阿奇霉素微生物限度檢查方法適用性驗證

錢良友 伍冰冰 向大位

摘要：目的 ?建立阿奇霉素微生物限度檢查方法。方法 ?按《中國藥典》2020版四部生物檢查法進行試驗。加入銅綠假單胞菌等5個試驗菌，測定回收率。結果 ?需氧菌總數(shù)采用薄膜過濾法，霉菌和酵母菌總數(shù)采用傾注法，各試驗菌回收率均在0.5～2.0范圍，控制菌檢查方法可行。結論 ?本試驗建立的方法可用于阿奇霉素微生物限度檢查。

關鍵詞：阿奇霉素、方法適用性、回收率、薄膜過濾法、傾注法

【中圖分類號】 F763 【文獻標識碼】 A ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）06--02

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for microbial limit test of azithromycin. METHODS：The test was carried out according to the biological examination method of ?the ?fourth part of ?the 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia principles. The recovery rate was determined by adding 5 experimental bacteria such as Pseudomonas aeruginosa.RESULTS：The total number of aerobic bacteria was membrane filtration method， and the number of mold and yeastwas pouring method. The recovery rate of each test bacteria was in the range of 0.5～ 2.0. The method of controlbacteria examination was feasible.CONCLUSION： The established method can be used for the microbial limit test of azithromycin.

KEYWORDS Azithromycin; Method applicability recovery; Membrane fitration;Pour method

阿奇霉素屬于大環(huán)內酯類的第二代抗生素[1]，抗菌譜廣泛，尤其對需氧菌和厭氧菌的抗菌能力更加顯著，為臨床應用帶來了活力[2-3]。用于治療化膿性鏈球菌引起的急性咽炎或者是扁桃體炎或者是敏感細菌引起的鼻竇炎、中耳炎、急性支氣管炎以及慢性支氣管炎急性發(fā)作時的一種藥物[4]。阿奇霉素因具有強力殺滅病原微生物的作用在臨床治療中廣泛應用，對其治療機制的分析和探討發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素一方面通過殺滅病原微生物來降低感染引起的炎癥反應、平息免疫活化，表現(xiàn)出對先天免疫系統(tǒng)中性粒細胞趨化和巨噬細胞極化的影響，另一方面以某種機制對后天免疫系統(tǒng)的 T 細胞活化和細胞因子表達有顯著調節(jié)作用[4]。隨著阿奇霉素在臨床上的應用越來越廣泛，為使臨床用藥更加安全有效，實施微生物限度檢查是確保藥品衛(wèi)生質量的重要途徑。

本研究參考《中國藥典》2020年版四部生物檢查法[5]，建立了阿奇霉素的微生物限度檢查方法，該方法可為其他大環(huán)內酯類抗生素藥物微生物限度檢查法的建立提供參考，同時為藥品檢驗機構及生產(chǎn)企業(yè)建立品種2020年版藥典微生物限度檢查法提供借鑒。

1. 儀器和材料

1.1儀器

YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術有限公司）;BSP-150生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;BMJ-400C霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2供試品

阿奇霉素（批號：C08-202101001、C08-202101003、C08-202109001）生產(chǎn)商為黃石世星

1.3菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，以上菌種均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4培養(yǎng)基

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號2001092;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號190827;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號190815;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號190509;沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號2010092;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號201223;麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號2018042。（以上培養(yǎng)基均來源于北京三藥技術有限責任公司。）

2. 實驗方法

2.1菌液的制備

參照2020年版《中國藥典》四部通則1105微生物計數(shù)法項下方法制備。將陽性菌菌液稀釋10-3～10-7倍，使菌落數(shù)不大于100cfu/ml。

2.2 供試液的制備

取阿奇霉素10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，混勻，即得供試液Ⅰ（100mg/ml）;再用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，別配制成供試液Ⅱ（20mg/ml）、供試液Ⅲ（10mg/ml）、供試液Ⅳ（5mg/ml），備用。

2.3 計算公式及接受標準

試驗組比值=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)。

所得比值均應在0.5～2.0范圍內。

2.4微生物總數(shù)計數(shù)方法驗證

2.4.1需氧菌總數(shù)計數(shù)（預試驗）：分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌為試驗菌，分別對供試液進行處理。①分別取供試液Ⅱ和Ⅲ各1ml，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗1000ml，每次100ml。②取供試液Ⅳ1ml，加置100ml 0.1%無菌蛋白胨水溶液中，全量通過一次性薄膜過濾器后，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗400ml，每次100ml，沖洗最后100ml時加入菌懸液。

2.4.2霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)（預試驗）：以黑曲霉菌和白色念珠菌為試驗菌，分別采用2種方法對供試品進行試驗。①取供試液Ⅰ1ml平皿法測定;②取供試液Ⅰ1ml，采用0.1%無菌蛋白胨水溶液500ml薄膜過濾沖洗，沖洗最后100ml時加入菌懸液。結果見表1：

2.5微生物計數(shù)方法適用性

通過預試驗，確認需氧菌總數(shù)計數(shù)使用方法②，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)使用方法①。根據(jù)此結論進行三次平行試驗[5]確認。

2.5.1試驗組：需氧菌總數(shù)取供試液Ⅳ1ml，加置100ml 0.1%無菌蛋白胨水溶液中，全量通過一次性薄膜過濾器后，再用400ml 0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗4次，每次100ml，沖洗最后100ml時加入小于100cfu菌懸液的1ml，沖洗后取出貼膜于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，每株試驗菌平行制備兩個平皿，置30～35℃培養(yǎng)3～5天;霉菌和酵母菌總數(shù)取供試液Ⅰ1ml，置無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃溶化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備兩個平皿。置20～25℃培養(yǎng)5天，逐日觀察結果。

2.5.2供試品對照組：取不加入菌液的供試液，同法測定其微生物數(shù)。

2.5.3菌液對照組：取稀釋液代替供試液，同法操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

結果：5株需氧菌、2株真菌的回收比值均在0.5～2之間，符合藥典規(guī)定，因此可照此方法進行阿奇霉素膠囊的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。見表2。

2.6控制菌檢查方法的驗證

根據(jù)《中國藥典》2020年版要求，控制菌檢查只需檢查大腸埃希菌。

試驗組：取供試液Ⅰ 10mL，用微生物限度檢驗儀立即過濾，再用500ml的0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗5次（100ml/次），在最后一次沖洗液中加入不大于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，過濾后，取出濾膜接種至100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

菌液對照組：取不大于100cfu的大腸埃希菌，接種至100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

陰性對照組：取0.1%無菌蛋白胨水溶液500ml薄膜過濾沖洗后，濾膜接種置100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。均按藥典方法培養(yǎng)。

結果：控制菌選用稀釋10-6倍的大腸埃希菌，三批供試品進行三次平行驗證，結果為試驗組和陽性組均檢出大腸埃希菌生長，而陰性組均未檢出，表明適用性試驗符合藥典標準。

3 討論

通過上述一系列試驗，驗證阿奇霉素對真菌無抑制作用，因此，采用傾注法進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。試藥對細菌生長有強抑制作用，對于抑菌作用較強的供試品，應盡量選用薄膜過濾法進行試驗[6]。阿奇霉素對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌都較敏感，因此本次驗證中需氧菌總數(shù)通過提高稀釋倍數(shù)+薄膜過濾來進行驗證（取1︰200的供試液1mL，每膜沖洗500mL，100mL/次）。經(jīng)過驗證，大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾法（每膜沖洗500mL，100mL/次），可有效消除供試品自身殺菌和抑菌作用，與不加供試液的陽性對照比較，生長正常。

檢查方法中干擾因素較多，易影響計數(shù)結果，如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、加菌濃度及加菌量等[7-8]。采用薄膜過濾法試驗時，先將供試液加至100ml沖洗液中，可使含量均勻，避免藥液中少量沉淀而堵塞濾膜導致過濾困難，更有利于供試液中微生物的回收。

參考文獻：

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[4]國家藥典委員會.中國藥典（四部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版2020.

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[8] WEINBERGER M，LESSER D. Diffuse panbronchiolitis：A progressive fatal lung disease that is curable with azithromycin，butonly if diagnosed[J].Pediatr Pulmonol，2019，54（4）：457-462. DOI：10. 1002/ ppul. 24226.