種牛精液冷凍和保存效果研究進(jìn)展

王卿妍， 彭 巍， 李欣淼， 趙楊楊， 田全召， 劉 賢， 楊其恩， 張 君， 雷初朝， 黃永震*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海大學(xué)，西寧 810016；3.河南省鼎元種牛育種有限公司，鄭州 450000；4.河南省畜牧總站，鄭州 450008)

牛精液的冷凍保存技術(shù)于20世紀(jì)50年代研究成功，我國(guó)于1972年底對(duì)該技術(shù)進(jìn)行研究和推廣，80年代從國(guó)外引進(jìn)了冷凍精液的設(shè)備和技術(shù)，90年代逐漸從顆粒型轉(zhuǎn)向細(xì)管型，距今已有半個(gè)世紀(jì)的歷史。自該技術(shù)研制至今對(duì)于畜牧業(yè)的發(fā)展有著舉足輕重的作用，近現(xiàn)代隨著科技的發(fā)展和人類對(duì)于基因水平研究的進(jìn)步，加上該技術(shù)可以長(zhǎng)期保存，使用時(shí)不受時(shí)間、地域以及雄性動(dòng)物年齡等方面的限制，人工授精成為了育種工作中最主要的繁殖方式，該技術(shù)也成為畜牧養(yǎng)殖方面的重要技術(shù)。

眾所周知，優(yōu)良的種牛精液品質(zhì)是種牛改良的關(guān)鍵。有試驗(yàn)表明，遺傳、氣候環(huán)境、飼養(yǎng)管理等因素都會(huì)影響牛的精液品質(zhì)[1]。種牛是否進(jìn)行強(qiáng)制運(yùn)動(dòng)也能決定種牛精液品質(zhì)的優(yōu)劣[2]。合理的精液冷凍與保存不僅能發(fā)揮優(yōu)良的精液品質(zhì)，同時(shí)也為人工授精技術(shù)的發(fā)展提供保障。近幾年，隨著國(guó)外牛冷凍精液生產(chǎn)先進(jìn)設(shè)備的引進(jìn)，生產(chǎn)工藝也取得了很大的進(jìn)步，牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)展迅速。但是，在凍精生產(chǎn)中仍存在一些問題，主要表現(xiàn)在，部分種公牛的冷凍精液頂體完整率低、畸形率高、死精多等，無法達(dá)到國(guó)家規(guī)定的牛冷凍精液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，廢棄率高[3]。

牛的冷凍精液一般是以液氮作為冷凍源保存在液氮儲(chǔ)罐內(nèi)進(jìn)行保存和運(yùn)輸?shù)?，?jīng)過低溫保存可以大大提高牛精液的保存時(shí)間，可以有效擴(kuò)大良種精子的使用范圍，近年來國(guó)內(nèi)外技術(shù)發(fā)展迅速，生產(chǎn)工藝也有很大改進(jìn)，牛精液冷凍技術(shù)也取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但也存在著許多的問題，受過程和多種因素的影響，我國(guó)牛冷凍精液達(dá)標(biāo)率不高，本文通過對(duì)牛精液冷凍保存添加劑進(jìn)行對(duì)比，旨在對(duì)今后種牛精液冷凍和保存技術(shù)發(fā)展提供參考。

1 牛精液冷凍損傷與冷凍保護(hù)劑

1.1 牛精液冷凍損傷

精子的冷凍保存過程極其復(fù)雜，需要經(jīng)過取樣、稀釋、降溫、冷凍等一系列操作后才能供生產(chǎn)應(yīng)用。精子與體內(nèi)其他細(xì)胞相比有較大差異，精子的耐凍能力更強(qiáng)、膜流動(dòng)性高、水分含量低，但精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)代謝也會(huì)在冷凍過程中發(fā)生改變，使精子產(chǎn)生冷凍損傷[4]。冷凍過程中，精子會(huì)因胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、胞內(nèi)形成冰晶、滲透壓升高等原因使精子的生理狀態(tài)發(fā)生改變。如過量氧自由基等功能性紊亂、胞質(zhì)不穩(wěn)定、膜的相變、細(xì)胞酸化毒性、離子失衡、蛋白酶失活或激活等問題，從而造成精子氧化應(yīng)激、線粒體完整性、質(zhì)膜完整性頂體完整性、以及遺傳物質(zhì)等形態(tài)及功能損傷[5]。

1.2 牛精液冷凍保護(hù)劑

近年來，我國(guó)通常采取將精液置于-196 ℃的液氮中的方式進(jìn)行精液的冷凍保存。低溫保存精液可以使精子細(xì)胞內(nèi)新陳代謝降低，從而實(shí)現(xiàn)精液的長(zhǎng)期保存。但是，由于超低溫冷凍會(huì)使精子在稀釋液中的存活率與受精能力降低。因此，在精液冷凍時(shí)，需要在稀釋液中有選擇性地添加一些冷凍保護(hù)劑來保護(hù)精子。通常會(huì)在冷凍稀釋液中添加抗生素，如鏈霉素和青霉素等；加入鹽維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如檸檬酸和檸檬酸鈉等；緩沖液如Tris堿等；與此同時(shí)還會(huì)添加一種或多種糖，如海藻糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、葡萄糖等，最后加入冷凍保護(hù)劑從而提高凍融后精子的存活率[6]。冷凍保護(hù)劑分為滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑，滲透性冷凍保護(hù)劑有DMSO、乙二醇和甘油等，非滲透性保護(hù)劑有牛奶和卵黃等。冷凍保護(hù)劑的添加量可以改變精液冷凍稀釋液的滲透壓。針對(duì)同一物種不同個(gè)體或不同物種的凍精進(jìn)行研究，可以劃分冷凍保護(hù)劑的濃度梯度，將冷凍保護(hù)劑濃度梯度設(shè)置在精子能承受的范圍之內(nèi)，與此同時(shí)還要使精子在稀釋液中維持滲透壓穩(wěn)定，這樣才能較大程度提高精子在稀釋液中和凍融后的存活率[7]。

2 牛精液稀釋液冷凍保存添加劑

稀釋液不僅具有增加輸精母畜頭數(shù)和擴(kuò)大精液容積作用，還具備提高精子存活率、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、防止低溫冷凍、供給精子能量等作用，對(duì)精液的冷凍效果有著決定性的影響[8]。在稀釋液中添加一些特殊物質(zhì)并選擇最適合的牛冷凍精液稀釋液配方，可以為增加凍精生產(chǎn)量、提高凍精生產(chǎn)水平和產(chǎn)品質(zhì)量及加速牛群遺傳改良進(jìn)展提供參考。

2.1 滲透性冷凍保護(hù)劑

滲透性冷凍保護(hù)劑可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，一般為小分子量物質(zhì)。適當(dāng)?shù)靥砑涌梢员Ｗo(hù)細(xì)胞不受外界環(huán)境的傷害，但若使用過量則會(huì)產(chǎn)生毒性從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或?qū)е录?xì)胞死亡。常見的滲透性冷凍保護(hù)劑有維生素類和糖類。

2.1.1 甘 油 甘油是精子超低溫冷凍過程中最常用的抗凍保護(hù)劑，且其濃度大小直接影響到精子的凍后活力[9]。除了甘油濃度，甘油稀釋劑的加入方法也會(huì)影響凍融精子品質(zhì)。金穗華等[10]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘油的二次加入法比一次加入法對(duì)精液的保存效果更好。一次加入法會(huì)使精子內(nèi)滲透壓突然變化從而導(dǎo)致精子頂體受到損傷。而二次加入法則采用先加無傷害的基礎(chǔ)液，在精子半休眠狀態(tài)下緩緩加入甘油的辦法，減少了高滲的稀釋打擊。二次加入法不僅可以減少精液在稀釋、平衡及冷凍過程中對(duì)精液的損傷，還可以使不同稀釋倍數(shù)的精液最終甘油濃度一致，最終達(dá)到保護(hù)精子的目的。

2.1.2 維生素類 維生素E作為一種主要的抗氧化劑之一，具有極易被氧化和不易被酸、堿或熱破壞的性質(zhì)。陳曉英等人研究表明：在4 ℃條件下保存48 h的娟珊牛精液稀釋液中添加維生素E可以有效提高保存過程中精子的活力和頂體完整率。更重要的是，維生素E還可以保護(hù)精液中CAT酶的活性和GR酶的活性，從而保證精子的品質(zhì)[11-12]。

有報(bào)道稱，VB12可以提高精子活力和受胎率。李玉凡[13]從在牛精液稀釋劑中添加VB12并測(cè)定解凍后精子各項(xiàng)生理指標(biāo)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在牛的精子凍存液中加入VB12可以提高精子凍融后頂體的完整率和精子活力。VB12不僅降低了精子GOT活性和畸形率還延長(zhǎng)了精子的存活時(shí)間，對(duì)凍融精子有保護(hù)和減少結(jié)構(gòu)損傷的作用。

2.2 非滲透性冷凍保護(hù)劑

非滲透性冷凍保護(hù)劑多為一些不可穿過細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)。這些大分子物質(zhì)可以通過提高細(xì)胞外液滲透壓使細(xì)胞脫水，進(jìn)而減少精子冷凍過程中冰晶的產(chǎn)生減少精子損傷。

2.2.1 卵 黃 卵黃作為最經(jīng)濟(jì)最廣泛的一種牛細(xì)管凍精稀釋保護(hù)劑在精液保存領(lǐng)域占有重要地位。一般情況下，將卵黃、檸檬酸鈉、糖類、抗菌素、抗凍劑按比例混合，制作精液稀釋保護(hù)劑。卵黃不僅可以防止冷刺激，低溫下保護(hù)精子、延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間還可以擴(kuò)大稀釋倍數(shù)。但同時(shí)也要注意：卵黃在有氧條件下會(huì)因經(jīng)氨基酸經(jīng)酶的作用產(chǎn)生過氧化氫危害精子，所以還要在稀釋液中添加適量的過氧化氫酶來減少對(duì)精子損傷[14]。

2.2.2 糖 類 海藻糖作為一種雙糖，具有防止細(xì)胞凋亡、抗衰老和氧化性強(qiáng)的特性，且其抗寒能力極強(qiáng)。在精子被冷凍時(shí)，海藻糖可以束縛住水分子，保持細(xì)胞濕潤(rùn)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。不僅如此，海藻糖還可以保護(hù)精子在低溫條件下因失水導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷和精子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失。在其充當(dāng)冷凍保護(hù)劑的同時(shí)還能為精子提供營(yíng)養(yǎng)，結(jié)合甘油使用效果更加顯著。劉維平等人[15]通過向冷凍精液中添加不同濃度海藻糖的對(duì)比試驗(yàn)得出結(jié)論：海藻糖不僅可以提高精子活率，還可以提高質(zhì)膜完整率和頂體完整率。但是海藻糖濃度過高也會(huì)使?jié)B透壓升高，對(duì)精子產(chǎn)生不利影響。

香菇多糖作為一類從香菇中提取的活性成分，具有抗氧化、免疫增強(qiáng)以及清除ROS的功能。香菇多糖的抗氧化能力一般與其含量成正比,但過高濃度的香菇多糖會(huì)抑制凍融后精子活力。陳帥等人[16]觀察到，在牛精液稀釋冷凍液中添加適量的香菇多糖可以減少蛋白質(zhì)的冷凍應(yīng)激并維持精子內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這就是為什么香菇多糖可以提高牛精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率、動(dòng)力學(xué)參數(shù)和精子活率，從而有效提高凍融牛精子質(zhì)量。

紅景天多糖是一種由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖所組成的多糖類物質(zhì)[17]。紅景天多糖不僅具有抗衰老和防止細(xì)胞凋亡的特性還有極強(qiáng)的抗氧化性和抗寒性。向南斌等人[18]經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：向牛冷凍稀釋液中添加紅景天多糖可以提高精子運(yùn)動(dòng)的各項(xiàng)參數(shù)以及質(zhì)膜和頂體的完整率，且紅景天多糖只有和甘油共同使用時(shí)才能協(xié)同作用保護(hù)低溫條件下的精子[19-20]。

黃芪多糖是一種具有抗氧化和抗應(yīng)激作用的水溶性多糖。因?yàn)辄S芪多糖可以提高黃酮類的穩(wěn)定性和溶解度，所以可以和一類具有強(qiáng)抗氧化性并且可以抗炎抗病毒的黃酮類化合物芹菜素協(xié)同作用于牛精液冷凍稀釋液。王洪濤[21]經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：如果向牛精液冷凍稀釋液中單獨(dú)添加黃芪多糖或芹菜素，精液的超氧化物歧化酶、精子過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平會(huì)得到改善，從而顯著提高解凍后的精液質(zhì)量。但若單獨(dú)添加芹菜素，效果就沒有前者顯著。且黃芪多糖可以通過提高精子的總運(yùn)動(dòng)力、曲線距離、曲線速度、直線速度、平均路徑速度、直線距離、平均路徑距離等運(yùn)動(dòng)特征，多方面改變精子的運(yùn)動(dòng)性能。

2.2.3 蛋白質(zhì)類 PTD-FNK蛋白可以減少不利因素對(duì)細(xì)胞的影響。PTD-FNK蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)部抑制精子凋亡過程的激活從而發(fā)揮抗凋亡作用，并且其對(duì)牛精子凍融損傷造成的多種損傷刺激有明顯的防御作用。劉蛟等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，向水牛精液稀釋冷凍液中添加PTD-FNK蛋白不僅可以直接改善精液中精子質(zhì)膜完整率及精子活力和活率，還有利于精卵結(jié)合及受精的完成。

精漿肝素結(jié)合蛋白是一種由副腺體分泌產(chǎn)生到精液中的蛋白質(zhì)，其在射精時(shí)與精子結(jié)合，結(jié)合后不僅可以促進(jìn)精子的獲能和頂體反應(yīng)還能改變免疫系統(tǒng)對(duì)精子的排斥反應(yīng)。Patel等[23]研究發(fā)現(xiàn)，用20 μg/mL的精漿肝素結(jié)合蛋白處理精液后，純精液的平均活力和質(zhì)膜完整率都顯著提高，精子的平均數(shù)量也有所增加。不僅如此，用肝素結(jié)合蛋白處理后的未解凍精液的體外獲能和頂體反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也能得到提高，這是因?yàn)榫珴{肝素結(jié)合蛋白與精子結(jié)合不僅可降低頂體的損傷還可預(yù)防脂質(zhì)的過度氧化。

2.2.4 多酚類化合物 白藜蘆醇是一種抗氧化活性高于維生素C和維生素E，且毒性遠(yuǎn)小于兩者的活性物質(zhì)，可以保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化損傷。劉程等人[24]在牛精液稀釋冷凍液中添加不同量的白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)且其對(duì)精子的作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)添加量達(dá)到150 μmol/L時(shí)，精子的抗氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶活力最強(qiáng)且脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的丙二醛含量降低。因此，在稀釋精液中添加適量白藜蘆醇可有效提高牛精子的抗氧化性，有利于精子的長(zhǎng)期保存。

原花青素是一種天然多酚化合物且有抗癌抗氧化的功效。竹葉黃酮取于天然竹葉，與其有相同功效。不僅如此，竹葉黃酮還有提高機(jī)體免疫力的作用。魯平[25]研究表明，當(dāng)在牛冷凍稀釋精液中單獨(dú)添加低聚原花青素或竹葉黃酮后，凍融后精液質(zhì)量會(huì)被明顯改善。但若組合地添加兩者可以再一步提高精液中抗氧化酶活性、質(zhì)膜頂體完整率、運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)和精子活力并顯著降低精子中的活性氧和丙二醛水平，從而達(dá)到顯著的精液冷凍保存效果。

2.3 其它類冷凍保護(hù)劑

咖啡堿是一種可以提高動(dòng)物精子活力、啟動(dòng)動(dòng)力不足精子的生物堿化合物?？Х葔A不僅可以抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的作用還可以通過抑制腺苷酸酶的分解來影響細(xì)胞內(nèi)腺苷酸的水平，從而起到挺高精子活力的作用。雖然其作用效果與濃度成正比，但濃度過高的咖啡堿反而會(huì)抑制精子活力[26]。

丙酮酸鹽在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝上有很重要的作用，也是細(xì)胞的能源物質(zhì)。與此同時(shí)還有抗病毒、抗菌和抗氧化等作用。胡傳活等人[27]對(duì)丙酮酸鹽在精液保存中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在常用的牛細(xì)管凍精稀釋保護(hù)劑由卵黃、檸檬酸鈉、糖類、抗菌素、抗凍劑組成的牛細(xì)管凍精稀釋液中加入丙酮酸鈣、丙酮酸鈉或丙酮酸鉀等丙酮酸鹽類均可提高精子的復(fù)蘇率和凍融后活力，從而達(dá)到保護(hù)凍融精子的作用。

3 牛冷凍精在人工受精中的應(yīng)用

3.1 冷凍精液解凍后活力

標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定解凍后活力≥30%(直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)所占的百分比)。在常規(guī)冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)中原精液的精子在稀釋、冷凍、解凍過程中可能損失50%左右，因此為了保證冷凍、解凍后的活力達(dá)到30%原精液的活力需要達(dá)到60%以上[28]。

3.2 冷凍精液精子頂體完整率

頂體的透明質(zhì)酸酶位于細(xì)胞質(zhì)膜上，具有水解透明質(zhì)酸的作用能促使精子順利穿透卵子的卵丘到達(dá)冠狀放射團(tuán)，當(dāng)頂體受到破壞時(shí)該酶釋放到精清中使精子失去受精能力。有實(shí)驗(yàn)證明牛精子在冷凍過程中技術(shù)不當(dāng)可導(dǎo)致透明質(zhì)酸酶活力降低使其受精率相應(yīng)降低。

3.3 冷凍精液精子畸形率

精子的畸形有以下的幾個(gè)方面：頭部缺陷，比如大頭、小頭、錐形頭、梨形頭、圓頭、無定形頭、有空泡的頭、頂體過小的頭、雙頭以及上述缺陷的任何組合；頸部和中段的缺陷，比如頸部彎曲、中段非對(duì)稱性接在頭部，還有粗或不規(guī)則的中斷，異常細(xì)的中段和上述缺陷的任何組合；尾部缺陷，比如短尾、多尾、發(fā)卡形尾、尾部斷裂、尾部彎曲、尾部寬度不規(guī)則、尾部彎曲或上述缺陷的任何組合。

當(dāng)畸形精子所占的比例大時(shí)就可能影響受精率，畸形精子比例越高受精率越低，甚至可造成遺傳障，因此這樣的精子是不能參與受精的礙。牛精子在一般情況下畸形率不應(yīng)超過10%，若超過15%以上時(shí)受精率下降，50%以上時(shí)受精率急劇下降[29-30]。

4 牛精液冷凍保存的發(fā)展前景

牛精液的冷凍保存技術(shù)目前還在發(fā)展中，提高凍融后精子存活率和質(zhì)膜與頂體膜的完整性是我們的目標(biāo)。牛精液的冷凍和保存是推動(dòng)聯(lián)合育種、加速中國(guó)育牛產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型的重要步驟， 與此同時(shí)也對(duì)提高種公牛利用率、保存優(yōu)質(zhì)遺傳資源、防止疾病傳播等有著重要意義。為保護(hù)我國(guó)優(yōu)良種牛資源，加快養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展，我們未來對(duì)牛精液冷凍保存方面的研究應(yīng)從這幾個(gè)方面展開：一是開發(fā)更加高效的精液稀釋液，提高精液保存質(zhì)量，延長(zhǎng)精液保存時(shí)間；二是完善牛精液冷凍保存體系并研發(fā)智能高效的冷凍保存設(shè)備；三是探索發(fā)現(xiàn)其他高效冷凍保存添加劑。