山丹種子表面滅菌方法比較試驗

鄧 煜，王 蒙，李發(fā)虎，李龍梅，侯 佳

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古薩拉齊 014109）

山丹（Lilium pumilum）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）卷瓣組多年生草本植物。野生山丹種質(zhì)資源在我國非常豐富，分布范圍包括北京、黑龍江、青海、吉林、遼寧、寧夏、內(nèi)蒙古、山東、山西等地[1]。相對于其他百合科花卉，山丹的優(yōu)點較為突出：環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、抗性強(qiáng)、花期早、花期長，可以在我國北方地區(qū)花壇、花境等園林造景中作為主要的填充植物。此外，山丹還可以作為百合屬花卉抗性育種和品質(zhì)改良的重要基因資源[2-4]；還是藥食兩用的植物，含有甾體皂苷、磷脂、硝酸甘油酯、生物堿、多糖等多種活性成分，在臨床有抗癌、抗炎、抗氧化、抗抑郁等作用[5]。隨著山丹潛在市場的不斷挖掘，人們開始認(rèn)識到其產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)模和應(yīng)用潛力，在高效再生體系創(chuàng)建方面開展了大量工作，為其開展規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

已有研究表明，百合屬植物再生能力較強(qiáng)，適合開展組織培養(yǎng)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以提高山丹繁殖效率，還可以改善推廣工作中多代無性繁殖造成的品質(zhì)退化和病毒積累等問題。目前，山丹的離體快繁再生體系已經(jīng)初步建立，并對山丹組培苗的繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及移栽條件進(jìn)行了研究[6-9]。但在實踐操作中，相對于其他百合屬植物，山丹組織培養(yǎng)技術(shù)中存在的問題主要有分化緩慢、生長緩慢和愈傷組織誘導(dǎo)率低等。山丹的結(jié)實率較高，但自然條件下存在種子發(fā)芽率低、發(fā)育不整齊等問題[10]。通過無菌組織培養(yǎng)種子繁殖技術(shù)播種（以下簡稱無菌播種）可以有效解決上述問題，并提高山丹繁殖效率。無菌播種最早在種子繁殖較困難的蘭科植物中廣泛開展[11-12]，近年來百合屬植物中也有報道[13]。無菌播種能在短時間內(nèi)快速獲得大批量的植物材料，是推廣工廠化生產(chǎn)的有效繁殖手段[14-16]。外植體的表面消毒方法決定其污染率和萌發(fā)率及后續(xù)生長狀況，是開展無菌播種的重要技術(shù)瓶頸，但在山丹無菌播種中，這方面尚不多見。本試驗以山丹種子為材料，比較表面滅菌劑種類、消毒時間等因素對山丹無菌播種的影響，旨在為山丹工廠化育苗及育種找出無菌播種最佳表面滅菌方法，從而擴(kuò)大野生山丹種質(zhì)資源利用范圍、加快山丹工廠化育苗進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗于2020年3—5月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)組織培養(yǎng)繁育中心開展。試驗材料是從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園區(qū)種質(zhì)圃內(nèi)采集的3年生山丹種子。先將山丹種子低溫（4 ℃）、黑暗儲存。挑選飽滿、種子內(nèi)胚清晰（胚長為1/2 種長）的種子作為試驗材料（圖1）。

圖1 山丹種子

1.2 試驗方法

1.2.1 預(yù)處理

參照巨球百合[13]種子無菌播種的方法并略做改進(jìn)，首先去除干癟的種子，將種子浸泡于添加1～2 滴洗潔精的水溶液中30 min，流水下連續(xù)沖洗2～4 h。輕輕對種子表面進(jìn)行清洗，吸干種子表面水分。

1.2.2 滅菌處理

在無菌工作環(huán)境下，75%乙醇快速消毒30 s，無菌水沖洗振蕩3 次，分別以0.1%升汞和1.0%NaClO 振蕩處理，滅菌設(shè)置時間為0、5、10、15、20、25、30 min，再用無菌水沖洗振蕩3 次，最后用滅菌濾紙吸干種子表面水分，將種子接種到MS 培養(yǎng)基上。采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，每個處理重復(fù)3 次，每瓶接種5 枚種子，每個重復(fù)接種3 瓶。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。無菌培養(yǎng)室條件為光照強(qiáng)度2 500 lx、光照15 h/d、溫度（25±2）℃。定期觀察發(fā)芽情況及生長發(fā)育情況，發(fā)芽標(biāo)志是以胚根露出種皮1～2 mm為準(zhǔn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計分析

種子接種于培養(yǎng)基后，每天定時觀察、記錄污染情況和種子開始萌發(fā)的時間。每隔3 d 觀察1 次，記錄萌芽情況。培養(yǎng)10 d 后統(tǒng)計各處理無菌苗的污染率，根據(jù)萌發(fā)情況統(tǒng)計萌發(fā)率。接種48 d 時統(tǒng)計誘導(dǎo)率、誘導(dǎo)芽數(shù)，記錄胚芽、胚根數(shù)量，并用螺旋測微尺測量胚芽、胚根長度。之后將山丹幼體繼代培養(yǎng)，每瓶5 粒。數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行整理并制圖，SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對山丹種子污染率的影響

隨著消毒劑處理時間的梯度增加，0.1%升汞和1.0%NaClO 兩種消毒劑處理后種子的污染率呈現(xiàn)明顯降低趨勢（表1）。0 min 和5 min 污染嚴(yán)重，污染率為100%。處理時間10 min，污染率明顯改善，0.1%升汞處理污染率為62.22%，1.0%NaClO 處理污染率為65.19%。處理15 min 后，污染率穩(wěn)定在10%以下。兩種消毒劑均在處理20 min 時，污染率達(dá)到最低。相同處理時間下，0.1%升汞處理污染率均低于1.0%NaClO 處理。

2.2 不同滅菌處理對山丹種子發(fā)芽情況的影響

2.2.1 0.1%升汞處理對山丹種子發(fā)芽情況的影響

經(jīng)0.1%升汞處理后，山丹種子開始萌發(fā)時間為7～15 d，隨著處理時間的延長種子開始萌發(fā)的時間明顯推遲，20、25、30 min 處理下，萌發(fā)時間分別為11.67、13.33、14.67 d（表2），高于10、15 min 的8.00 d。0.1%升汞處理時間越長，山丹種子的完全萌發(fā)時間越長，10、15 min 這兩個處理的完全萌發(fā)時間分別為13.67、15.67 d，優(yōu)于其他幾個處理；而30 min 處理的完全萌發(fā)時間需要22.33 d；而0、5 min 處理時間短，污染率達(dá)100%，未記錄萌發(fā)數(shù)據(jù)。萌發(fā)率結(jié)果與萌發(fā)時間趨勢相同，10、15 min 的萌發(fā)率較高，分別為95.56%和97.78%，顯著高于其他處理（P＜0.05）；隨著0.1%升汞處理時間的延長，萌發(fā)率呈下降趨勢，而處理10、15、20、25 min 誘導(dǎo)率無顯著差異（P＞0.05），但與處理30 min 相比差異顯著（P＜0.05）。經(jīng)0.1%升汞不同處理時間的山丹種子，胚芽數(shù)、胚芽長度、胚根數(shù)和胚根長度隨著處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，15 min 處理山丹種子的生長情況優(yōu)于其他處理（表3）。

表3 0.1%升汞不同滅菌時間對山丹種子生長的影響

2.2.2 1.0%NaClO 處理對山丹種子發(fā)芽情況的影響

由表4 可知，經(jīng)1.0%NaClO 不同處理時間的山丹種子，開始萌發(fā)時間為8～20 d，晚于相同時間0.1%升汞處理。20、25、30 min 處理的萌發(fā)時間分別為9.67、11.67、15.00 d，分別高于10、15 min 處理的8.67、9.33 d。隨著1.0%NaClO 處理時間的延長，完全萌發(fā)時間表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，10、15 min 兩個處理完全萌發(fā)時間最短，均為15.67 d；30 min 處理的完全萌發(fā)時間最長，為23.33 d（0、5 min 由于污染率100%，未記錄數(shù)據(jù)）。萌發(fā)率也表現(xiàn)出與萌發(fā)時間一致的趨勢，0、5 min 因污染率達(dá)100%，污染嚴(yán)重未記錄數(shù)據(jù)；后續(xù)10、15 min 的萌發(fā)率較高，分別為94.81%和95.56%，與其他處理相比存在顯著差異（P＜0.05）；之后隨著1.0%NaClO 處理時間的延長，萌發(fā)率呈明顯下降趨勢。

表4 1.0%NaClO 不同滅菌時間對山丹種子萌發(fā)的影響

由表5 可知，經(jīng)1.0%NaClO 不同處理時間的山丹種子胚芽數(shù)、胚芽長度、胚根數(shù)和胚根長度（0、5 min因污染材料死亡未獲得數(shù)據(jù)；30 min 因死亡或胚芽過短未獲得數(shù)據(jù)），隨著處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，15 min 處理山丹種子生長情況均優(yōu)于其他處理。

表5 1.0%NaClO 不同滅菌時間對山丹種子生長的影響

3 討論與結(jié)論

山丹作為百合科重要的鄉(xiāng)土花卉資源，具有良好的生態(tài)適應(yīng)性，觀賞性狀突出、特性明顯，同時還具有豐富的藥用和營養(yǎng)價值，市場認(rèn)可度逐年上升。但是隨著其生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，也與其他百合資源生產(chǎn)一樣需要通過工廠化育苗提高生產(chǎn)效率和降低病害發(fā)生率。山丹種球小、鱗莖片數(shù)少，開展無性繁殖效率低下。山丹種子發(fā)芽雖然繁殖率和發(fā)芽率高，但存在發(fā)芽率受環(huán)境影響大、發(fā)芽持續(xù)時間長（達(dá)40 d）、生長情況參差不齊、不符合規(guī)?；a(chǎn)要求等問題。通過建立高效再生體系，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，還存在分化緩慢、增殖率低等技術(shù)瓶頸，不利于這項技術(shù)的快速推廣。綜合上述方法的優(yōu)缺點，采用無菌播種進(jìn)行快速繁殖，其發(fā)芽率高、發(fā)芽持續(xù)時間短，生長均勻，可以作為開展山丹工廠化生產(chǎn)的有效切入點。污染是無菌播種過程中的重要問題，也是決定無菌播種成敗的關(guān)鍵。山丹種子常攜帶大量微生物且難以清除，故無菌播種中種子的生理狀態(tài)、滅菌劑種類、滅菌時間及滅菌方法等都是需要解決的問題[13-14]。

本試驗結(jié)果表明，0.1%升汞處理下，山丹的發(fā)芽情況和生長情況優(yōu)于1.0%NaClO 處理。隨著處理時間的延長，種子萌發(fā)和生長情況呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，0.1%升汞和1.0%NaClO 處理，0、5 min 處理雖然萌發(fā)較快，但污染率高達(dá)100%；兩種消毒劑10、15、20、25 min 處理均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，15 min 滅菌處理下山丹的萌發(fā)情況和生長情況均優(yōu)于其他處理。

外植體消毒是外植體培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，消毒試劑的選擇和消毒時間的確定是核心。不同種類的消毒劑在消殺細(xì)菌的同時會破壞植物細(xì)胞，細(xì)胞通過產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)啟動自我保護(hù)[17]。消毒時間太短，外植體消毒不徹底，污染嚴(yán)重，本試驗中兩種消毒劑0、5 min 處理下，污染率均高達(dá)100%。若消毒時間過長，細(xì)胞會被毒害，導(dǎo)致外植體褐變甚至死亡，本試驗中兩種消毒劑30 min 處理下，萌發(fā)率最低，且后期生長情況很差。因此，通過本試驗可以初步確定適合山丹種子無菌播種發(fā)芽及生長情況的消毒劑和消毒時間。

綜上所述，山丹種子無菌播種較傳統(tǒng)繁殖方法效率高、出芽整齊，便于規(guī)模化推廣。結(jié)合山丹種子消毒方法，可在溫度（25±2）℃、光照（光照度為2 500 lx）、培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L）等培養(yǎng)條件一致的情況下，采用75%乙醇消毒30 s配合0.1%升汞連續(xù)處理15 min，山丹種子能夠取得較高的萌發(fā)率和較好的幼苗生長質(zhì)量。