韭菜灰霉病防治煙劑的篩選與評價

高皓杰, 張?zhí)m云, 李桐桐, 趙時峰,李北興, 慕 衛(wèi), 劉 峰*,

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；2. 臨淄區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，山東 淄博 255400；3. 莘縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 聊城 252400)

韭菜灰霉病是我國保護(hù)地韭菜上常見的真菌病害，主要由蔥鱗葡萄孢菌Botrytis squamosa侵染引起，是典型的氣傳性病害，易在低溫、高濕的情況下發(fā)生和流行[1]，根據(jù)發(fā)病癥狀的不同可分為斑點型、干尖型和濕腐型[2]。葉片作為韭菜的主要食用部分，受灰霉病損害嚴(yán)重，一般可導(dǎo)致減產(chǎn)20 %～30 %，嚴(yán)重時甚至整棚絕產(chǎn)[3]，且在采后運輸和貯藏期間亦可為害，嚴(yán)重影響著韭菜的產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。

目前，施用化學(xué)藥劑依然是防治韭菜灰霉病最有效的手段，但由于韭菜多種植在低矮的拱棚內(nèi)，噴霧施藥不便操作，所以通常使用煙劑來防治韭菜灰霉病。煙劑受熱氣化后冷凝成煙霧顆粒，可隨空氣彌漫分散，在棚室的各個方向和位置沉積，基本不需要借助于機(jī)械[4]。煙霧劑顆粒細(xì)小，在作物上的沉積密度高[5]。與噴霧施藥相比，施用煙劑不僅省力，而且不會增加保護(hù)地內(nèi)的濕度，更有利于防病。目前登記用于韭菜灰霉病的煙劑只有腐霉利，隨著使用年限的延長，灰霉病菌對腐霉利的敏感性已有不同程度下降[6]，而增加使用頻次和劑量又進(jìn)一步導(dǎo)致了更嚴(yán)重的抗性問題[7]，并且由于韭菜收獲期很短，很難嚴(yán)格執(zhí)行農(nóng)藥安全間隔期的規(guī)定，因而導(dǎo)致腐霉利殘留超標(biāo)現(xiàn)象普遍[8]。美國環(huán)境保護(hù)署 (EPA) 認(rèn)為，腐霉利會對人體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響[9]。因此，生產(chǎn)上亟待尋找可作為煙劑使用以防治韭菜灰霉病的安全、高效的替代殺菌劑品種。

目前已報道可防治其他蔬菜灰霉病的殺菌劑有咯菌腈、嘧霉胺、乙霉威、異菌脲、啶菌噁唑、氟啶胺、啶酰菌胺、吡唑萘菌胺和氟吡菌酰胺等[10-14]，田間施藥方式均為噴霧施藥。有關(guān)這些藥劑對韭菜灰霉病菌的抑制活性尚未見報道，能否將其加工成煙劑用于防治韭菜灰霉病亦不明確。因此，本研究對室內(nèi)抑制韭菜灰霉病菌的高活性殺菌劑品種進(jìn)行了篩選，并評價了其作為煙劑防治韭菜灰霉病的可行性和安全性，旨在為豐富韭菜灰霉病的防治藥劑品種以及田間科學(xué)用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 于2019 年在山東省泰安市良莊鎮(zhèn)韭菜產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集具有灰霉病發(fā)病特征的韭菜葉片，在室內(nèi)采用單孢分離方法進(jìn)行分離純化，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為蔥鱗葡萄孢菌Botrytis squamosa[15]。所有菌株于4 ℃下保存，備用。

1.1.2 藥劑及試劑 98.5 %腐霉利 (pyocymidone)

原藥，四川省宜賓川安高科農(nóng)藥有限責(zé)任公司；98 % 嘧霉胺 (pyrimethanil) 原藥，95% 咯菌腈(fludioxonil) 原藥，98%氟啶胺 (fluazinam) 原藥，96%異菌脲 (iprodione) 原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；96%啶菌噁唑 (pyrisoxazole) 原藥，沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；96% 乙霉威(diethofencarb) 原藥，山東億嘉農(nóng)化有限公司；以上藥劑均用丙酮溶解、稀釋，配成1.0 × 104mg/L的母液，于4 ℃黑暗環(huán)境下保存，備用。96%氟吡菌酰胺 (fluopyram) 原藥，拜耳股份有限公司 (北京) ；96%啶酰菌胺 (boscalid) 原藥，山東省濰坊潤豐化工有限公司；92% 吡唑萘菌胺(isopyrazam)原藥，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；以上藥劑均用甲醇溶解、稀釋，配成1.0 ×104mg/L 的母液，于4 ℃黑暗環(huán)境下保存，備用。50%咯菌腈 (fludioxonil) 可濕性粉劑 (WP) ，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；50% 啶酰菌胺(boscalid) 水分散粒劑 (WG) ，巴斯夫歐洲公司；10%腐霉利 (pyocymidone) 煙劑 (FU) ，河南省安陽市五星農(nóng)藥廠。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA，用于咯菌腈、腐霉利、啶菌噁唑、氟啶胺、乙霉威、異菌脲、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和吡唑萘菌胺的菌絲生長抑制試驗) ：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL；水-瓊脂培養(yǎng)基 (WA，用于咯菌腈、腐霉利、嘧霉胺、啶菌噁唑、氟啶胺、乙霉威、異菌脲的孢子萌發(fā)抑制試驗) ：瓊脂10 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL；酵母膏蛋白胨醋酸鹽培養(yǎng)基 (YBA，用于啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和吡唑萘菌胺的孢子萌發(fā)抑制試驗) ：酵母膏10 g，細(xì)菌蛋白胨10 g，乙酸鈉20 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL；天冬酰胺合成培養(yǎng)基 (L-Asn，用于嘧霉胺的菌絲生長抑制試驗) ：K2HPO41 g，KCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，L-Asn 2 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。各培養(yǎng)基中均加入50 mg/L 的鏈霉素以避免細(xì)菌污染。

1.1.4 主要儀器 HD-920 新型潔凈工作臺 (哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司北京分公司) ；萬分之一分析天平 (北京塞多利亞科學(xué)儀器有限公司) ；SPX 型智能生化培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠) ；Olympus IX-71 光學(xué)電子顯微鏡 (日本奧林巴斯公司) ；Agilent 1200 高效液相色譜儀(HPLC，安捷倫科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 韭菜灰霉病菌對供試殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[16]測定9 種殺菌劑對3 株韭菜灰霉病菌菌絲生長的影響，以腐霉利為對照藥劑。將滅過菌的培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，將培養(yǎng)基和供試藥劑以體積比9 : 1 的比例稀釋成梯度濃度，混合均勻后倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，制得系列有效試驗濃度的含藥培養(yǎng)基平板。其中，吡唑萘菌胺、氟吡菌酰胺、啶酰菌胺、嘧霉胺、異菌脲、乙霉威和腐霉利的最終系列質(zhì)量濃度均為0、3.125、6.25、12.5、25 和50 mg/L，啶菌噁唑、氟啶胺和咯菌腈的最終系列質(zhì)量濃度均為0、0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 mg/L。以含有相同體積無菌去離子水的培養(yǎng)基作為對照平板。

灰霉病菌菌落在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，用直徑為5 mm 的打孔器沿邊緣打取菌餅，菌絲面向下分別接種于冷卻的各平板中央，每處理重復(fù)3 次。用封口膜密封，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，并按公式 (1) 計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率 (Id) 。

式中：Dc為對照組菌落直徑，mm；Dt為處理組菌落直徑，mm。

采用孢子萌發(fā)法[16]測定10 種殺菌劑對3 株韭菜灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響，同樣以腐霉利為對照藥劑。含藥培養(yǎng)基平板的制備同菌絲生長抑制作用測定。吡唑萘菌胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺的最終系列質(zhì)量濃度均為0、0.125、0.25、0.5、1 和2 mg/L，乙霉威、嘧霉胺、異菌脲、啶菌噁唑、氟啶胺、咯菌腈和腐霉利的最終系列質(zhì)量濃度均為0、3.125、6.25、12.5、25、50 和100 mg/L。以含有相同體積無菌去離子水的培養(yǎng)基為對照平板。在WA 培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %、粉碎后的韭菜葉，接入菌餅，在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d 后，加入適量無菌水刮洗菌絲，所得懸浮液經(jīng)3 層滅菌紗布過濾，得到孢子懸浮液。在顯微鏡下通過血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將孢子懸浮液終濃度調(diào)至每mL 含1 × 105個孢子。取100 μL 孢子懸浮液均勻涂布至冷卻的各平板上，20 ℃黑暗培養(yǎng)10 h 后觀察分生孢子萌發(fā)情況 (芽管長度超過孢子長度的一半時視為萌發(fā))。每個平板觀察20～100 個分生孢子，統(tǒng)計孢子總數(shù)及萌發(fā)孢子數(shù)，根據(jù)公式 (2) 計算各藥劑處理對孢子萌發(fā)的抑制率 (Ig) 。

式中：Rc為對照組孢子萌發(fā)率，%；Rt為處理組孢子萌發(fā)率，%。

1.2.2 煙霧的室內(nèi)毒力測定 取直徑為5 mm 的灰霉病菌菌餅，菌絲面向下接種于冷卻的空白PDA 培養(yǎng)基平板，將100 μL 孢子懸浮液均勻涂布于空白WA 培養(yǎng)基平板上，開蓋放入如圖1 所示的試材放置區(qū)內(nèi)。稱取0.01 g 有效成分的原藥置于載藥罐中，用酒精燈在錫箔紙下方對藥劑加熱，藥劑受熱后產(chǎn)生的煙霧在密閉空間里彌漫并最終沉積在菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制試驗平板上。以未經(jīng)煙霧處理的菌絲和孢子平板為對照。6 h后取出平板并用封口膜密封，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。孢子萌發(fā)抑制試驗平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h 后取出，于顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況，每個平板觀察20～100 個分生孢子，記錄孢子總數(shù)及萌發(fā)孢子數(shù)，并根據(jù)公式 (2) 計算各處理的孢子萌發(fā)抑制率；菌絲生長抑制試驗平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后取出，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，按公式 (1) 計算菌絲生長抑制率。

圖1 煙霧毒力值測定裝置Fig. 1 Apparatus for smoke toxicity test

1.2.3 成煙率測定 參考HG/T 2467.18—2003《農(nóng)藥煙粉粒劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范》[17]中的有效成分成煙率測定方法并稍作改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取篩選出的殺菌劑原藥0.01 g，放入圖2 所示的裝置中，分別吸取100 mL 乙腈注入各吸收瓶內(nèi)；連接好裝置后打開真空抽氣泵，使系統(tǒng)形成負(fù)壓，點燃酒精燈加熱使藥劑產(chǎn)生煙，待產(chǎn)煙完畢后停止抽氣。將3 個吸收瓶中的吸收液合并，轉(zhuǎn)移到500 mL 容量瓶中，再用乙腈將整個系統(tǒng)沖洗3 次，沖洗液并入500 mL 容量瓶中并定容；取1 mL 吸收液過凈化柱后用乙腈定容于5 mL 容量瓶中。采用高效液相色譜儀檢測吸收液中原藥有效成分的含量，并按公式 (3) 計算各殺菌劑原藥的成煙率 (RS) 。

圖2 成煙率測定裝置Fig. 2 Apparatus for smoking rate test

式中：m1為標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；γ1為標(biāo)樣溶液中有效成分與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的平均值；γ2為試樣溶液中有效成分與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的平均值； ω2為試樣中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； ω1為原藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.2.4 室內(nèi)安全性測定 參考NY/T 1965.1—2010《農(nóng)藥對作物安全性評價準(zhǔn)則》[18]并稍作改進(jìn)。采用圖1 所示裝置，將韭菜盆栽置于試材放置區(qū)，根據(jù)1.2.3 節(jié)的測定結(jié)果，按照成煙率大于80%的標(biāo)準(zhǔn)[19-20]從中選擇出咯菌腈和啶酰菌胺兩種原藥，根據(jù)10 mg 咯菌腈和啶酰菌胺煙霧對韭菜灰霉病菌菌絲生長的抑制率達(dá)到90%以上，分別設(shè)置1、2、4 倍劑量，即咯菌腈和啶酰菌胺原藥分別按有效成分10、20、40 mg，對韭菜植株進(jìn)行煙霧施藥處理，6 h 后取出。以未經(jīng)煙霧處理的韭菜盆栽為對照。于施藥前和施藥后7 d 分別測量對照組與處理組韭菜植株的株高和莖粗。每盆種植5 株韭菜，每處理重復(fù)3 次。

1.2.5 田間藥效試驗 參考GB/T 17980.28—2000《田間藥效試驗準(zhǔn)則》[21]，于2019 年12 月在山東省泰安市良莊鎮(zhèn)的韭菜大棚內(nèi)進(jìn)行，該地塊韭菜灰霉病常年自然發(fā)生，種植的韭菜品種均為獨根紅。參考已有的煙劑配方[22]，將咯菌腈和啶酰菌胺加工成煙劑，試驗用量分別為有效成分60、120 g/hm2和225、375 g/hm2，以有效成分450 g/hm2的商品化10% 腐霉利煙劑為對照藥劑。每處理設(shè)3 次重復(fù)，采用完全隨機(jī)區(qū)組排列，共18 個小區(qū)，每小區(qū)面積27 m2(3 m × 9 m) 。每小區(qū)設(shè)置一個施藥點，按照與施藥點距離由近到遠(yuǎn)將小區(qū)劃分為6 個小組。于韭菜灰霉病發(fā)生初期施藥，施藥前調(diào)查病情指數(shù)，每小組五點取樣，每點調(diào)查5 棵韭菜，用紅繩在韭菜莖部進(jìn)行標(biāo)記。于施藥后7 d 再次調(diào)查病情指數(shù)，根據(jù)單個葉片上病斑的個數(shù)進(jìn)行分級[21]：0 級，無病斑；1 級，單葉片有病斑3 個；3 級，單葉片有病斑4～6 個；5 級，單葉片有病斑7～10 個；7 級，單葉片有病斑11～20 個，部分密集成片；9 級，單葉片有密集病斑，病斑面積占葉片1/4 以上。

于2020 年12 月在同一韭菜田再次進(jìn)行試驗。對生長期為15 d 并零星出現(xiàn)灰霉病病斑的韭菜田 (治療作用測定) 和收割后7 d 的韭菜田 (保護(hù)作用測定) 分別進(jìn)行煙劑和噴霧處理，煙劑處理劑量同2019 年田間試驗，噴霧對照處理選用商品制劑50%咯菌腈WP 和50%啶酰菌胺WG，施藥劑量分別為有效成分60、120 g/hm2和225、375 g/hm2。治療作用試驗韭菜田分別在施藥前和施藥后7 d 調(diào)查病情指數(shù)，保護(hù)作用試驗韭菜田于施藥后21 d 調(diào)查病情指數(shù)。根據(jù)公式 (4) 計算病情指數(shù) (Di) ，分別按公式 (5) 和 (6) 計算治療作用防效(Ec) 和保護(hù)作用防效 (Ep) 。

式中：a為病級數(shù)；Na為a病級葉片數(shù)；n為葉片總數(shù)；Dica為對照組藥前病情指數(shù)；Ditb為處理組藥后病情指數(shù)；Dicb為對照組藥后病情指數(shù)；Dita為處理組藥前病情指數(shù)。

1.2.6 殘留消解動態(tài)試驗 分別于施藥后1、3、5、7、10、17、21 d 采集韭菜植株樣品，每小組五點取樣，每組采集不少于200 g 樣品。將采集的韭菜植株樣品切碎后勻漿，存放于 -20 ℃冰箱。參照張園園等[21]的方法進(jìn)行測定，并略做作改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取10.0 g (精確至 0.01 g) 充分勻漿后的韭菜樣品于50.0 mL 離心管中，加入20.0 mL 乙腈，渦旋振蕩3 min，再加入1.0 g 氯化鈉和4.0 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩提取3 min，于4 000 r/min 離心2 min；取上清液1.5 mL 轉(zhuǎn)入2 mL QuEChERS離心管中 (含50.0 mg PSA、5 mg 多壁碳納米管和150 mg 無水硫酸鎂) ，渦旋振蕩3 min，于12 000 r/min 離心2 min；取上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，采用GC-MS/MS 分析。儀器條件：載氣為He 氣；進(jìn)樣口溫度280 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；EI 離子源，溫度300 ℃；傳輸線溫度150 ℃；流速1 mL/min；升溫程序：90 ℃ (15 ℃/min) →220 ℃ (30 ℃/min) →280 ℃ (保持8 min) 。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS V7.05 統(tǒng)計軟件計算毒力回歸方程和EC50值，運用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。統(tǒng)計分析前對田間試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜灰霉病菌對供試藥劑的敏感性

結(jié)果 (表1) 表明：咯菌腈、啶菌噁唑、氟啶胺對韭菜灰霉病菌菌絲生長的抑制活性較好，EC50值低于0.15 mg/L，且顯著高于對孢子萌發(fā)的抑制活性，EC50值相差100 倍以上；啶酰菌胺、吡唑萘菌胺和氟吡菌酰胺對孢子萌發(fā)的抑制活性略高于對菌絲生長的抑制活性；而嘧霉胺、異菌脲、乙霉威對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制活性均較低，EC50值分別大于10 mg/L 和20 mg/L；對照藥劑腐霉利對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制活性最低，其抑制孢子萌發(fā)的EC50值大于60 mg/L。

表1 10 種常用殺菌劑對韭菜灰霉病菌的EC50 值Table 1 EC50 values of 10 common fungicides against B. squamosa

2.2 殺菌劑成煙施藥對韭菜灰霉病菌的室內(nèi)毒力

在0.108 m3的密閉裝置內(nèi)，相同有效成分劑量 (0.01g) 的6 種殺菌劑受熱成煙后，煙霧對韭菜灰霉病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，其中咯菌腈煙霧可完全抑制菌絲生長，吡唑萘菌胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺煙霧可完全抑制孢子萌發(fā)，而對照藥劑腐霉利對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率僅為54.3 %和43.3 % (圖3) 。

圖3 殺菌劑煙霧對韭菜灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率Fig. 3 Inhibition rate of fungicide smokes against the mycelial growth and conidial germination of B. squamosa

2.3 成煙率

成煙率是煙劑的重要指標(biāo)之一。研究結(jié)果(圖4) 表明：咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺的成煙率均在80 % 以上，能夠達(dá)到煙劑成煙率的要求[19-20]，而吡唑萘菌胺、啶菌噁唑和氟啶胺的成煙率僅分別為59.39 %、17.82 %和35.82 %，不適合加工成煙劑使用。

圖4 供試6 種殺菌劑的成煙率Fig. 4 Smoking rates of 6 fungicides

2.4 室內(nèi)安全性

兩種煙劑對韭菜生長性狀的影響見表2。經(jīng)咯菌腈和啶酰菌胺煙霧處理7 d 后，與空白對照組相比，韭菜葉片無脫落、畸形、焦枯、穿孔、褪色、黃化等藥害癥狀，株高和莖粗的增加量無明顯差異，表明兩種殺菌劑煙霧對韭菜植株的生長無不良影響。

表2 不同劑量咯菌腈和啶酰菌胺煙霧施藥對韭菜植株生長的影響Table 2 Effects of applying smokes of different doses of fludioxonil and boscalid on the growth of Chinese chives

2.5 煙劑對韭菜灰霉病的田間防效

2019 年的田間試驗結(jié)果 (圖5) 表明：以煙劑方式施藥，啶酰菌胺和咯菌腈對韭菜灰霉病均有較好的防治效果，明顯優(yōu)于對照商品化腐霉利煙劑，且防效均隨著施藥劑量的升高而升高?？┚鏌焺┰谟行С煞?20 g/hm2劑量下的防效為73.14 %，啶酰菌胺煙劑在有效成分375 g/hm2劑量下的防效為81.17 %，均優(yōu)于對照藥劑腐霉利煙劑在最高登記劑量 (有效成分450 g/hm2) 下的防效(59.61 %)。

圖5 咯菌腈、啶酰菌胺和腐霉利煙劑對韭菜灰霉病的田間防治效果Fig. 5 Field control efficacy of fludioxonil, boscalid and procymidone smoke generators against gray mold of Chinese chives

2020 年兩種施藥方式下，3 種煙劑對韭菜灰霉病的田間保護(hù)作用防效和治療作用防效結(jié)果見表3。保護(hù)性施藥方式試驗中，3 種煙劑對韭菜灰霉病的防效均在80 %以上，部分處理在90 %以上；啶酰菌胺噴霧處理的防效高于煙劑處理。在治療作用方式試驗中，啶酰菌胺和咯菌腈煙劑對韭菜灰霉病的防效高于噴霧處理和對照商品化腐霉利煙劑處理。

表3 兩種施藥方式下各殺菌劑對韭菜灰霉病的田間保護(hù)作用和治療作用防治效果Table 3 Protective and curative effects of fungicides applied in two methods on gray mold of Chinese chives in the field

2.6 藥劑殘留消解動態(tài)及擴(kuò)散距離

供試煙劑在韭菜上的殘留消解動態(tài)及距施藥點不同距離的分布情況見圖6，3 種煙劑在韭菜植株上的殘留消解規(guī)律均符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，在距施藥點1.5～9.0 m 范圍內(nèi)，不同距離的沉積分布無明顯差異。參考GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[23]，咯菌腈在洋蔥、黃瓜、西葫蘆等蔬菜上的最大殘留限量 (MRL) 為0.5 mg/kg，在茄子、食莢豌豆、蘿卜等蔬菜上的MRL 值為0.3 mg/kg；啶酰菌胺在已登記蔬菜上的MRL 值均高于1 mg/kg；腐霉利在韭菜上的MRL 值是0.2 mg/kg。本研究中，咯菌腈、啶酰菌胺和腐霉利煙劑施藥后21 d (臨近韭菜的常規(guī)采收時間) 在韭菜植株上的殘留量均較低，低于0.15 mg/kg；距最后一次施藥14 d 后，咯菌腈有效成分60 和120 g/hm2處理組在韭菜中的最終殘留量分別為0.09 和0.3 mg/kg，啶酰菌胺有效成分225 和375 g/hm2處理組在韭菜中的最終殘留量分別為0.014 和0.12 mg/kg，而腐霉利有效成分450 g/hm2處理組在韭菜中的殘留量為0.09 mg/kg，低于0.2 mg/kg。研究表明，在試驗施藥條件下，3 種煙劑在韭菜中的殘留風(fēng)險相對較低。

圖6 咯菌腈、啶酰菌胺和腐霉利煙劑在距施藥點不同距離韭菜上的沉積分布 (A～E) 與殘留消解動態(tài)(Ⅰ～Ⅲ)Fig. 6 Distribution (A-E) and degradation dynamics curve (Ⅰ-Ⅲ) of fludioxonil, boscalid and procymidone smoke generators on Chinese chives at different distances from the application site

3 討論與結(jié)論

本研究評價了9 種殺菌劑開發(fā)為韭菜灰霉病防治煙劑的可能性。其中，氟啶胺和啶菌噁唑?qū)虏嘶颐共【氖覂?nèi)抑制活性較高，但其煙霧對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制效果差，根據(jù)其低于40 %的成煙率結(jié)果，推測可能是由于這兩種殺菌劑的成煙溫度與熱分解溫度相近，原藥在成煙過程中發(fā)生了熱分解，且分解產(chǎn)物對灰霉病菌無抑制作用所致；盡管吡唑萘菌胺及其煙霧對韭菜灰霉病菌的抑制活性均較高，但其成煙率僅為59.39 %，加工成煙劑會造成浪費；而咯菌腈煙霧對韭菜灰霉病菌菌絲生長、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺煙霧對其孢子萌發(fā)具有較高的抑制作用，且3 種殺菌劑成煙率均達(dá)到80 %以上，滿足煙劑制備要求[19-20]，因此適合加工成煙劑使用，但由于氟吡菌酰胺專利尚未到期，因此咯菌腈和啶酰菌胺是當(dāng)前較適合制備成韭菜灰霉病防治用煙劑的候選品種。

藥效和安全性是煙劑開發(fā)和應(yīng)用的基礎(chǔ)。本研究表明，咯菌腈和啶酰菌胺煙劑對韭菜植株生長無明顯影響，相對較低劑量下對韭菜灰霉病的田間防效明顯高于最高登記劑量下的腐霉利商品煙劑，同時田間用量低也極大地降低了藥害發(fā)生的風(fēng)險。雖然噴霧施藥方式對韭菜灰霉病也具有較高的防治效果，但在低矮拱棚中操作極其困難，而且噴霧施藥會導(dǎo)致棚室內(nèi)相對濕度的增加，為病原菌增殖提供條件，所以冬季韭菜棚內(nèi)使用煙劑施藥效果優(yōu)于噴霧施藥。此外，韭菜葉片一旦出現(xiàn)灰霉病斑即失去了商品價值，所以韭菜灰霉病的防治重點應(yīng)是預(yù)防為主。上茬韭菜收割后，病原菌的數(shù)量相對較少且多數(shù)寄生在土表或病殘體中，此時使用煙劑處理可對整個棚室起到全面消毒的作用，能夠顯著抑制病原菌的增殖和侵染?？┚婧袜＞番F(xiàn)階段已廣泛用于草莓、黃瓜、番茄和葡萄等作物上防治灰霉病，且對炭疽病、靶斑病等也具有一定防效[24-26]，因此其加工成煙劑后在我國保護(hù)地作物病害防治方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。

農(nóng)藥殘留是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中比較敏感且備受關(guān)注的話題。目前我國韭菜中農(nóng)藥殘留抽檢合格率偏低，如2018 年抽檢不合格的主要原因是腐霉利殘留超標(biāo)[27]。本研究試制的咯菌腈和啶酰菌胺煙劑在韭菜上的半衰期為3～4 d，而每茬韭菜的生長期一般為23～30 d[28]，參考相關(guān)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[23]，這兩種藥劑在韭菜灰霉病防治上的使用時間相對較為靈活。咯菌腈和啶酰菌胺在韭菜上的半衰期比已報道的其在辣椒、草莓[29]等其他作物噴霧處理場景下獲得的半衰期短。在田間保護(hù)作用試驗中，于上茬韭菜收割后7 d 使用咯菌腈和啶酰菌胺煙劑處理，施藥21 d 后收割的下茬韭菜中藥劑的殘留量極低，安全性較高。其原因在于收割7 d 后施藥，下茬韭菜的生長高度僅為地面以上約5～7 cm，新長出的韭菜植株上幾乎無殘留，這與農(nóng)藥難以在韭菜體內(nèi)傳導(dǎo)以及其在植株內(nèi)的快速消解有關(guān)，同時也與生物量稀釋有很大關(guān)系。

設(shè)施栽培環(huán)境的特征是高溫、高濕、風(fēng)速低、溫度變化小，相對濕度很少低于60%，這為病蟲害的繁衍提供了有利條件。與噴霧施藥相比，使用煙劑不僅省力，而且不會增加棚室內(nèi)的濕度，可降低病害發(fā)生概率，符合我國保護(hù)地小規(guī)模種植模式的需要，但目前存在國內(nèi)已登記的煙劑品種單一和老化的問題。截至2021 年8 月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)登記的煙劑產(chǎn)品共138 個，以殺菌煙劑為主，占煙劑登記產(chǎn)品的63.8 %。殺菌煙劑中單劑占94.4 %，混劑占5.6 %，涉及的有效成分共計11 個，以腐霉利和百菌清為主，占?xì)⒕鸁焺┊a(chǎn)品的88.9 %，主要用于防治黃瓜和番茄灰霉病。長期使用單一藥劑易導(dǎo)致有害生物敏感性下降，抗藥性問題不容忽視，因此應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大適合開發(fā)為煙劑的藥劑種類篩選范圍，擴(kuò)充現(xiàn)有煙劑品種，便于生產(chǎn)中交替和輪換使用，延緩抗藥性的產(chǎn)生。此外，田間病蟲害發(fā)生情況復(fù)雜，多種病蟲害往往同時發(fā)生，因此還應(yīng)重視混合型煙劑的研究開發(fā)，擴(kuò)大作用譜，實現(xiàn)多病、多蟲同治或病蟲兼治，減少施藥次數(shù)，降低用藥成本和提高安全性。