致病桿菌屬細菌代謝物抑菌活性研究進展

韓云飛, 他永全, 王 勇,2, 馮俊濤,2, 王永紅*,,2

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料之一，在保障糧食安全中發(fā)揮著重要作用，但其不合理使用也帶來了一系列問題，例如殺菌劑過量使用引起的病原菌耐藥性增強等。為了治理病原菌耐藥性的問題，新型殺菌劑的研究與開發(fā)顯得尤為重要。自然界中幾乎所有的微生物都能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，這既是一種生存策略，也是一種防御機制[1]，因此從微生物代謝產(chǎn)物中尋找具有抑菌活性的化合物是一種可行的方法。目前我國已經(jīng)研發(fā)成功包括多效霉素、多抗霉素、公主嶺霉素、井岡霉素、春雷霉素、申嗪霉素、中生菌素及寧南霉素等在內(nèi)的多種農(nóng)用抗生素，其中由放線菌產(chǎn)生的春雷霉素以及由鏈霉菌產(chǎn)生的中生菌素、井岡霉素等抗生素已被廣泛用于農(nóng)作物病害的防治[2-3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，摩根菌科 (Morganellaceae) 的致病桿菌屬 (Xenorhabdus) 和發(fā)光桿菌屬 (Photorhabdus)細菌能夠產(chǎn)生多種具有不同活性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物分別具有抑菌[4]、殺蟲[5]、殺螨[6-7]、殺線蟲[8]、抗?jié)僛4]以及抗腫瘤[9]等活性。本文主要圍繞致病桿菌屬細菌代謝產(chǎn)物抑制真菌、細菌和卵菌的活性展開，綜述了可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的代表性菌株、所產(chǎn)生活性化合物的種類、活性化合物的抑菌作用機理、抑菌活性化合物的生物合成與調(diào)控、提高抑菌活性的方法、致病桿菌屬細菌的實際應(yīng)用及如何應(yīng)對現(xiàn)階段存在的問題等方面的內(nèi)容，以期為促進致病桿菌屬細菌在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 致病桿菌屬細菌研究概況

致病桿菌屬細菌是一類存在于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的共生菌，與斯氏線蟲屬 (Steinernema)的線蟲共生，其模式菌株為嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila[10]。昆蟲病原線蟲共生菌存在于侵染期線蟲的腸道中，可跟隨線蟲進入昆蟲體內(nèi)，在昆蟲的血腔中大量繁殖，產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)，與線蟲共同作用殺死寄主昆蟲，待寄主死后繼續(xù)取食，直至營養(yǎng)耗盡，再跟隨線蟲尋找下一寄主[11]。嗜線蟲致病桿菌具有兩種生活形態(tài)，在添加了溴百里酚藍和氯化三苯基四氮唑的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (NBTA) 上，初生型菌株呈綠色(圖1)，次生型呈近似暗紅色，其具體顏色和培養(yǎng)條件存在一定的關(guān)系；初生型菌株能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，而次生型菌株則不能。

圖1 嗜線蟲致病桿菌YL001 初生型菌株在NBTA 培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig. 1 Characteristics of primary phenotypic X.nematophila YL001 on NBTA medium

近幾十年來，關(guān)于致病桿菌屬細菌抑菌活性的研究備受矚目。美國、德國、加拿大、澳大利亞、南非及土耳其等相繼開展了一系列研究，其中，美國、加拿大和澳大利亞較早開始了其代謝產(chǎn)物抑菌活性的研究，德國主要致力于相關(guān)代謝物的生物合成及調(diào)控，南非和土耳其的研究涉及代謝物的分離與活性。國內(nèi)則主要有西北農(nóng)林科技大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位開展了相關(guān)研究。其中，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院是國內(nèi)最早進行昆蟲病原線蟲共生菌相關(guān)活性研究的單位，成功分離到了一些高活性的化合物，并初步探索了其抗細菌的作用機理[12-14]；西北農(nóng)林科技大學(xué)較為系統(tǒng)地分離了嗜線蟲致病桿菌的次級代謝產(chǎn)物，在一定程度上探索了次級代謝產(chǎn)物的抑菌作用機理，初步研究了相關(guān)代謝物的調(diào)控，并探索了發(fā)酵液的應(yīng)用[15-19]；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)近些年開始大量分離昆蟲病原線蟲共生菌，并進行了代謝產(chǎn)物的分離研究[20-23]；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)主要研究了致病桿菌代謝物的殺蟲作用，對其抑菌活性也有所涉及[24-25]；南開大學(xué)近年主要探索了利用致病桿菌代謝物防治土傳病害的問題[26]。

2 致病桿菌屬細菌代謝物的抑菌活性

2.1 可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的致病桿菌屬細菌

多種昆蟲病原線蟲共生菌都具有產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力。在已報道的文獻 (見表1) 中，主要有伯氏致病桿菌X. bovienii、X. budapestensis、X. cabanillasii、X. doucetiae、X. khoisanae、嗜線蟲致病桿菌X. nematophila、X. romanii和X.szentirmaii這8 種細菌的代謝物具有抑菌活性，其抑菌譜包括多種細菌、真菌和卵菌。值得注意的是，致病桿菌屬細菌發(fā)酵液對卵菌的抑制效果尤為明顯，抑菌率顯著高于對真菌的。

表1 致病桿菌屬細菌發(fā)酵液的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of the fermentation liquid of genus Xenorhabdus

2.2 具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物

致病桿菌屬細菌可產(chǎn)生多種具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，其中最值得研究的有以下幾種化合物(圖2 和圖3)：Xenocoumacin 1 (Xcn1，1) 和PAX 系列抗菌肽，兼具抗卵菌、抗真菌和抗細菌活性；Nematophin (13)、Xenorxide 1 (24)、Xenorxide 2 (25) 和Xenofuranone B (62)，具有抗真菌和抗細菌活性；Xenorhabdin 2 (15) 和Odilorhabdin 衍生物，具有抗細菌活性。

圖2 致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的抑菌活性化合物 (1～25)Fig. 2 Antimicrobial compounds (1-25) produced by genus Xenorhabdus

圖3 致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的多肽類抑菌活性化合物 (26～54)Fig. 3 Polypeptide antimicrobial compounds (26-54) produced by genus Xenorhabdus

2.2.1 Xenocoumacin 類化合物 Xenocoumacin 類化合物 (1～6) 最早是從嗜線蟲致病桿菌的代謝物中分離得到的，其主要代表為Xcn1，Xcn1 含有精氨酸殘基和二氫異香豆素結(jié)構(gòu)，Xcn2 (2) 碳鏈的末端不含胍基[4]。嗜線蟲致病桿菌還可通過自身解毒作用分解Xcn1，在代謝過程中產(chǎn)生抑菌活性低于Xcn1 的5 種新化合物——Xcn2～Xcn6 (2～6)，通過改變菌株的培養(yǎng)條件，研究者成功檢測到了Xcn3～Xcn6 (3～6)[34]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院是我國最早成功分離得到Xcn1 的單位，并發(fā)現(xiàn)了其優(yōu)異的抗卵菌活性，Xcn1 對苧麻疫霉Phytophthora boehmeria和辣椒疫霉P. capsici的EC50值分別為0.25 和2.44 μg/mL[35]。西北農(nóng)林科技大學(xué)的張淑靜[36]也成功分離到了Xcn1，并發(fā)現(xiàn)了其在防治油菜菌核病中的作用，測得Xcn1 對油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum的EC50值為3.0 μg/mL；此外，質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL 的Xcn1 對水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum和葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea的抑制率均能達到80%以上[36]?？傊?，Xcn1 因其抑菌活性良好，具有開發(fā)成為農(nóng)用殺菌劑的潛力。

2.2.2 吲哚類化合物 從致病桿菌屬細菌代謝產(chǎn)物中分離到的一些吲哚類衍生物對多種細菌和真菌具有較好的抑制活性。在伯氏致病桿菌A2菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了4 種吲哚類化合物 (7～10)，其中化合物7 和8 對新型隱球菌Cryptococcus neoformans的最低抑制濃度 (MIC) 值分別為50 和25 μg/mL，化合物9 和10 對灰霉病菌的MIC 值為12 μg/mL，化合物10 對致病疫霉Phytophthora infestans的MIC 值為50 μg/mL[37]。李鳳麟等[38]在嗜線蟲致病桿菌SN313 菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了2 種吲哚類化合物，其中首次發(fā)現(xiàn)的化合物11 對辣椒疫霉的IC50值為11.20 μg/mL，化合物12 對番茄灰霉病菌的IC50值為41.58 μg/mL。Nematophin(NEP，13) 最早由Li 等[39]從嗜線蟲致病桿菌BC1菌株的代謝產(chǎn)物中分離得到，能夠抑制細菌、真菌和卵菌，NEP 對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的MIC 值為0.75 μg/mL，對枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、致病疫霉和灰霉病菌的MIC 值為12 μg/mL。Zhang 等[17]從嗜線蟲致病桿菌YL001菌株的代謝產(chǎn)物中也分離得到了NEP，并測定了其農(nóng)用抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對水稻紋枯病菌的EC50值為40.00 μg/mL，500 μg/mL 的NEP 對水稻紋枯病的治療作用防效可達83.59%，與多菌靈的防效相當(dāng)。綜上可見，NEP 能夠抑制多種病原菌，具有良好的應(yīng)用前景。

2.2.3 二硫吡咯類化合物 從致病桿菌屬細菌代謝物中發(fā)現(xiàn)的二硫吡咯類化合物主要包括Xenorhabdins 和Xenorxides 兩類 (14～25)。在嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌的代謝物中都發(fā)現(xiàn)了Xenorhabdins (14～23) ，且這類化合物都具有抑菌活性。McInerney 等[40]在嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)了Xenorhabdin 1～Xenorhabdin 6 (14～19)，其中Xenorhabdin 2 (15)對滕黃微球菌Micrococcus luteus、化膿性鏈球菌Streptococcus pyogenes、蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus和金黃色葡萄球菌的MIC 值分別為0.156、1.25、3.13 和20 μg/mL，且其他幾種化合物的抑菌譜與Xenorhabdin 2 類似。Li 等[37]在伯氏致病桿菌A2 菌株代謝物中首次發(fā)現(xiàn)了Xenorhabdin 7 (20)和Xenorhabdin 8 (21)。Xenorhabdin 9 (22) 和Xenorhabdin 10 (23) 則是沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)的張文波等[22]從伯氏致病桿菌SN52 菌株代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的新化合物，這兩種化合物對枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的IC50值在10～21 μg/mL 之間。

Chen[41]在伯氏致病桿菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)了Xenorxide 類化合物 (24～25)，并發(fā)現(xiàn)其具有抗真菌和抗細菌活性。其中，Xenorxide 1 (24) 對煙曲霉Aspergillus fumigatus的MIC 值為0.75 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC 值為3 μg/mL。有趣的是，對于在臨床上已產(chǎn)生多重抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株，Xenorxide 1 的MIC 值反而降低了4 倍；同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在Xenorxide 2 (25) 中，但Xenorxide 1 的抑菌效果強于Xenorxide 2，Xenorxide 2 對煙曲霉的MIC 值為1.5 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC 值為3 μg/mL，對于在臨床上已產(chǎn)生多重抗藥性的金黃色葡萄球菌菌株，其M I C 值降低了2 ～4 倍[41]。該結(jié)果表明，Xenorxides 或許可用于治理已產(chǎn)生抗藥性的菌株。煙曲霉可引起食品腐爛，導(dǎo)致人和其他動物患病[42]，而Xenorxides 對煙曲霉效果較好，因此可考慮探索其在食品防腐中的應(yīng)用?？傊?，無論在醫(yī)學(xué)還是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的含硫吡咯烷類代謝物都具有一定的應(yīng)用價值與開發(fā)潛力。

2.2.4 多肽類化合物 由致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的多肽類抗生素主要有5 大類，分別是Odilorhabdins(ODLs) 、Xenematides、Bicornutins、Peptideantimicrobial-Xenorhabdus (PAXs) 和Xenortides。多肽類抗生素的相對分子質(zhì)量較大，如Xenematides和Bicornutins 的相對分子質(zhì)量在600～1 000 之間，ODLs 和PAXs 在1 000 以上。

Xenortide A (26) 和Xenortide B (27) 最早由Lang 等[43]發(fā)現(xiàn)于嗜線蟲致病桿菌的代謝物中，而Reimer 等[44]在嗜線蟲致病桿菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)了Xenortide C (28) 和Xenortide D (29)。Xenortides的4 個化合物都具有抗微生物活性。

B?sz?rményi 等[45]發(fā)現(xiàn)了Bicornutins (30～31)的抗卵菌活性，在25 μg/mL 時，Bicornutins 化合物的混合物幾乎可完全抑制煙草疫霉Phytophthora nicotianae的孢子萌發(fā)。

PAXs 同時兼具抗真菌、抗卵菌和抗細菌活性。Gualtieri 等[46]從嗜線蟲致病桿菌F1 菌株的代謝物中發(fā)現(xiàn)了PAX1～PAX5 (32～36)，在質(zhì)量濃度為20 μg/mL 條件下，PAX1～PAX3 (32～34) 對枝孢霉屬Cladosporiumsp.和黃色鐮孢菌Fusarium culmorum的抑制率均能達到90%以上，20 μg/mL的PAX2 (33) 對疫霉Phytophthora myc的抑制率可達81%；PAX1～PAX3 對尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum的抑制活性最強，其MIC 值為1.56 μg/mL，PAX4 (35) 對表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis的MIC 值為12.5 μg/mL，PAX5 (36)對大腸埃希菌和表皮葡萄球菌的MIC 值為12.5 μg/mL。Fuchs 等[47]在嗜線蟲致病桿菌HGB081 菌株的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了13 個PAXs 化合物 (32～44) 。Dreyer 等[31]首次在致病桿菌屬的X. khoisanaeSB10 菌株代謝物中發(fā)現(xiàn)了PAXs 化合物，其中PAX1 對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和假絲酵母菌Candida albicans 均具有抑制作用。

目前已發(fā)現(xiàn)7 種Xenematides 化合物 (45～51)，這些化合物兼具醫(yī)用和農(nóng)用抑菌活性。美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院最早在嗜線蟲致病桿菌ATCC19061 菌株的無細胞發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了Xenematide A (45) ，之后又相繼發(fā)現(xiàn)了Xenematide B (46)、Xenematide C (47) 和Xenematide D (48)[48-49]。盧星忠等[50]發(fā)發(fā)現(xiàn)了Xenematide E (49)，并測定了Xenematide C 和Xenematide E 對植物病原真菌的抑制作用，測得Xenematide C 和Xenematide E 對番茄灰霉病菌的EC50值分別為22.71 和85.31 μg/mL。Xi 等[51]發(fā)現(xiàn)了Xenematide F (50) 和Xenematide G (51)，并測定了其抑菌活性，其中Xenematide B 對枯草芽孢桿菌的MIC 值為64 μg/mL，Xenematide F 對綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和腸炎沙門菌Salmonella enteritidis的MIC 值分別為32 和64 μg/mL，Xenematide G 的抑菌活性最好，對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC 值為16 μg/mL。

Odilorhabdin 類 (ODLs) 化合物最早是由美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的。Pantel 等[52]在嗜線蟲致病桿菌CNCM I-4 530 菌株的代謝物中發(fā)現(xiàn)了一類新的多肽類抗生素 (52～54)，分別將其命名為NOSO-95A(52)、NOSO-95B (53) 和NOSO-95C (54)，這類抗生素能夠抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，也包括已對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生抗性的腸桿菌科細菌。 Pantel 等[52]研究發(fā)現(xiàn)，ODLs 的衍生物NOSO-95179 對肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae的抑制活性最強，其MIC 值為4 μg/mL，對粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens和大腸埃希菌Escherichia coli的MIC值為8 μg/mL[52]。ODLs 及其衍生物抑菌活性好且對抗藥性菌株有效，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著較好的開發(fā)應(yīng)用前景，但有關(guān)ODLs的農(nóng)用抑菌活性目前還未見明確報道。

綜上可見，多肽類化合物種類較多，結(jié)構(gòu)變化多樣，大多兼具農(nóng)用和醫(yī)用活性，其中PAXs的農(nóng)用活性較為突出，ODLs 的醫(yī)用潛力較大。

2.2.5 酰胺類化合物 因其長鏈上含有酰胺結(jié)構(gòu)，有學(xué)者也將吲哚類衍生物NEP 歸為酰胺類化合物。劉霞[53]從嗜線蟲致病桿菌YL001 的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了幾種酰胺類化合物 (55～57，圖4) ，并發(fā)現(xiàn)這幾種化合物對番茄灰霉病菌均有一定的抑制活性。Zhang 等[17]在嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株發(fā)酵液的石油醚萃取物中發(fā)現(xiàn)了化合物58，其在50 μg/mL 下對玉米大斑病菌的抑制率為67.70%[17]；同時在該菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中還發(fā)現(xiàn)了化合物59，但該化合物的抑菌活性較弱。張春珍等[23]在伯氏致病桿菌SN269 菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了化合物Madumycin Ⅱ (60)，該化合物具有抗真菌活性，對番茄灰霉病菌、辣椒疫霉及玉米大斑病菌的EC50值分別為35.40、35.32 和47.43 μg/mL。酰胺類化合物結(jié)構(gòu)多樣，相對分子質(zhì)量較小，便于化學(xué)合成，因此對這些具有抑菌活性的天然產(chǎn)物進行合理的結(jié)構(gòu)改造將有助于拓寬其應(yīng)用范圍。

圖4 致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的酰胺類及其他抑菌活性化合物 (55～64)Fig. 4 Amides and others antimicrobial compounds (55-64) produced by genus Xenorhabdus

2.2.6 其他類型化合物 Ji 等[54]在嗜線蟲致病桿菌代謝物中發(fā)現(xiàn)的Benzylidenacetone (61)具有一定的抑菌活性，能夠抑制冠癭病菌Agrobacterium vitis、胡蘿卜軟腐病菌Pectobacterium carotovorum及茄科青枯病菌Ralstonia solanacearum等多種植物病原細菌，但在質(zhì)量濃度為鏈霉素4 倍的情況下，其抑菌活性仍低于對照鏈霉素，因此該化合物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景不大。

致病桿菌屬細菌還能夠產(chǎn)生具呋喃酮結(jié)構(gòu)的抑菌活性化合物，這類化合物最早由Brachmann等[55]從X. szentirmaii菌株的代謝物中分離得到。Xenofuranone A (62) 和Xenofuranone B (63) 對銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、糞腸球菌Enterococcus faecalis、假絲酵母菌和大腸桿菌均具有一定的抑制活性[55-56]。此外，Xenofuranone B 對金黃色葡萄球菌和假絲酵母菌的MIC 值分別為64 和2 μg/mL[57]。針對Xenofuranone A 和Xenofuranone B 的農(nóng)用活性目前暫無相關(guān)報道，研究者可嘗試測定其對植物病原菌的抑制作用。因其對假絲酵母菌的抑制活性較好，Xenofuranone B 具有開發(fā)成為醫(yī)藥的潛力。

2018 年，西北農(nóng)林科技大學(xué)的劉啟[58]和沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)的李鳳麟等[38]分別在嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株和SN313 菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了申嗪霉素 (64) 。傳統(tǒng)的申嗪霉素是從假單胞菌屬(Pseudomonads) 的代謝物中分離得到的[59]，嗜線蟲致病桿菌為天然申嗪霉素生產(chǎn)提供了新的來源。

綜上，致病桿菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，其中研究最多的是嗜線蟲致病桿菌，其次是伯氏致病桿菌。一些抑菌活性化合物 (如 Xenorhabdins) 在嗜線蟲致病桿菌和伯氏致病桿菌的代謝物中都能夠被發(fā)現(xiàn)，這是由于這兩種菌的生物學(xué)關(guān)系較近，由此推測其他化合物也應(yīng)當(dāng)可以在生物學(xué)關(guān)系相近的菌株中被發(fā)現(xiàn)，但還需進一步研究。關(guān)于從細菌的代謝物中分離獲取單一化合物目前還沒有統(tǒng)一的方法，獲得所需化合物存在一定的難度，因此其他人不易開展相關(guān)研究，一般都是某個課題組發(fā)現(xiàn)一種或幾種活性化合物后，團隊自己再進行后續(xù)研究。僅少數(shù)化合物如Xcn1 等，由于抑菌活性好、發(fā)現(xiàn)時間較早、抑菌譜較廣等原因研究相對較多?？傊?，新活性與新化合物的發(fā)現(xiàn)依然極為重要。

3 抑菌活性化合物的作用機理

致病桿菌屬細菌代謝產(chǎn)物中具有抑菌活性的化合物種類較多，其作用機理也存在差異。相關(guān)研究表明，一些來源于致病桿菌屬細菌的天然產(chǎn)物能夠抑制蛋白質(zhì)的合成，但不同化合物抑制蛋白質(zhì)合成過程中的具體步驟存在些許差異。如Xcn1可能是通過與精氨酰tRNA 結(jié)合來抑制肽鏈的延伸，ODLs 衍生物NOSO-95179 通過增加tRNA 與核糖體的親和力而抑制翻譯過程的起始階段，而Madumycin II 則通過阻止tRNA 的CCA 末端與肽基轉(zhuǎn)移酶中心結(jié)合而抑制第一個肽鍵的形成。

3.1 Xenocoumacin 1 的作用機理

現(xiàn)有研究表明，Xenocoumacin 類化合物中以Xcn1 的抑菌活性最強，且其作用機理主要在影響蛋白質(zhì)合成方面。Xcn1 對疫霉 (Phytophthora)的活性最強，可影響辣椒疫霉孢子囊形成、游動孢子萌發(fā)和菌絲生長，并可引起菌絲發(fā)生明顯的形態(tài)變化[60]。Zhou 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Xcn1 可引起與氨基酸合成、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及氨酰tRNA 合成等相關(guān)基因的下調(diào)。張淑靜[36]發(fā)現(xiàn)，Xcn1 可引起油菜菌核病菌的菌絲畸形及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，通過分子對接發(fā)現(xiàn)，Xcn1 能夠與精氨酰-tRNA 合成酶上的4 個氨基酸殘基形成氫鍵，從而抑制精氨酰-tRNA 合成酶的活性。滅瘟素 (Blasticidin S) 具有與Xcn1 相似的長鏈結(jié)構(gòu)，且二者長鏈末端都含有胍基，其作用機理在于通過抑制攜帶多肽的tRNA 的水解，使得新合成的肽鏈片段無法釋放，即抑制翻譯過程的終止階段[61-62]。Polikanov等[63]在短小芽孢桿菌Bacillus pumilus中發(fā)現(xiàn)的Amicoumacin A (AMI) 與Xcn1 的結(jié)構(gòu)也極為相似，其能夠結(jié)合到核糖體上，通過穩(wěn)定mRNA-核糖體的相互作用而影響翻譯的延伸過程。Zumbrunn 等[64]指出，Xcn1 的作用機理和AMI 相同，但目前尚無法充分證明，因為AMI 的長鏈結(jié)構(gòu)可與16S rRNA 和mRNA 結(jié)合形成氫鍵，而Xcn1 的碳鏈比AMI 長，可能會影響其進入16S rRNA 和mRNA 之間的空腔中，此外，二者的相同結(jié)構(gòu)苯并吡喃環(huán)在抑制翻譯的過程并未顯示出作用。綜上，Xcn1 的長鏈結(jié)構(gòu)和胍基結(jié)構(gòu)可能在影響蛋白質(zhì)翻譯的過程中發(fā)揮著重要作用，但Xcn1 具體如何影響蛋白質(zhì)的翻譯仍需進一步確定。

3.2 Nematophin 的作用機理

Zhang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NEP 能夠引起水稻紋枯病菌菌絲表面皺縮、菌絲體畸形、細胞器顯著受損以及線粒體數(shù)量明顯減少，此外還能夠顯著減少水稻紋枯病菌菌核的產(chǎn)生，但上述影響并無劑量效應(yīng)。現(xiàn)有研究僅顯示了NEP 抑菌作用的表觀機理，其分子機理仍需進一步研究。

3.3 Odilorhabdin 類化合物的作用機理

Odilorhabdin 類 (ODLs) 化合物主要通過作用于核糖體而抑制蛋白質(zhì)的合成，且與四環(huán)素和鏈霉素的作用機理顯著不同。Pantel 等[52]通過冷凍電鏡研究發(fā)現(xiàn)，ODLs衍生物NOSO-95179 作用于核糖體解碼中心的A位點，并與16S rRNA 殘基形成多重氫鍵，增加氨酰-tRNA 與核糖體的親和力，使核糖體不能釋放，從而抑制翻譯過程的起始階段。

3.4 Madumycin II 的作用機理

Madumycin II 可結(jié)合到70S 核糖體的大亞基上，迫使肽基轉(zhuǎn)移酶中心進入非活性狀態(tài)，進而抑制肽鍵的形成。Osterman 等[65]研究發(fā)現(xiàn)，在Madumycin II 濃度為3.2 μmol/L 條件下，甲硫氨酸-苯丙氨酸二肽的形成率降低至40%；當(dāng)該化合物濃度為5 μmol/L 時，甲硫氨酸-苯丙氨酸二肽的形成率僅為10%左右。在肽鍵形成的第一周期之前，Madumycin II 即可結(jié)合到核糖體上，其雖然不會影響tRNA 與核糖體A 和P 位點的結(jié)合，但能夠阻止tRNA 的CCA 末端正確定位到肽基轉(zhuǎn)移酶中，導(dǎo)致tRNA 攜帶的甲硫氨酸無法與下一個氨基酸之間形成肽鍵，使蛋白質(zhì)無法正常合成[65]。

4 抑菌活性化合物的生物合成與調(diào)控

致病桿菌屬細菌的次級代謝產(chǎn)物中，關(guān)于Xcn1、NEP、OLDs 和Xenematides 的生物合成研究較多，由于申嗪霉素最早不是在致病桿菌代謝物中發(fā)現(xiàn)的，故本文不再涉及。Xcn1 的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且是通過先生成無活性的前體物質(zhì)再裂解為Xcn1 的過程得到的，故有別于其他活性化合物。上述幾種化合物中，關(guān)于Xcn1 代謝調(diào)控方面的研究較多，對NEP、OLDs 和Xenematides 代謝調(diào)控的研究較少，其中NEP 的生物合成途徑較為簡單，因此OLDs 和Xenematides 的代謝調(diào)控將是一個重要的研究方向。近年的研究揭示了一種新型調(diào)控因子在天然產(chǎn)物生物合成中的作用，認為一種依賴于調(diào)控蛋白Hfq 的名為ArcZ 的小RNA是產(chǎn)生某些特定天然產(chǎn)物所必需的[66]。這類新型調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)將有助于提高某些天然產(chǎn)物的含量。

4.1 Xenocoumacin 類化合物的生物合成與調(diào)控

非核糖體肽合成酶 (NRPS) 和聚酮合成酶(PKS) 參與了Xcn1 的生物合成。Xcn1 的生物合成與轉(zhuǎn)化共涉及14 個基因，分別為xcnA、xcnB、xcnC、xcnD、xcnE、xcnF、xcnG、xcnH、xcnI、xcnJ、xcnK、xcnL、xcnM和xcnN，其中xcnA～xcnL基因負責(zé)Xcn1 的生物合成，xcnM和xcnN負責(zé)Xcn1 向Xcn2 的轉(zhuǎn)化[67]。XcnA 和XcnK 為非核糖體肽合成酶，XcnF、XcnH 和XcnL 為聚酮合酶[68]。嗜線蟲致病桿菌在細胞質(zhì)中先按照XcnA→XcnH→XcnK→XcnL→XcnF 的催化順序合成沒有活性的前體物質(zhì)，隨后XcnG 催化裂解Xcn1 前體上?；奶於０窔埢纬捎谢钚缘腦cn1，最后被ABC 轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到細胞外[69]。

具有抑菌活性的Xcn1 對嗜線蟲致病桿菌自身也有一定的毒性，若其積累過高會引起xcnM和xcnN的大量表達，導(dǎo)致Xcn1 轉(zhuǎn)化為活性較低的Xcn2，且Xcn1 和Xcn2 還可以分別轉(zhuǎn)化為Xcn5 和Xcn6[34]。當(dāng)環(huán)境中堿性過強時，Xcn1 中呈弱堿性的長鏈胍基會被分解，因此，發(fā)酵液的pH 值對Xcn1 的代謝調(diào)控具有很重要的影響。研究顯示，在接近中性的條件下，嗜線蟲致病桿菌發(fā)酵液的抑菌活性將得到增強，其菌株生長和產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的最適pH 值在6.5～7.5 之間[70]。在5.5～8.5 范圍內(nèi)，當(dāng)pH 值逐漸升高時，xcnA～xcnL基因的表達量隨之升高，從而促進Xcn1 的生物合成，使得Xcn1 的產(chǎn)量得到較大幅度提升[15]。此外，李忝珍等[71]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的NaCl 有利于嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株的生長以及Xcn1的生物合成。

雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的OmpR 和CpxR 可負向調(diào)控Xcn1 的合成，敲除cpxR基因后，嗜線蟲致病桿菌發(fā)酵液的抑菌活性可提高1.4～1.7 倍[18]，而在ompR基因缺失的突變體中，xcnA～xcnL基因的表達量上調(diào)，抑菌活性得到提高[67]。全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lrp 和FliZ 可正向調(diào)控Xcn1 的生物合成，LeuO 則負向調(diào)控Xcn1 的生物合成[72-73]。然而，通過操控這幾種調(diào)控因子雖然能夠顯著提高Xcn1 的產(chǎn)量，但仍無法達到大量應(yīng)用的要求，因此還需要繼續(xù)深入研究Xcn1 的調(diào)控機制。

4.2 Nematophin 的生物合成

NEP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)較為簡單，通過異源表達的方式已經(jīng)明確其生物合成途徑，NEP 的生物合成是由一種名為RdpD 的非核糖體肽合成酶完成的，不存在多個重復(fù)的模塊[74]。目前尚未見關(guān)于調(diào)控NEP 生物合成的相關(guān)報道。因其結(jié)構(gòu)較為簡單，Wesche 等[75]采用化學(xué)方法合成了NEP 及其類似物，但NEP 衍生物的抑菌活性相比母體而言有所降低。此外，Zhang 等[17]發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成所得同時含有兩種構(gòu)型的NEP 和從發(fā)酵液中分離得到的NEP 在抑菌活性上并無顯著性差異，這也說明了天然產(chǎn)物NEP 可能是兩種構(gòu)型的混合物。

4.3 Odilorhabdin 類化合物的生物合成

Odilorhabdin 類化合物的生物合成由odl1、odl2、odl3和odl44 個編碼基因控制，含有m1～m10 共10 個模塊，包含有縮合結(jié)構(gòu)域 (C)、腺苷?；Y(jié)構(gòu)域 (A) 和肽酰載體蛋白 (T)，在m10 模塊的后面存在一個硫酯酶結(jié)構(gòu)域 (TE)，該結(jié)構(gòu)域負責(zé)終止肽鏈的延伸[52]。

4.4 Xenematide 類化合物的生物合成

非核糖體肽合成酶負責(zé)Xenematide 類化合物的生物合成，與OLDs 的生物合成相比，Xenematide類化合物由4 個CAT 模塊組成，并在最末端含有一個TE 模塊[49]。

5 存在的問題與對策

5.1 如何提高殺菌活性以及活性化合物的產(chǎn)量

盡管致病桿菌屬細菌的代謝物中包含多種抑菌活性較好的化合物，但產(chǎn)率較低仍是限制其進一步開發(fā)利用的重要因素。為促進其更好地應(yīng)用，一方面可以采用化學(xué)方法合成這些活性化合物，另一方面就是采取適當(dāng)?shù)牟呗砸蕴岣呔甏x物中活性化合物的產(chǎn)量。相關(guān)策略包括發(fā)酵工藝優(yōu)化、操控調(diào)控因子、操控啟動子及操控關(guān)鍵酶等手段。

采用化學(xué)合成的方法合成一些天然產(chǎn)物及其相關(guān)衍生物，能夠提高這些天然產(chǎn)物的應(yīng)用潛力，但其衍生物并非總能提高抑菌活性。例如，OLDs 的衍生物中出現(xiàn)了活性更高的化合物[52]，申嗪霉素的衍生物中也出現(xiàn)了一些高活性化合物[76]，但Xcn1 的多種衍生物的抑菌活性卻均不如母體[64]，NEP 衍生物的抑菌活性也不如母體[75]。

菌株類型、營養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境條件等都會影響微生物代謝物的種類和含量，因此通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化能夠提高一些抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量。NEP的產(chǎn)量與菌株種類有關(guān)，嗜線蟲致病桿菌BC1 菌株的NEP 產(chǎn)量顯著高于ATCC19061 菌株和D1 菌株[39]；Xcn1的產(chǎn)量也與菌株的種類有關(guān)，比如嗜線蟲致病桿菌 All 菌株的Xcn1 產(chǎn)量明顯高于 YL001菌株[19]。此外，Xcn1 和NEP 都能在48 h 時達到最高產(chǎn)量，并在后續(xù)表現(xiàn)出產(chǎn)量下降趨勢[19,39]。張易等[77]采用紫外、微波處理等方法對嗜線蟲致病桿菌CB6 菌株進行誘變，篩選到了能夠提高Xcn1產(chǎn)量的菌株，但提高量只有10%左右。魏明敏[78]通過對嗜線蟲致病桿菌CB6 菌株的發(fā)酵過程進行優(yōu)化，將發(fā)酵液中Xcn1 的產(chǎn)量從146 μg/mL 提高到了312 μg/mL，但由于該研究中是通過建立抑菌圈大小與濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線來評價發(fā)酵液中Xcn1 的含量，試驗誤差較大，因此其結(jié)果的有效性仍需進一步評價。Dong 等[32]采用原位產(chǎn)物轉(zhuǎn)移的辦法提高Xcn1 的產(chǎn)量，該方法最大優(yōu)勢在于減少了Xcn1 的代謝降解。該研究與魏明敏[78]采用的是同一菌株，但是Xcn1的產(chǎn)量并未達到魏明敏研究中所提及的產(chǎn)量，因此，以抑菌圈大小評價化合物含量的方法并不夠精確。高江濤[19]對嗜線蟲致病桿菌YL001菌株的發(fā)酵過程進行了優(yōu)化，發(fā)酵液中Xcn1 的產(chǎn)量最高可達170 μg/mL。該研究采用高效液相色譜法檢測Xcn1 的含量，是檢測單一化合物含量的一種較為可靠的方法，因此其結(jié)果更為可靠。以嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株為研究對象，陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心進行了多項相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了不同培養(yǎng)基、pH 值、滲透壓、通氧模式及其他發(fā)酵條件對抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響[15,71,79-81]，但是，這些方法對化合物產(chǎn)量的提高仍然是有限的，目前來看并不能達到生產(chǎn)應(yīng)用所需要的水平。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了可能，基因敲除、異源表達、過表達、啟動子交換與激活等各種遺傳操控手段均可用于提高微生物的一些特定代謝物的產(chǎn)量。定向敲除負調(diào)控基因可以提高微生物代謝物的產(chǎn)量。在嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)CpxA/CpxR 中的CpxR 能夠負調(diào)控xcnA～xcnL基因，敲除cpxR基因后，Xcn1 的產(chǎn)量可提高至3 倍以上[18]。雙組分調(diào)控因子OmpR 和全局調(diào)節(jié)因子LeuO 負調(diào)控Xcn1 的生物合成，而全局調(diào)節(jié)因子FliZ 和Lrp 正調(diào)控Xcn1 的生物合成[72-73]。因此，如果能將幾個負調(diào)控基因敲除，并使正調(diào)控基因過表達，則Xcn1 的產(chǎn)量很可能會得到較大的提升。Liu 等[82]將Holrhizin A 和Rhizoxins 在短葉石勒菌Schlegelella brevitalea中進行異源表達后，其產(chǎn)量得到了顯著的提高。此外，將嗜線蟲致病桿菌的lrp基因采用阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子過表達后發(fā)現(xiàn)，Xcn1、Xenematide A 和Rhabdopeptide 1 等幾個化合物的產(chǎn)量都得到了顯著的提高[83]。啟動子激活的方法可用于定向生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物，該方法省去了大量的純化步驟，減少了分離過程中化合物的損耗，因此可視為提高特定代謝物產(chǎn)量的一種有效的方法[83]。

此外，酶工程學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展為提高特定天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了新方法。Bozhüyük 等[84]在NRPS 的縮合結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了一種交換單元縮合結(jié)構(gòu)域 (XUC)，該結(jié)構(gòu)域能夠產(chǎn)生高含量的非核糖體肽，且比化學(xué)合成的方法更加環(huán)保，其中一些人造肽的含量可達到280 mg/L。Liu 等[82]通過改造底盤菌株，發(fā)現(xiàn)了一批能夠提高異源表達時天然產(chǎn)物相對產(chǎn)量的高效底盤菌株，例如在短葉石勒菌的一些突變株中，Rhizomide A 和Icosalise A1 等幾種化合物的產(chǎn)量顯著提高。因此，將致病桿菌屬細菌代謝物中高活性化合物的生物合成基因簇在短葉石勒菌中進行表達，也是提高抑菌活性化合物產(chǎn)量的一種可行的方法。

5.2 發(fā)掘新化合物

微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物多種多樣，我們不一定能夠分離出所有的活性物質(zhì)，因此，如何發(fā)掘新化合物依然是嗜線蟲致病桿菌研究中存在的問題。除了傳統(tǒng)的分離手段外，一些新技術(shù)，如微生物共培養(yǎng)、異源表達、基因敲除、改造啟動子以及改造關(guān)鍵酶等也可用于協(xié)助發(fā)掘新的致病桿菌活性代謝產(chǎn)物。

微生物共培養(yǎng)技術(shù)可用于發(fā)掘新的微生物次級代謝產(chǎn)物。跨物種共培養(yǎng)系統(tǒng)創(chuàng)造了接近自然環(huán)境的狀態(tài)，促進了共培養(yǎng)微生物之間的相互作用，從而有可能激活一些天然產(chǎn)物的生物合成[85]。采用共培養(yǎng)技術(shù)，在海洋微生物的代謝物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種新化合物，對一些真菌也能通過模塊化共培養(yǎng)工程發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物[86-87]。將曲霉Aspergillus sydowii和枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)，目前已發(fā)現(xiàn)25 種新代謝物，其中有4 種是新化合物[88]。因此，對致病桿菌屬的細菌也可考慮采用共培養(yǎng)技術(shù)來促進新型天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。

將特定基因簇進行異源表達也能夠發(fā)現(xiàn)新的化合物，這一方法已在致病桿菌屬細菌天然產(chǎn)物發(fā)掘中得到應(yīng)用。通過將抗菌肽Xenortide 的生物合成基因簇kj12ABC異源表達至大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)了7 種含有甲硫氨酸的新型肽類化合物，且這類新化合物表現(xiàn)出了與原有化合物不同的生物活性[89-90]。Crawford 等[91]已成功將嗜線蟲致病桿菌產(chǎn)生的Rhabduscin 在大腸埃希菌中進行表達，致病桿菌屬細菌產(chǎn)生的其他天然產(chǎn)物也可參照此方法進行新化合物的發(fā)掘。

挖掘隱藏的生物合成基因簇有助于新化合物的發(fā)現(xiàn)。Liu 等[92]通過基因組挖掘和異源表達的方法，發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)新穎的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。Liu 等[82]將幾丁質(zhì)單胞菌Chitinimonas koreensis中不表達的生物合成基因簇chm在短葉石勒菌突變株中異源表達，發(fā)現(xiàn)了一系列新型天然產(chǎn)物chitinimides A～chitinimides H。通過基因組分析發(fā)現(xiàn)，嗜線蟲致病桿菌YL001 菌株含有多種天然產(chǎn)物的生物合成基因簇，但是目前并不能分離到相對應(yīng)的所有化合物[36]，而將這些生物合成基因簇在短葉石勒菌突變株中異源表達，或許能發(fā)現(xiàn)一些新的化合物。

過表達某些基因也可促進新化合物的發(fā)現(xiàn)。將嗜線蟲致病桿菌的leuO基因在X. szentirmaii菌株中過表達后，不僅發(fā)現(xiàn)了一些已知結(jié)構(gòu)但之前未被發(fā)現(xiàn)的化合物，還發(fā)現(xiàn)了一些具有新結(jié)構(gòu)的化合物[72]。此外，定向敲除某個基因也可能得到新的化合物。將構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans中全局調(diào)節(jié)因子LaeB 的基因敲除后，發(fā)現(xiàn)了8 種之前在其代謝物中未發(fā)現(xiàn)過的化合物，其中4 種是新化合物[93]。

插入啟動子激活沉默的基因簇也可得到一些之前未被發(fā)現(xiàn)的代謝物。目前這一方法已在唐菖蒲伯克霍爾德菌Burkholderia gladioli中得到應(yīng)用，通過激活其bgdd和hgdd基因簇，發(fā)現(xiàn)了一些新的脂肽類化合物[94]。啟動子激活技術(shù)也可用于幫助發(fā)掘新化合物，例如缺失hfq基因的X.szentirmaii菌株本身不能產(chǎn)生任何已知的天然產(chǎn)物，但使用阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子激活hfq突變株中相應(yīng)的生物合成基因簇后，可以使發(fā)酵液中只產(chǎn)生相應(yīng)的化合物，而無其他次級代謝產(chǎn)物的干擾，便于對特定化合物甚至是新化合物的分離和檢測[83]。

采用酶工程學(xué)的方法對非核糖體肽合成酶進行設(shè)計，也有助于新化合物的發(fā)現(xiàn)。Bozhüyük 等[95]通過對非核糖體肽合成途徑中不同模塊的可交換單元 (XUs) 進行拼接改造，建立了新型非核糖體肽合成酶，從而發(fā)現(xiàn)了一系列新化合物。該研究中的一部分XUs 即來自于致病桿菌屬細菌，因此，該方法有助于致病桿菌屬細菌代謝物中新化合物的發(fā)現(xiàn)。對NRPS 縮合結(jié)構(gòu)域中的XUC 結(jié)構(gòu)域進行重新編程，能夠產(chǎn)生包含非天然氨基酸的新型肽類化合物，這也有助于發(fā)現(xiàn)有活性的新型天然產(chǎn)物[84]。Zhong 等[96]通過對幾種多肽的起始縮合結(jié)構(gòu)域進行修飾，將乙?；溠娱L至十六烷酰基，從而生成了由特定酰基鏈組成的新化合物。

5.3 現(xiàn)階段如何科學(xué)合理利用致病桿菌屬細菌

針對同一菌株，不同人不同時期按相同的分離流程進行試驗，不一定能分離得到相同的化合物，而采用不同的分離方法卻有可能分離出同一化合物，由此可見，以分離得到的單一化合物純品進行應(yīng)用研究顯得捉襟見肘，因此，利用分離過程中的半成品、粗制品以及直接利用發(fā)酵液是解決現(xiàn)階段致病桿菌屬細菌應(yīng)用問題的一個可行辦法。通過發(fā)酵工藝優(yōu)化可以提高發(fā)酵液的抑菌活性，高活性的發(fā)酵液可以直接應(yīng)用到生產(chǎn)實際中。此外，采用一些工藝進行濃縮，提高發(fā)酵液中有效成分的含量并將其配成制劑也能夠解決嗜線蟲致病桿菌的應(yīng)用難題。目前，嗜線蟲致病桿菌中的高活性化合物Xcn1 是此類細菌代謝物作為農(nóng)用制劑開發(fā)的熱點。石延霞等[97]通過盆栽和小區(qū)藥效試驗發(fā)現(xiàn)，0.25%的Xcn1 水劑對黃瓜白粉病防效明顯，其40 倍液施用7 d 后防效可達98.30%。高江濤[19]研制的1.2% Xcn1 水劑對油菜菌核病具有較好的防治效果。本課題組通過對發(fā)酵液進行除糖、濃縮等預(yù)處理以提高母液中Xcn1 的含量，配制了一系列制劑，在防治蘋果輪紋病、蘋果腐爛病和獼猴桃潰瘍病的離體枝條試驗中顯示出了良好的效果，且在防治獼猴桃潰瘍病的田間藥效試驗中取得了顯著的效果 (未發(fā)表)。

總之，啟動子激活的方法已成功用于Xcn1 的生產(chǎn)，為獲得高純度或高含量的Xcn1 產(chǎn)品提供了一條可行的道路。Incedayi 等[7]使用阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子激活Xcn1 的生物合成基因簇，獲得了含有高純度Xcn1 的發(fā)酵液。同時，酶工程學(xué)方法也可用于生產(chǎn)較高純度的特定化合物，在非核糖體肽合成過程中，對XUC 結(jié)構(gòu)域進行重新編程可用于生產(chǎn)副產(chǎn)物較少的特定化合物，以簡化特定化合物的純化步驟[84]。

6 結(jié)語與展望

發(fā)現(xiàn)具有活性的菌株及化合物是致病桿菌屬抑菌活性研究的重要基礎(chǔ)。本文列舉了其中可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的代表性菌株，較為全面地總結(jié)了近幾十年來在致病桿菌屬細菌代謝物中發(fā)現(xiàn)的抑菌活性化合物，并對其中部分抑菌活性化合物的抑菌作用機理進行了討論，認為影響蛋白質(zhì)合成是多數(shù)化合物發(fā)揮抑菌作用的重要途徑。同時，基于抑菌活性化合物的生物合成途徑及相關(guān)調(diào)控因子，總結(jié)了從致病桿菌屬細菌代謝物中發(fā)掘新化合物和提高活性化合物產(chǎn)量的方法，以期為致病桿菌屬細菌活性代謝物的科學(xué)合理應(yīng)用提供參考。此外，本文還介紹了幾種來自于嗜線蟲致病桿菌主要抑菌活性化合物Xcn1的制劑。

在國家 “化肥農(nóng)藥減量增效” 等相關(guān)政策的引導(dǎo)下，生物農(nóng)藥將擁有更廣闊的應(yīng)用前景，致病桿菌抑菌活性代謝物的研究應(yīng)用也有望得到進一步發(fā)展。筆者認為，未來致病桿菌屬細菌抑菌活性代謝物的研究將在以下5 個方向有所突破：1) 以提高特定代謝物產(chǎn)量為目標(biāo)的遺傳操控研究；2) 以治理抗藥性為目標(biāo)的作用機理研究；3) 以發(fā)現(xiàn)新化合物為目標(biāo)的天然產(chǎn)物分離研究；4) 以直接利用為目標(biāo)的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)研究；5) 以拓寬其應(yīng)用范圍為目標(biāo)的新活性篩選研究。

以提高高活性化合物產(chǎn)量為目標(biāo)的研究應(yīng)是當(dāng)下的重要研究方向，不僅可以研究多種調(diào)控因子對活性化合物的調(diào)節(jié)，深入探討各種調(diào)控因子發(fā)揮作用的分子機理，還可以對特定生物合成基因簇中的關(guān)鍵酶進行改造。目前德國法蘭克福歌德大學(xué)的Bode 課題組在該領(lǐng)域研究較為深入，他們解析了Xcn1[67]、NEP[74]和Xenortides[44]等化合物的生物合成過程，發(fā)現(xiàn)了一些新型調(diào)控因子[66]，并通過引入誘導(dǎo)型啟動子激活特定的生物合成基因簇，提高了特定化合物的產(chǎn)量[83]。以俄羅斯和美國研究者為代表進行的作用機理研究，揭示了一些細菌代謝物類抗生素抑制蛋白質(zhì)合成的分子機理[52,63]。相信隨著冷凍電鏡技術(shù)的普及，抗生素發(fā)揮抑菌活性的分子機理將得到更為清晰明確的闡述。

隨著致病桿菌屬細菌代謝物中的活性化合物不斷被發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵液中尋找新型化合物的難度越來越大。微生物共培養(yǎng)和分子水平的遺傳操控為發(fā)掘新化合物提供了新思路。同時，探索抑菌化合物的其他生物活性將是一個可行的方向，且目前已取得一定的進展。以Xcn1 為例，最早發(fā)現(xiàn)它是因為其優(yōu)異的抑菌活性[4]，近年的研究又發(fā)現(xiàn)了其顯著的殺螨活性。Incedayi等[7]發(fā)現(xiàn)，用藥48 h 后，Xcn1 對二斑葉螨Tetranychus urticae的LC50值為60 μg/mL，但其田間試驗效果還有待評價。Xenorxide 1 和Xenorxide 2 兩種化合物已被發(fā)現(xiàn)可用于食品防腐和醫(yī)藥開發(fā)，進一步提高了致病桿菌的應(yīng)用價值。目前針對致病桿菌相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)仍集中于單一活性化合物為主體的研究，倘若能夠集中更多的有效成分聯(lián)合進行產(chǎn)品開發(fā)，將多種活性成分協(xié)同作用，有望延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長相關(guān)制劑的使用周期。