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    靶向溶酶體新型次氯酸熒光探針的合成及性能

    2022-04-08 02:27:08杜宇婷王宏亮趙三虎王桂林
    化工管理 2022年8期
    關(guān)鍵詞:次氯酸溶酶體次氯酸鈉

    杜宇婷,王宏亮,趙三虎,王桂林

    (忻州師范學(xué)院 化學(xué)系,山西 忻州 034000)

    0 引言

    次氯酸(HClO),過(guò)氧化氫(H2O2),羥基自由基(HO·)和超氧陰離子自由基被稱為活性氧(ROS),它們能夠引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激,與許多生理和病理過(guò)程相關(guān)[1-4]。其中,HClO吸引了很多人的關(guān)注,是因?yàn)樗@示出關(guān)鍵的抗菌特性[5],以及它在生物、化學(xué)、環(huán)境及人體免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用[6-7]。在生物體內(nèi),內(nèi)源性的HClO是由過(guò)氧化氫和氯離子在髓過(guò)氧化物酶(MPO)的催化作用下產(chǎn)生[8],HClO的產(chǎn)生在生物體內(nèi)是一把雙刃劍。好的一方面,次氯酸能夠保護(hù)生物體通過(guò)殺死入侵免疫系統(tǒng)中的病原體和細(xì)菌[9]。但是,另一方面,越來(lái)越多的證據(jù)表明,過(guò)量的HClO可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物分子被氧化,從而導(dǎo)致組織損傷、炎癥以及一系列疾病,比如炎癥甚至癌癥[10-13]。溶酶體pH值是維持溶酶體正常消化功能的參數(shù),不同原因?qū)е碌娜苊阁wpH值改變可能會(huì)影響溶酶體蛋白酶的多種生理過(guò)程,進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能。因此,基于以上原因,發(fā)展一種高選擇性和高靈敏性,用于溶酶體中次氯酸檢測(cè)方法具有重要意義。

    在過(guò)去的幾十年里,傳統(tǒng)的HClO檢測(cè)手段比如化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)分析、比色法和質(zhì)譜法等[14-15],但是其存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、檢測(cè)限低等局限性。由于HClO在人體生理中發(fā)揮著重要作用,因此需要設(shè)計(jì)新的方法來(lái)精確的測(cè)定體內(nèi)次氯酸根的含量。與這些傳統(tǒng)的分析方法相比,熒光檢測(cè)技術(shù)因其易于操作、響應(yīng)快速和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中[16-17]。近幾年報(bào)道有關(guān)次氯酸的反應(yīng)型熒光探針[18-19],主要是基于次氯酸的強(qiáng)氧化性,比如對(duì)席夫堿、不飽和碳碳雙鍵、硫化物、硫縮酮和對(duì)甲氧基苯酚的氧化等[20-24]。

    2008年,陳課題組報(bào)道了利用次氯酸的氧化性,將二苯甲酰肼氧化成羅丹明的二苯甲酰二亞胺[25]。2014年,Goswami 等發(fā)現(xiàn)了羅丹明類(lèi)似物可以用于次氯酸的比率型檢測(cè)[26]。2015年,Lee 等報(bào)道了一個(gè)基于羅丹明和丹磺基部分被次氯酸氧化的熒光探針[27]。2020年,詹和他的同事發(fā)現(xiàn)了一個(gè)羅丹明螺旋環(huán)的一個(gè)次氯酸的檢測(cè)方法[28]。次氯酸對(duì)氟硼類(lèi)衍生物的氧化也可以用于它的檢測(cè)[29-30]。

    眾所周知,次氯酸可以把“C=C”和“C=N”氧化斷鍵[16,31]。因此,本文設(shè)計(jì)并合成了一種以3-(溴甲基)苯甲醛為原料,嗎啉作為溶酶體的靶向基團(tuán),分兩步合成了一種檢測(cè)溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)探針BMOA 對(duì)次氯酸檢測(cè)時(shí)具有超快的反應(yīng)時(shí)間(150 s),高的靈敏度和選擇性。探針對(duì)次氯酸的最低檢出限僅為4.13 nmol/L和的特點(diǎn)。因此,本研究為次氯酸的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單且有效的分析方法。高分辨質(zhì)譜機(jī)理驗(yàn)證表明,熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發(fā)生斷裂,釋放出MOB,從而使得熒光發(fā)生淬滅。

    圖1 探針BMOA 對(duì)次氯酸的識(shí)別機(jī)理

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    3-(溴甲基)苯甲醛、N-Boc-1,4-苯二胺、嗎啉購(gòu)自安耐吉化學(xué)劑有限公司;無(wú)水乙醇(分析純)、乙酸乙酯 (分析純)、石油醚 (分析純)、二氯甲烷 (分析純)購(gòu)自天津歐博凱化工有限公司購(gòu)進(jìn);N,N-二甲基甲酰胺從天津市北辰方正試劑廠購(gòu)進(jìn);三氯甲烷從成都市科隆化學(xué)品有限公司購(gòu)進(jìn)。200~300目柱層析硅膠(青島海洋化工公司)。所用試劑均為分析純,所用去離子水 (≥18 MΩ·cm) 由 Milli-Q 純化系統(tǒng)制備。

    SHZ-D(Ⅲ)予華牌循環(huán)水真空泵;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;GKDL-20小型冷卻水循環(huán)裝置;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);ZF7三用紫外分析儀(上海予名儀器設(shè)備有限公司);UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);Bruker AVANCE-600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國(guó));賽默飛高分辨質(zhì)譜儀;FS5熒光光譜儀(英國(guó))。

    1.2 探針BMOA的合成

    探針?lè)肿?BMOA 的有機(jī)合成參考文獻(xiàn)[32]。首先化合物MOB的合成,取原料3-(溴甲基)苯甲醛1.0 g(5 mmol)、嗎啉環(huán)0.52 g(6 mmol)和碳酸鉀1.54 g(10 mmol)溶解于適量的溶劑DMF,在70 ℃加熱條件下反應(yīng),溶液由無(wú)色透明變?yōu)辄S色,TCL監(jiān)測(cè),8 h后反應(yīng)結(jié)束。加入40 mL蒸餾水淬滅,用乙酸乙酯萃取三次,減壓蒸餾得到黃色油狀物(溶劑DMF因沸點(diǎn)高無(wú)法旋出),柱層析乙酸乙酯作為洗脫劑,得到黃色晶狀固體1.06 g(5 mmol)產(chǎn)率96.96%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18, 10.02, 8.25, 7.85, 7.85,7.83, 7.83, 7.82, 7.81, 7.81, 7.80, 7.69, 7.67, 7.67,7.65, 7.65, 7.59, 7.57, 7.56, 7.12, 4.37, 3.60, 3.58,3.57, 3.56, 3.42, 2.42。探針BMOA的合成,取MOB 11.0 g(4 mmol)與N-Boc-1,4-苯二胺1.05 g (5 mmol)溶解于三氯甲烷中,加入催化量的哌啶,在70 ℃回流,TCL監(jiān)測(cè),12 h后反應(yīng)結(jié)束。加入40 mL水淬滅,CH2Cl2萃取,減壓蒸餾得到黑棕色油狀物,柱層析(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1)分離,最終得到探針BMOA黃色粉末0.21 g (0.5 mmol),產(chǎn)率為56.6%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6), δ 9.43 (s, 1H), 8.63 (s, 1H),7.87 (s, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.51 (d,J= 8.3 Hz,2H), 7.45 (d,J= 7.4 Hz, 2H), 7.29-7.20 (m, 2H),3.58 (t,J=4.5 Hz, 4H), 3.52(s, 2H), 2.38(d,J=5.1 Hz,4H), 1.49 (s, 9H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6), δ 159.1, 152.8, 147.0, 136.7, 136.4, 132.1, 129.3, 129.2,128.7, 127.8, 121.7, 121.7, 121.6, 119.3, 80.6, 66.9, 63.1,53.7, 53.6, 28.4。HR-MS, C23H29N3O3-,實(shí)測(cè)值 (計(jì)算值),m/z:394.2116[M-H-]-。探針 BMOA 的合成路線見(jiàn)圖2所示。

    圖2 探針BMOA的合成路線

    1.3 熒光探針BMOA的光譜性能測(cè)

    在光譜測(cè)試前,首先用DMSO溶解探針固體,配制母液為10 mmol/L 探針。再用二蒸水配制10 mmol/L PBS 緩 沖 液 (pH=7.4)及 各 待 檢 測(cè) 物 (Cys,ClO-,儲(chǔ)備液(100 mmol/L)。測(cè)試時(shí),用移液槍取BMOA的儲(chǔ)備液,使測(cè)試的探針BMOA 濃度為5 mmol/L(VCH3CN/VPBS=1∶1)。不同濃度的待檢測(cè)物依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按照類(lèi)似的方法取其儲(chǔ)備液進(jìn)行配制。探針與各待檢測(cè)物混合均勻后,室溫振蕩5 min后測(cè)試熒光光譜。所用的激發(fā)波長(zhǎng)為292 nm,激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm/5.0 nm。響應(yīng)時(shí)間的測(cè)定:使用熒光儀測(cè)定探針BMOA與次氯酸鈉(120 mmol/L)反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間。機(jī)理驗(yàn)證的測(cè)定:在去離子水的體系中,加入5 mmol/L的探針BMOA,隨后加入24倍當(dāng)量的次氯酸鈉,反應(yīng)5 min后利用高分辨質(zhì)譜分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 探針?lè)肿覤MOA對(duì)次氯酸鈉的光譜研究

    在CH3CN/PBS 緩沖體系(pH=7.4,VCH3CN/VPBS=1∶1)中,如圖3(a)所示,單獨(dú)探針BMOA的紫外吸收波長(zhǎng)是263 nm和333 nm,當(dāng)向體系中分別加入不同濃度的 NaClO(50,80,120 mmol/L)后,探針原有的紫外吸收波長(zhǎng)消失,在292 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰,說(shuō)明探針確實(shí)與次氯酸根離子發(fā)生反應(yīng),并且有新的物質(zhì)生成。圖3(b)所示,當(dāng)向5 mmol/L的探針溶液中加入0~120 mmol/L的NaClO溶液后,探針BMOA 的熒光發(fā)射強(qiáng)度在544 nm處逐漸減弱,說(shuō)明探針與次氯酸根離子發(fā)生反應(yīng),并且是淬滅型熒光探針。

    圖3 圖2探針BMOA對(duì)次氯酸鈉的紫外和熒光變化

    2.2 探針?lè)肿覤MOA對(duì)次氯酸鈉的滴定實(shí)驗(yàn)和反應(yīng)時(shí)間

    為了測(cè)試不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用,進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn),如圖4所示。隨著次氯酸根離子濃度的增大,F(xiàn)544值在NaClO濃度為0~70 mmol/L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性系數(shù)為0.997。根據(jù)檢出限計(jì)算公式(LOD=3σ/k,σ為白樣品連續(xù)測(cè)定10次的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)[33],得到方法檢出為 4.13 nmol/L。上述結(jié)果說(shuō)明BMOA可以高靈敏、定量檢測(cè)次氯酸。為了探究探針與次氯酸根離子的反應(yīng)時(shí)間,考察了探針BMOA 與次氯酸混合后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。Figure 2B顯示,反應(yīng)體系的發(fā)射波長(zhǎng)在544 nm處快速減弱,150 s后熒光強(qiáng)度基本不再變化。圖4(a)所示為探針BMOA對(duì)NaClO的滴定實(shí)驗(yàn)、(b)所示為探針BMOA的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系圖。

    圖4 不同濃度的次氯酸根與探針BMOA的相互作用隨時(shí)間的變化關(guān)系

    2.3 探針?lè)肿覤MOA對(duì)次氯酸根離子的選擇性和pH值的影響

    在對(duì)探針BMOA光譜性能研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步評(píng)估了探針的選擇性,如圖5所示。加入NaClO響應(yīng)之后,在最大發(fā)射波長(zhǎng)544 nm處,熒光幾乎完全淬滅,但是加入其他分析物熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化。由此證明,探針BMOA對(duì)次氯酸根離子具有較好的選擇性。如圖5(b)所示,沒(méi)有加入次氯酸根離子時(shí),探針的熒光強(qiáng)度在pH=3~10的范圍內(nèi),基本保持穩(wěn)定,說(shuō)明探針BMOA在生理pH環(huán)境下可以應(yīng)用。當(dāng)加入次氯酸根離子后,在pH=5.0~7.5的范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度的變化不明顯,這說(shuō)明該探針在生理?xiàng)l件下能夠檢測(cè)生物樣品中的次氯酸根離子。

    圖5 探針BMOA對(duì)次氯酸根離子的選擇性實(shí)驗(yàn)和pH對(duì)探針BMOA的影響

    2.4 探針?lè)肿覤MOA對(duì)次氯酸檢測(cè)的機(jī)理研究

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證推測(cè)的機(jī)理,即探針BMOA被次氯酸氧化釋放MOB(如圖6a是所示),運(yùn)用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證。在去離子水的體系中,加入5 mmol/L的探針BMOA,隨后加入24倍當(dāng)量的次氯酸鈉,反應(yīng)之后利用高分辨質(zhì)譜分析。如圖6b所示,檢測(cè)到了MOB的峰(m/z 206.95),即探針被次氯酸氧化斷裂,釋放出MOB。這為探針BMOA按上述機(jī)理進(jìn)行反應(yīng)提供了有力的依據(jù)。

    圖6 探針BMOA對(duì)次氯酸根離子的識(shí)別機(jī)理和與次氯酸鈉反應(yīng)后的高分辨質(zhì)譜

    3 結(jié)語(yǔ)

    本文通過(guò)利用3-(溴甲基)苯甲醛為原料,嗎啉作為溶酶體靶向基團(tuán),設(shè)計(jì)合成了一種可以檢測(cè)溶酶體中次氯酸的熒光探針BMOA。該探針BMOA可以快速靈敏、選擇性地識(shí)別次氯酸根離子,并且其熒光信號(hào)在0~70 mmol/L次氯酸濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其檢測(cè)限僅為4.13 nmol/L。同時(shí),探針BMOA對(duì)次氯酸根離子的響應(yīng)時(shí)間僅為150 s。利用高分辨質(zhì)譜深入探討了該熒光探針的響應(yīng)機(jī)理即熒光探針BMOA的“C=N”被次氯酸氧化而發(fā)生斷裂,從而使得熒光發(fā)生淬滅。

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