兩種海洋真菌混合發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物及殺蟲(chóng)活性研究

曹 云, 侯宗敏, 董存柱, 曹鳳勤, 陶 敏,余森泉, 夏玉蓮, 伍顯鋒

(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228)

海洋真菌在特殊的生存環(huán)境下生命力強(qiáng)，不僅具有特殊的代謝途徑和防御體制，還能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、功能豐富的次生代謝物，已成為研發(fā)新型藥物先導(dǎo)化合物的熱點(diǎn)[1]。截至目前，從海洋真菌的次生代謝產(chǎn)物中已分離鑒定出大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物，部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌或抗病毒等藥理學(xué)活性[2-3]。黃瑞環(huán)從哈茨木霉Trichoderma hrzianum的次生代謝產(chǎn)物中分離得到兩個(gè)Nafuredin 類化合物，發(fā)現(xiàn)其對(duì)稻瘟病菌均具有抑制作用[4]。Gao 等從短柄青霉菌Penicillium brefeldianum次生代謝物中分離出3 種新化合物，發(fā)現(xiàn)部分化合物對(duì)人類腫瘤細(xì)胞HepG2 和 MDA-MB-231 表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[5]。

微生物混合發(fā)酵由來(lái)已久，已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)微生物工業(yè)和食品工業(yè)。Cueto 等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海洋真菌Pestalotiasp. CNL-365 與一株對(duì)抗生素有抗性的海洋細(xì)菌CNJ-328 進(jìn)行混合發(fā)酵時(shí)，可以產(chǎn)生一個(gè)新的抗生素pestalone，而單獨(dú)發(fā)酵則不產(chǎn)生該化合物[6]。因此，將微生物混合發(fā)酵技術(shù)運(yùn)用于海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，有望挖掘出大量結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物[7-8]。

基于此，本研究將來(lái)源于海南東寨港紅樹(shù)林海泥中的哈茨木霉T. harzianumABC19819 和短柄青霉菌P. brefeldianumABC190807 進(jìn)行混合發(fā)酵，對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的分離鑒定，從中分離得到6 個(gè)化合物，采用波譜分析技術(shù)并通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比，對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并以埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲(chóng)試蟲(chóng)測(cè)定了6 個(gè)化合物的殺蟲(chóng)活性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器與試劑 Bruker DRX-600 型核磁共振波譜儀 (T M S 為內(nèi)標(biāo)，德國(guó)B r u k e r 公司)；Finnigan LCQ Advantage MAX 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)熱電公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋YM75(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；冷卻水循環(huán)裝置CA-1111 和水流抽氣機(jī)A1000S (日本EYELA公司)；凝膠Sephadex LH-20 (美國(guó)GE 公司)；硅膠薄層色譜板GF254 和柱色譜用硅膠60～80 目(篩孔徑180～250 μm)，200～300 目 (篩孔徑48～75 μm) (青島海洋化工集團(tuán)公司)，柱色譜試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，瓊脂粉、葡萄糖、75% 乙醇、99.5%二甲基亞砜(西隴科學(xué)股份有限公司)；魚(yú)藤酮 (rotenone，純度為95%，Aladdin 試劑公司)；99.8%氘代試劑 (北京伊諾凱科技有限公司)。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 菌株Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807分離于海南東寨港紅樹(shù)林海泥，菌種由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院天然源農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定并保存。埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲(chóng)由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院化保實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 菌種純化 無(wú)菌操作下，將適量樣品置于含有50 mL 無(wú)菌海水的100 mL 三角瓶中，攪拌均勻，靜置。吸取1 mL 上清液于含有9 mL 無(wú)菌海水的20 mL 試管中，按照濃度梯度稀釋法配制成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的溶液[9]。取150 μL各濃度溶液加入PDA 培養(yǎng)基 (3 個(gè)重復(fù)) ，以涂布器涂布均勻，將培養(yǎng)皿封口，倒置培養(yǎng)。觀察菌種生長(zhǎng)情況，用接種針挑取出新長(zhǎng)出的菌絲接種到空白PDA 培養(yǎng)基上，待新培養(yǎng)基上的真菌長(zhǎng)出菌絲后，重復(fù)操作，直到得到純化真菌，并進(jìn)行菌種保藏備用。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng) 海水PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，以海水定容至1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：1 000 mL 發(fā)酵瓶，大米80 g，天然海水100 mL。

將保藏的菌種活化備用。配制10 瓶PDB 液體培養(yǎng)基和135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后待用。將純化的2 株真菌各自接入5 瓶PDB 培養(yǎng)基中，于26 ℃、180 r/min 的條件下培養(yǎng)3 d，作為真菌種子液。分別接種3 mL 真菌種子液到135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26 ℃靜置混合發(fā)酵培養(yǎng)45 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離 發(fā)酵45 d 后，向每個(gè)發(fā)酵瓶中加入600 mL 乙酸乙酯，搗碎攪拌后靜置3 d，期間振蕩若干次。抽濾，濃縮得到發(fā)酵液浸膏；回收乙酸乙酯后再次加入提取，如此反復(fù)3 次。合并浸膏，共得到浸膏394.14 g，置入4 ℃冰箱內(nèi)備用。以60～80 目硅膠拌樣 (硅膠與樣品質(zhì)量比為1 : 1)，200～300 目硅膠裝柱分離樣品。先用薄層層析 (TLC) 法確定分離系統(tǒng)：以石油醚-乙酸乙酯 (體積比分別為100 : 0, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15,80 : 20, 75 : 25, 70 : 30, 65 : 35, 60 : 40, 55 : 45, 50 :50, 45 : 55, 40 : 60, 35 : 65, 20 : 80, 0 : 100) 進(jìn)行梯度洗脫，再用乙酸乙酯-甲醇 (體積比90 : 10, 65 :35, 30 : 70, 0 : 100) 洗脫。經(jīng)檢驗(yàn)，合并得到18 個(gè)部分 (Fr.1～18)。Fr. 1，1.76 g；Fr. 2，1.37 g；Fr. 3，1.59 g；Fr. 4，9.51 g；Fr. 5，2.07 g；Fr. 6，2.15 g；Fr. 7，3.64 g；Fr. 8，5.07 g；Fr. 9，3.17 g；Fr. 10，2.76 g；Fr. 11，3.15 g；Fr. 12，2.77 g；Fr. 13，3.29 g；Fr. 14，2.35 g；Fr.15，2.69 g；Fr. 16，1.71 g；Fr. 17，1.53 g；Fr. 18，1.43 g。將所得各部分進(jìn)行分離純化。Fr. 1-2、Fr. 5 和Fr. 9-18 因其所含化合物過(guò)于混雜，在分離過(guò)程中沒(méi)有得到純化合物。Fr. 3 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 :1 洗脫得化合物1 (63.7 mg)。Fr. 4 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =90 : 10 洗脫得到Fr. 4-1，經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =85 :15 洗脫得到Fr. 4-2；Fr. 4-1 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物2 (158.8 mg)。Fr. 4-2 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物3 (78.9 mg)。Fr. 6 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =65 : 35 洗脫得到Fr. 6-1，F(xiàn)r. 6-1 經(jīng)凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物4 (58.2 mg)。Fr. 7 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =70 :30 洗脫得到Fr. 7-1，F(xiàn)r. 7-1 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物5 (84.6 mg)。Fr. 8 經(jīng)凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物6 (103.5 mg)。

1.2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物4：白色針狀晶體 (甲醇) ，熔點(diǎn)為210 ℃。其NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。1H NMR (600 MHz, DMSOd6),δ: 5.98 (s, H-C(5), 1H)，2.13 (s, H-C(8), 3H)，1.73 (s, HC(7), 3H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 165.0 (C=O,C-2)，164.9 (C=C, C-4)，159.2 (C=C, C-6)，99.7 (C=C, C-5)，96.2 (C=C, C-3), 19.1 (CH3, C-8)，8.2 (CH3, C-7)。ESIMS (m/z): 139 [M-H]-給出分子離子峰，結(jié)合1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)，推導(dǎo)其分子式為C7H8O3，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù) (熔點(diǎn)為209～211 ℃[17])，鑒定化合物4 為4-羥基-3, 6-二甲基-2H-吡喃酮。

6 種化合物的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1。

圖式1 化合物1～6 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Scheme 1 Structures of compounds 1-6

1.3 殺蟲(chóng)活性測(cè)定

1.3.1 對(duì)埃及伊蚊的活性初篩 分別稱取25 mg供試化合物，加入1 mL 二甲基亞砜溶解，用去離子水定容至50 mL，得到化合物質(zhì)量濃度為500 mg/L的藥液，備用。以相同質(zhì)量濃度的魚(yú)藤酮作為藥劑對(duì)照，以含等量溶劑的去離子水溶液作為空白對(duì)照。采用浸漬法[22]測(cè)定各化合物對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。每處理重復(fù)3 次，每重復(fù)用滴管吸取20 只大小均一、發(fā)育一致的埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)。分別于處理后12、24、36 和72 h 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。以蟲(chóng)體僵直、尾部明顯變黑，浮于藥液上或沉于底部者判為死亡。

1.3.2 測(cè)定高活性化合物對(duì)埃及伊蚊的LC50值

以含1 mL 二甲基亞砜的去離子水為溶劑，配制質(zhì)量濃度為4 000 mg/L 的母液，繼而用去離子水稀釋成系列質(zhì)量濃度分別為400、300、200、100 和50 mg/L 的藥液。處理方法同1.3.1 節(jié)，于72 h 觀察記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計(jì)分析72 h 試蟲(chóng)死亡結(jié)果，并計(jì)算LC50值。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 分別按公式 (1)、 (2) 計(jì)算死亡率(M1)和校正死亡率(M2)：

式中：K為死亡蟲(chóng)數(shù)，N為處理總蟲(chóng)數(shù)，M0為空白對(duì)照組的死亡率。

采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計(jì)分析不同處理間的差異顯著性 (Duncan’s 新復(fù)極差測(cè)定法)，采用毒力回歸方法進(jìn)行毒力測(cè)定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲(chóng)活性

結(jié)果 (表1) 表明，在分離得到的6 個(gè)化合物中，只有化合物1 和3 對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出不同程度的毒殺活性，且致死率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中在72 h 時(shí)，化合物1 的校正死亡率達(dá)100%，化合物3 的校正死亡率達(dá)80%以上，故對(duì)這兩個(gè)化合物進(jìn)一步進(jìn)行了毒力測(cè)定。

表1 500 mg/L 化合物1～6 對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

表1 500 mg/L 化合物1～6 對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著 (P＜0.05，DMRT 法) ；“—” 表示無(wú)毒殺作用。Note: Data followed different letters within colum indicate significant differences at 0.05 level. "—" indicate no larvicidal activity.

X±SD校正死亡率 (, n = 3)成分Compounds Adjusted mortality rate/%12 h24 h36 h72 h 173.33±7.64 b 83.33±2.89 b 86.67±2.89 b 100.00±0.00 a 2——6.67±3.33 c 358.33±2.89 c 70.00±5.00 c 78.33±5.77 c 81.66±2.89 b 4———8.33±2.89 c 6——5——CK——魚(yú)藤酮 rotenone 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a

線性回歸分析結(jié)果 (表2) 表明：化合物1 和3 對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)的毒力在72 h 后均呈現(xiàn)清晰的劑量-效應(yīng)關(guān)系?；衔? 和3 的LC50值分別為162 mg/L 和240 mg/L，高于魚(yú)藤酮的LC50值13.4 mg/L，說(shuō)明兩個(gè)化合物殺蟲(chóng)活性不如魚(yú)藤酮。

表2 72 h 化合物1 和3 對(duì)埃及伊蚊3 齡幼蟲(chóng)的LC50 值Table 2 LC50 value of compound 1 and 3 after 72 h against the third instar larvae of Aedes aegypti

3 結(jié)論與討論

本研究從海洋真菌Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807混合發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到6 個(gè)化合物，分別鑒定為agathic acid (1)、4-羥基苯甲醛(2)、nafuredin (3)、4-羥基-3,6-二甲基-2H-吡喃酮(4)、甲瓦龍酸內(nèi)酯 (5)和brefeldin A (6)。其中化合物1 和3 表現(xiàn)出明顯的殺埃及伊蚊幼蟲(chóng)活性，進(jìn)一步表明了混合發(fā)酵技術(shù)有可能成為尋找活性天然產(chǎn)物的有效途徑。混合發(fā)酵與單獨(dú)發(fā)酵獲得的次生代謝物有所不同，單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，從哈茨木霉主要分離出二肽類化合物[4], 從短柄青霉菌中主要分離出吲哚生物堿[24]，而混合發(fā)酵可以除同時(shí)分離出兩種真菌所具有的次生代謝物，如化合物Nafuredin，還可以分離出單獨(dú)發(fā)酵時(shí)未獲得次生代謝物，如化合物agathic acid。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，agathic acid 具有抗炎、抗病毒活性[25]；nafuredin具有抗菌活性[26]，而有關(guān)agathic acid 和nafuredin的殺蟲(chóng)活性未見(jiàn)報(bào)道，本研究豐富了其殺蟲(chóng)活性。另外，兩個(gè)活性化合物的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可作為研發(fā)生物殺蟲(chóng)劑的先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。