬化[52]。此外，綠原酸對氫過氧化物誘導(dǎo)的內(nèi)皮素細(xì)胞損傷和血小板血栓素生物合成有抑制作用。

4.5 降低肝損傷作用 綠原酸能夠通過降低體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平從而達(dá)到防治肝纖維化的作用[53]。異綠原酸可以通過激活肝細(xì)胞中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）達(dá)到降低軟脂酸誘導(dǎo)的脂肪毒性作用，同時也能夠降低肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[54]。體外試驗也顯示，綠原酸能夠通過阻止軟脂酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，從而減少脂肪酸對肝臟的損傷作用[55]。Wu等[56]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸對膽管結(jié)扎術(shù)導(dǎo)致的肝損傷有一定的保護(hù)作用，這一保護(hù)機(jī)制在膽管結(jié)扎小鼠模型實驗中得到驗證，綠原酸能夠調(diào)節(jié)膽汁酸和膽紅素的運輸與代謝，從而有助于降低肝毒性和膽汁淤積，這一作用主要是通過降低膽汁酸和膽紅素的攝入合成，促進(jìn)膽汁酸和膽紅素的排泄來實現(xiàn)的[57]。Wei等[58-59]的研究也顯示，天然的綠原酸能夠通過激活ERK/Nrf2抗毒性通路，降低對乙酰氨基酚、雷公藤內(nèi)酯醇[60]和氨甲蝶呤[61]引起的肝臟毒性，這也預(yù)示綠原酸可以作為對乙酰氨基酚或雷公藤內(nèi)酯醇導(dǎo)致的肝臟中毒的解毒劑。綠原酸和水飛薊素的聯(lián)合使用可以降低因四氯化碳導(dǎo)致的肝損傷[62]。

4.6 對消化道的保護(hù)作用

綠原酸對胃食返流性胃炎有一定治療作用，因為胃食返流會導(dǎo)致食管黏膜和胃黏膜的炎癥，而綠原酸有清除自由基和降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的作用，綠原酸的使用能夠降低食管的脂質(zhì)過氧化水平和降低谷胱甘肽/還原性谷胱甘肽的比率，從而對食管和胃黏膜起到一定的保護(hù)作用[63]。綠原酸可抑制因酒精導(dǎo)致的細(xì)胞損傷（PC12 細(xì)胞），這主要是通過上調(diào)相關(guān)蛋白-43的表達(dá)和抑制線粒體凋亡通路來實現(xiàn)的[64]。

4.7 降脂降糖作用

綠原酸能在一定程度上預(yù)防糖尿病的發(fā)生[65]，這主要源于綠原酸能夠增加鏈脲佐菌實驗性糖尿病大鼠的胰島素敏感度，提高葡萄糖耐受能力和降低基礎(chǔ)的高血糖癥[66]。一項基于秀麗隱桿線蟲的試驗也顯示，綠原酸能夠通過調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的胰島素/IGF-1通路增加其壽命[67]。研究表明，綠原酸對2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗有明顯改善作用，綠原酸可在一定程度上通過影響胰島素含量來調(diào)節(jié)葡萄糖向骨骼肌的轉(zhuǎn)運機(jī)制。

4.8 其他作用

綠原酸還能夠通過MAPK/Akt信號通路降低小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的鋁中毒作用[68]。另外一項原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞試驗也顯示，綠原酸能夠通過螯合作用和抗氧化作用降低鋁接觸導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用[69]。綠原酸還能夠降低小鼠伽馬射線的輻射致死率，這是源于綠原酸與小鼠體內(nèi)1，1-二苯基-2-吡啶酰肼自由基與劑量的依賴關(guān)系，從而表現(xiàn)出強的抗氧化活性，進(jìn)而會降低伽馬射線導(dǎo)致的小鼠死亡率[70]。外敷含有綠原酸的微乳液能夠保護(hù)皮膚免受紫外線損傷，這一作用在豚鼠上得到驗證[71]。體內(nèi)試驗顯示，綠原酸對視網(wǎng)膜退化有一定的保護(hù)作用。綠原酸及咖啡代謝物能夠預(yù)防視網(wǎng)膜變性，因為這些化合物到達(dá)眼內(nèi)后能夠通過降低組織缺氧、視神經(jīng)壓力來達(dá)到顯著降低細(xì)胞凋亡的效果[72]。

5 存在問題與展望

綜上可知，由于綠原酸難溶于水、易水解或熱解，在提取煙葉中的綠原酸時需要增加提取劑中有機(jī)溶劑的比例，而有機(jī)溶劑的增加會導(dǎo)致非極性雜質(zhì)提取量的增加，導(dǎo)致后續(xù)的純化工藝難度增加。此外，若選用一般的混合溶劑提取方法，需要增加提取溫度以提高提取效率、縮短提取時間，而綠原酸屬于易水解和熱解的化合物，這會導(dǎo)致回收率顯著降低?；诖?，應(yīng)選取其他的方式如微波輔助或超聲輔助來增加提取效率。

膜分離、柱層析和高效液相制備色譜是最為常用的綠原酸純化的方法，3種方法各有利弊，在對純度要求不是特別高、又需制備大量的綠原酸樣品時，宜選取柱層析法;若需制備少量高純度的綠原酸，或者制備藥用級或綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品時，宜選用高效液相制備色譜。同樣由于綠原酸難溶于水，易水解或熱解，導(dǎo)致準(zhǔn)確測定其含量存在一定的困難，降低柱溫和在流動相中加入一定的酸有利于抑制綠原酸的熱解和水解，提高分析的準(zhǔn)確度。UPLC的使用有助于提高方法的選擇性、降低方法的分析時間、提高檢測通量，該方法與串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)合是以后復(fù)雜樣品基質(zhì)中綠原酸最為主要的檢測方法。

綠原酸雖然具有較為廣泛的藥理作用，但由于其不穩(wěn)定和難溶于水的特性，使得其作為口服藥物的生物利用度低，導(dǎo)致其藥物研發(fā)存在較大的局限性。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，確需制備綠原酸相關(guān)的口服藥物可以通過改進(jìn)制劑方式如微粉化或者絡(luò)合法來改進(jìn)。此外，對綠原酸的原型分子進(jìn)行修飾或者改性可能會增加其溶解性或者藥理活性，鑒于其極其廣泛的藥理活性，未來以綠原酸為原型物生產(chǎn)出一類新型高效低不良反應(yīng)的藥物，可為保障人類健康發(fā)揮更大的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]王珍，李宗蕓.綠原酸的生物活性及甘薯綠原酸研究進(jìn)展[J].江蘇師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，35（3）：30-34，48.

[2] 王海燕，張仕華，趙謀明，等.煙草綠原酸分離純化及其抑菌性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（3）：233-236，213.

[3] 王慶華，杜婷婷，張智慧，等.綠原酸的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報，2020，55（10）：2273-2280.

[4] 王曉梅，奚宇，范新光，等.綠原酸的生物利用率和抗氧化活性研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報，2019，19（1）：271-279.

[5] BANO

ZˇIC′ M，BANJARI I，JAKOVLJEVIC′? M，et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of some bioactive compounds from tobacco waste[J].Molecules，2019，24（8）：1-14.

[6] 許詩豪，彭曙光，羅井清，等.低次煙葉中綠原酸與蕓香苷提取工藝的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2019，35（1）：57-62.

[7] 張偉娜，王志剛，李巖，等.不同提取工藝對烤煙品種NC102中綠原酸提取率的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2017（1）：106-108.

[8] 衛(wèi)佳.廢次煙葉中綠原酸提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（12）：79-84.

[9] 李曉芹，杜詠梅，張懷寶，等.煙草綠原酸、蕓香苷、煙堿和茄尼醇的提取技術(shù)研究[J].中國煙草科學(xué)，2015，36（1）：1-4.

[10] 陳育如，唐剛，劉虎，等.煙草廢料中綠原酸的提取工藝研究[J].生物加工過程，2009，7（6）：55-58.

[11] 艾心靈，王洪新，朱松.煙草中綠原酸、煙堿和茄尼醇的超聲波輔助提取[J].煙草科技，2007，40（4）：45-48.

[12] 尚憲超，譚家能，杜詠梅，等.超聲輔助深共熔溶劑提取兩種煙草多酚的方法研究[J].中國煙草科學(xué)，2017，38（6）：55-60.

[13] 吳曉瓊.微波輔助提取煙草廢棄物中的綠原酸[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（34）：19579-19580.

[14] 馬柏林，梁淑芳.杜仲中綠原酸的提取分離研究進(jìn)展[J].陜西林業(yè)科技，2003（4）：74-79.

[15] 劉振麗，張秋海，歐興長，等.超濾及醇沉對金銀花中綠原酸的影響[J].中成藥，1996，18（2）：4-6.

[16] 古君平，魏萬之.廢次煙葉中綠原酸的提取與分離[J].煙草科技，2010，43（2）：43-47.

[17] 張獻(xiàn)忠，鐘烈洲，黃海智，等.大孔樹脂純化廢次煙葉中煙草多酚的工藝[J].化工進(jìn)展，2012，31（12）：2626-2631.

[18] 彭密軍，周春山，鐘世安，等.制備型高效液相色譜法分離純化綠原酸[J].中南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，35（3）：408-412.

[19] CHOUTEAU J，LOCHE J.Polarographic determination of the chlorogenic acid of tobacco：Polarographic behavior of caffeic and chlorogenic acids in basic media[J].Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences，1962，254：2064-2066.

[20] HAN S Q.Capillary electrophoresis with chemiluminescence detection of rutin and chlorogenic acid based on its enhancing effect for the luminol-ferricyanide system[J].Analytical sciences，2005，21（11）：1371-1374.

[21] LI Z B，HUANG D N，TANG Z X，et al.Fast determination of chlorogenic acid in tobacco residues using microwave-assisted extraction and capillary zone electrophoresis technique[J].Talanta，2010，82（4）：1181-1185.

[22] 陳開波，田振峰，陳闖.RP-HPLC法測定煙草中綠原酸含量的研究[J].分析測試技術(shù)與儀器，2005，11（1）：60-62.

[23] 國家煙草專賣局.煙草及煙草制品 多酚類化合物 綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的測定：YC/T 202—2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006：1-12.

[24] 易小麗，周昭娟，王麗達(dá)，等.高效液相色譜法測定煙葉中的綠原酸及其異構(gòu)體[J].理化檢驗-化學(xué)分冊，2019，55（1）：78-82.

[25] 王晉，黃海濤，劉欣，等.快速高效液相色譜法測定煙草中的多酚[J].煙草科技，2018，51（11）：66-72.

[26] 李力，李東亮，鄧發(fā)達(dá)，等.UPLC法同時測定烤煙中6種多酚的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2018，34（10）：131-137.

[27] 王海燕，崔春，趙謀明，等.煙草多酚提取工藝優(yōu)化及成分定性分析[J].華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，36（3）：64-68.

[28] 劉萍萍，盧紫舒，羅朝鵬，等.高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定煙葉中10種多酚類化合物[J].煙草科技，2019，52（6）：42-50.

[29] 沈丹紅，路鑫，常玉瑋，等.高效液相色譜-紫外/質(zhì)譜檢測法聯(lián)合測定新鮮煙葉中的25種酚類物質(zhì)[J].色譜，2014，32（1）：40-46.

[30] NCUBE E N，MHLONGO M I，PIATER L A，et al.Analyses of chlorogenic acids and related cinnamic acid derivatives from ?Nicotiana tabacum ?tissues with the aid of UPLC-QTOF-MS/MS based on the in-source collision-induced dissociation method[J].Chemistry central journal，2014，8（1）：1-10.

[31] 吳靈，盧紅兵，鐘科軍.分子印記聚合物壓電模擬生物傳感器測定煙草中的綠原酸[J].煙草科技，2004，37（6）：16-19，28.

[32] SHI A M，SHI H T，WANG Y，et al.Activation of Nrf2 pathway and inhibition of NLRP3 inflammasome activation contribute to the protective effect of chlorogenic acid on acute liver injury[J].International immunopharmacology，2018，54：125-130.

[33] CHEN L J，LI Y，YIN W Q，et al.Combination of chlorogenic acid and salvianolic acid B protects against polychlorinated biphenyls-induced oxidative stress through Nrf2[J].Environmental toxicology and pharmacology，2016，46：255-263.

[34] PARK S Y，JIN M L，YI E H，et al.Neochlorogenic acid inhibits against LPS-activated inflammatory responses through up-regulation of Nrf2/HO-1 and involving AMPK pathway[J].Environmental toxicology and pharmacology，2018，62：1-10.

[35] HAN D D，CHEN W，GU X L，et al.Cytoprotective effect of chlorogenic acid against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in MC3T3-E1 cells through PI3K/Akt-mediated Nrf2/HO-1 signaling pathway[J].Oncotarget，2017，8（9）：14680-14692.

[36] GONG X X，SU X S，ZHAN K，et al.The protective effect of chlorogenic acid on bovine mammary epithelial cells and neutrophil function[J].Journal of dairy science，2018，101（11）：10089-10097.

[37] HUANG Y，CHEN H G，ZHOU X，et al.Inhibition effects of chlorogenic acid on benign prostatic hyperplasia in mice[J].European journal of pharmacology，2017，809：191-195.

[38] HEITMAN E，INGRAM D K.Cognitive and neuroprotective effects of chlorogenic acid[J].Nutritional neuroscience，2017，20（1）：32-39.

[39] LI Y J，SHI W，LI Y D，et al.Neuroprotective effects of chlorogenic acid against apoptosis of PC12 cells induced by methylmercury[J].Environmental toxicology and pharmacology，2008，26（1）：13-21.

[40] KUMAR G，MUKHERJEE S，PALIWAL P，et al.Neuroprotective effect of chlorogenic acid in global cerebral ischemia-reperfusion rat model[J].Naunyn schmiedebergs arch pharmacol，2019，392（10）：1293-1309.

[41] SHI X W，ZHOU N，CHENG J Y，et al.Chlorogenic acid protects PC12 cells against corticosterone-induced neurotoxicity related to inhibition of autophagy and apoptosis[J].BMC pharmacology and toxicology，2019，20（1）：1-10.

[42] SHAN S，TIAN L，F(xiàn)ANG R.Chlorogenic acid exerts beneficial effects in 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity by inhibition of endoplasmic reticulum stress[J].Medical science monitor，2019，25：453-459.

[43] DE LIMA M E，CEOLIN COLPO A Z，MAYA-LPEZ M，et al.Comparing the effects of chlorogenic acid and ?Ilex paraguariensis ?extracts on different markers of brain alterations in rats subjected to chronic restraint stress[J].Neurotoxicity research，2019，35（2）：373-386.

[44] REBAI O，BELKHIR M，SANCHEZ-GOMEZ M V，et al.Differential molecular targets for neuroprotective effect of chlorogenic acid and its related compounds against glutamate induced excitotoxicity and oxidative stress in rat cortical neurons[J].Neurochemical research，2017，42（12）：3559-3572.

[45] LOU Z X，WANG H X，ZHU S，et al.Antibacterial activity and mechanism of action of chlorogenic acid[J].Journal of food science，2011，76（6）：M398-M403.

[46] WANG L，BI C W，CAI H J，et al.The therapeutic effect of chlorogenic acid against ?Staphylococcus aureus ?infection through sortase A inhibition[J].Frontiers in microbiology，2015，6：1-12.

[47] WANG H，CHU W，YE C，et al.Chlorogenic acid attenuates virulence factors and pathogenicity of ?Pseudomonas aeruginosa ?by regulating quorum sensing[J].Applied microbiology & biotechnology，2019，103（2）：903-915.

[48] SU M M，LIU F，LUO Z，et al.The antibacterial activity and mechanism of chlorogenic acid against foodborne pathogen ?Pseudomonas aeruginosa [J].Foodborne pathogens and disease，2019，16（12）：823-830.

[49] MART ?NEZ G，REGENTE M，JACOBI S，et al.Chlorogenic acid is a fungicide active against phytopathogenic fungi[J].Pesticide biochemistry and physiology，2017，140：30-35.

[50] DING Y，CAO Z Y，CAO L，et al.Antiviral activity of chlorogenic acid against influenza A （H1N1/H3N2） virus and its inhibition of neuraminidase[J].Scientific reports，2017，7：1-11.

[51] TSAI K L，HUNG C H，CHAN S H，et al.Chlorogenic acid protects against oxLDL-induced oxidative damage and mitochondrial dysfunction by modulating SIRT1 in endothelial cells[J/OL].Molecular nutrition & food research，2018，62（11）[2021-01-17].https：//doi.org/10.1002/mnfr.201700928.

[52] JUNG H J，IM S S，SONG D K，et al.Effects of chlorogenic acid on intracellular calcium regulation in lysophosphatidylcholine-treated endothelial cells[J].BMB reports，2017，50（6）：323-328.

[53] SHI H T，SHI A M，DONG L，et al.Chlorogenic acid protects against liver fibrosis ?in vivo ?and ?in vitro ?through inhibition of oxidative stress[J].Clinical nutrition，2016，35（6）：1366-1373.

[54] YANG L L，WEI J C，SHENG F Y，et al.Attenuation of palmitic acid-induced lipotoxicity by chlorogenic acid through activation of SIRT1 in hepatocytes[J].Molecular nutrition & food research，2019，63（14）：1-12.

[55] ZHANG Y，MIAO L S，ZHANG H J，et al.Chlorogenic acid against palmitic acid in endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis resulting in protective effect of primary rat hepatocytes[J].Lipids in health and disease，2018，17（1）：1-8.

[56] WU D H，BAO C Y，LI L H，et al.Chlorogenic acid protects against cholestatic liver injury in rats[J].Applied microbiology and biotechnology，2015，129（3）：177-182.

[57] ZHU L L，WANG L，CAO F，et al.Modulation of transport and metabolism of bile acids and bilirubin by chlorogenic acid against hepatotoxicity and cholestasis in bile duct ligation rats：Involvement of SIRT1-mediated deacetylation of FXR and PGC-1α[J].Journal of hepato-biliary-pancreatic sciences，2018，25（3）：195-205.

[58] WEI M J，ZHENG Z Y，SHI L，et al.Natural polyphenol chlorogenic acid protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity by activating ERK/Nrf2 antioxidative pathway[J].Toxicological sciences，2018，162（1）：99-112.

[59] ZHENG Z Y，SHENG Y C，LU B，et al.The therapeutic detoxification of chlorogenic acid against acetaminophen-induced liver injury by ameliorating hepatic inflammation[J].Chemico-biological interactions，2015，238：93-101.

[60] WANG J M，CHEN R X，ZHANG L L，et al. In vivo ?protective effects of chlorogenic acid against triptolide-induced hepatotoxicity and its mechanism[J].Pharmaceutical biology，2018，56（1）：626-631.

[61] ALI N，RASHID S，NAFEES S，et al.Protective effect of Chlorogenic acid against methotrexate induced oxidative stress，inflammation and apoptosis in rat liver：An experimental approach[J].Chemico-biological interactions，2017，272：80-91.

[62] AL-RASHEED N，F(xiàn)ADDAH L，AL-RASHEED N，et al.Protective effects of silymarin，alone or in combination with chlorogenic acid and/or melatonin，against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity[J].Pharmacognosy magazine，2016，12（S3）：S337-S345.

[63] KANG J W，LEE S M.Protective effects of chlorogenic acid against experimental reflux esophagitis in rats[J].Biomolecules & therapeutics，2014，22（5）：420-425.

[64] FANG S Q，WANG Y T，WEI J X，et al.Beneficial effects of chlorogenic acid on alcohol-induced damage in PC12 cells[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2016，79：254-262.

[65] YAN Y W，ZHOU X，GUO K X，et al.Use of chlorogenic acid against diabetes mellitus and its complications[J].Journal of immunology research，2020，2020：1-6.

[66] FERRARE K，BIDEL L P R，AWWAD A，et al.Increase in insulin sensitivity by the association of chicoric acid and chlorogenic acid contained in a natural chicoric acid extract （NCRAE） of chicory （ Cichorium intybus ?L.） for an antidiabetic effect[J].J Ethnopharmacol，2018，215：241-248.

[67] ZHENG S Q，HUANG X B，XING T K，et al.Chlorogenic acid extends the lifespan of ?Caenorhabditis elegans via ?insulin/IGF-1 signaling pathway[J].The journals of gerontology series A：Biological sciences and medical sciences，2017，72（4）：464-472.

[68] CHENG D，ZHANG X Y，TANG J L，et al.Chlorogenic acid protects against aluminum toxicity via MAPK/Akt signaling pathway in murine RAW264.7 macrophages[J].Journal of inorganic biochemistry，2019，190：113-120.

[69] WANG X M，F(xiàn)AN X G，YUAN S Z，et al.Chlorogenic acid protects against aluminium-induced cytotoxicity through chelation and antioxidant actions in primary hippocampal neuronal cells[J].Food & function，2017，8（8）：2924-2934.

[70] HOSSEINIMEHR S J，ZAKARYAEE V，AHMADI A，et al.Radioprotective effects of chlorogenic acid against mortality induced by gamma-irradiation in mice[J].Methods and findings in experimental and clinical pharmacology，2008，30（1）：13-16.

[71] KITAGAWA S，YOSHII K，MORITA S Y，et al.Efficient topical delivery of chlorogenic acid by an oil-in-water microemulsion to protect skin against UV-induced damage[J].Journal of immunology research，2011，59（6）：793-796.

[72] JANG H，CHOI Y，AHN H R，et al.Effects of phenolic acid metabolites formed after chlorogenic acid consumption on retinal degeneration ?in vivo [J].Molecular nutrition & food research，2015，59（10）：1918-1929.