瑤藥苦賴咪總醌提取物的制備及其抗肝癌活性研究▲

蒙 永 龍奕霄 蔣 霞

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021，電子郵箱：mengyong54321@163.com；2 廣西梧州紅十字會(huì)醫(yī)院藥學(xué)部，梧州市 543002；3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧市 530021)

瑤藥苦賴咪為蓼科植物羊蹄的根、葉，別名土大黃、水大黃、牛舌菜，盛產(chǎn)于廣西的龍勝、賀州、玉林、博白、金秀等市縣?，幩幙噘囘湮犊?、性寒，具有清熱解毒、涼血止血、通便、殺蟲止癢的功效，既往多用于治療咽喉腫痛、黃疸型肝炎、內(nèi)臟出血、衄血、便血、淋濁、子宮出血、癰腫疥瘡等病癥[1]。研究表明，該藥材中含有萘醌、蒽醌等成分并具有一定的抗腫瘤活性[2-3]。在參考其他研究有關(guān)中藥羊蹄醌類提取方法[4]的基礎(chǔ)上，本研究采用醇提再酸堿處理及有機(jī)溶劑萃取的方法獲得瑤藥苦賴咪的醌類提取物。此外，在抗腫瘤活性篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)瑤藥苦賴咪的醌類提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞敏感性最強(qiáng)，因此，本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，分析瑤藥苦賴咪的醌類提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 立式鼓風(fēng)干燥箱(無(wú)錫瑪瑞特科技有限公司，型號(hào)：DHG-9070A) ；干燥箱(吳江市永聯(lián)機(jī)械設(shè)備廠，型號(hào)：DHG-9055A)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司， 型號(hào)：UV-8000型)； 生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司，型號(hào)：AC2-4S1)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本松下公司，型號(hào)：MCO-18AIC)；全波長(zhǎng)全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：Multiskan GO)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：CKX53)；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop One)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司，型號(hào)：LightCycler 480Ⅱ)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DB)。

1.2 藥材與試劑 苦賴咪藥材采自廣西來(lái)賓市金秀縣，經(jīng)梧州紅十字會(huì)醫(yī)院梁海雄副主任中藥師鑒定確認(rèn)為茜草科巴戟屬植物蓼科植物羊蹄(RumexjaponicusHoutt.)后使用。大黃素購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110756-201913)。醋酸鎂、乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批號(hào)：8119431)、0.25%胰蛋白酶(批號(hào)：2120734)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所(批號(hào)：KN658)；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Life Technologies(批號(hào)：262312)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(批號(hào)：7E402G0)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號(hào)：7E362L9)均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 細(xì)胞系 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自廣州速研生物科技有限公司，細(xì)胞系通過(guò)細(xì)胞遺傳質(zhì)量鑒定STR基因型檢測(cè)。

1.4 苦賴咪中總醌類成分的提取制備與質(zhì)量控制

1.4.1 提取制備：取苦賴咪藥材8.0 kg粉碎成粗粉，加8倍體積量95%乙醇回流提取3次，2 h/次，濾過(guò)，合并濾液得95%乙醇提取液；藥渣再加8倍體積的50%乙醇回流提取3次，2h/次，濾過(guò)，合并濾液得50%乙醇提取液；合并上述兩種提取液，濃縮至無(wú)醇味，濃縮液加2%氫氧化鈉水溶液調(diào)至pH 8～10，得堿水液。堿水液加氯仿萃取至最后的氯仿萃取液近無(wú)色，得氯仿萃取液，棄去氯仿液，取剩余的堿水液加2%鹽酸調(diào)至pH 4～6，加乙酸乙酯萃取至最后的乙酸乙酯萃取液近無(wú)色，得乙酸乙酯萃取液，濃縮、干燥，得藥材總醌提取物。

1.4.2 質(zhì)量控制：參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，以大黃素為對(duì)照，采用分光光度法對(duì)分離得到的總醌提取物中的醌類成分含量進(jìn)行測(cè)定。(1)配制對(duì)照品溶液。 取大黃素對(duì)照品10.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得到0.42 mg/mL大黃素對(duì)照品溶液。 (2)繪制大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別精密量取大黃素對(duì)照品溶液0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL移至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加1%醋酸鎂-甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，于512 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以大黃素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算得到線性方程。(3)測(cè)定樣品中總醌含量。精密稱取“1.4.1”制備的藥材總醌提取物0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲提取30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)至刻度，搖勻后過(guò)濾，取續(xù)濾液，精密量取續(xù)濾液1.00 mL移至10 mL容量瓶中，加1%醋酸鎂-甲醇溶液至刻度，搖勻，同時(shí)以1%醋酸鎂-甲醇溶液為空白對(duì)照，于512 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中總醌的含量。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將人肝癌HepG2細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(含100單位/mL青-鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于60%～80%濕度、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)后，制備成5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種至96孔板(100 μL/孔)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用DMEM培養(yǎng)基將苦賴咪總醌提取物稀釋為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的濃度(終濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)，按100 μL/孔加入相應(yīng)的細(xì)胞孔中，并設(shè)立對(duì)照組(僅加入DMEM培養(yǎng)基)，同一給藥濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%。換算藥物半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration，IC50)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)后，按500個(gè)/孔接種于6孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。設(shè)立空白對(duì)照組和不同濃度苦賴咪總醌提取物組，苦賴咪總醌提取物組加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋后的苦賴咪總醌提取物(終濃度50 μg/mL、100 μg/mL)，空白對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，按1 mL/孔加入相應(yīng)細(xì)胞孔中，作用24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察克隆形成數(shù)及大小，直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)。磷酸緩沖鹽溶液清洗，多聚甲醛固定15 min后吉姆薩染色30 min，流水沖洗、晾干，顯微鏡下記錄大于50個(gè)細(xì)胞數(shù)的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 分為不同濃度苦賴咪總醌提取物組和空白對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，將密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液加入6孔板(2 mL/孔)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)95%時(shí)，在細(xì)胞表面劃出直線劃痕，磷酸緩沖鹽溶液洗滌除去漂浮細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照并記錄位置?？噘囘淇傰崛∥锝M加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋后的苦賴咪總醌提取物(50 μg/mL、100 μg/mL)，按1 mL/孔加入相應(yīng)細(xì)胞孔中，空白對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在相同位置拍照。用Image J軟件量取劃痕中間的距離，細(xì)胞遷移率=(細(xì)胞遷移前的距離-細(xì)胞遷移后的距離)/細(xì)胞遷移前的距離×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用50 μg/mL、100 μg/mL的苦賴咪總醌提取物進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)結(jié)果顯示50 μg/mL的苦賴咪總醌提取物干預(yù)后目的基因表達(dá)無(wú)明顯差異，故本實(shí)驗(yàn)中只選擇100 μg/mL濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，將密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按2 mL/孔加入6孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組加入經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋為終濃度100 μg/mL的苦賴咪總醌提取物(2 mL/孔)，空白對(duì)照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度及濃度，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟常規(guī)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，加入腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α；NM_000594)和白細(xì)胞介素8(interleukin 8,IL-8；NM_000584)基因引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；NM_001256799)為內(nèi)參，通過(guò)SYBR qPCR 進(jìn)行擴(kuò)增PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系共10 μL，包括cDNA樣本1μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、2×mix 5 μL、無(wú)酶水3.2 μL。PCR反應(yīng)步驟：95℃ 5 min(變性)；95℃ 10 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s(擴(kuò)增)，共40～45個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總醌的測(cè)定結(jié)果 以大黃素濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性方程A=9.9804C+0.0174(R2=0.9991)，可見(jiàn)大黃素濃度在0.016 8～0.025 2 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表2、圖1。 經(jīng)測(cè)定，藥材提取物中總醌的含量為52.31%，見(jiàn)表3。

表2 大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線表

圖1 大黃素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 總醌含量測(cè)定結(jié)果

2.2 苦賴咪總醌提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖作用的影響 隨著干預(yù)濃度的增加，苦賴咪總醌提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用總體呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，25～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)苦賴咪總醌提取物的抑制作用呈濃度依賴性(見(jiàn)表4)，IC50為78.59～85.73(82.16±3.57)μg/mL。 選擇了增殖抑制率與30%、50%相近的藥物終濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即50 μg/mL和100 μg/mL。

表4 不同濃度苦賴咪總醌提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率比較(x±s，%)

2.3 苦賴咪總醌提取物對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成能力和遷移能力的影響 作用HepG2細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，50 μg/mL、100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組細(xì)胞的克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞遷移率降低，且藥物濃度越高，克隆形成數(shù)越少，細(xì)胞遷移率越低(均P<0.05)，見(jiàn)表5、圖2、圖3。

表5 3組HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移率的比較(x±s)

圖2 不同濃度苦賴咪總醌提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞克隆的抑制作用(吉姆薩染色，×5)

圖3 不同濃度苦賴咪總醌提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響(×10)

2.5 苦賴咪總醌提取物對(duì)HepG2細(xì)胞中TNF-α和IL-1基因表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組HepG2細(xì)胞中TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，而IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 兩組HepG2細(xì)胞中TNF-α和IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

根據(jù)醌類化合物的化學(xué)性質(zhì)特點(diǎn)，本研究采用先醇提再酸堿處理及有機(jī)溶劑萃取的方法，獲得瑤藥苦賴咪的總醌提取物，依據(jù)是：(1)本藥材含多種蒽醌、萘醌等化合物，這些化合物分別溶于不同濃度的乙醇中。根據(jù)這一特點(diǎn)，本研究采用了不同濃度乙醇(95%+50%)梯度提取的方法，提取到含有蒽醌、萘醌成分的乙醇粗提取物。(2)萘醌、蒽醌等化合物均具有酚羥基結(jié)構(gòu)，易與氫氧化鈉反應(yīng)轉(zhuǎn)化成鈉鹽，水溶性增強(qiáng)而溶于水。根據(jù)這一特點(diǎn)，本研究將乙醇粗提取物經(jīng)堿化后采用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，這是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑可將水溶性低的非醌類成分萃取分離，醌類成分則保留在堿水溶液中，從而達(dá)到將醌類成分與水溶性低的非醌類成分分離的目的。(3)堿水溶液中的醌類成分遇酸后再轉(zhuǎn)化回原酚羥基結(jié)構(gòu)，水溶性降低。根據(jù)這一性質(zhì)特點(diǎn)，本研究將堿化并經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后余下的堿水溶液進(jìn)行酸化，再采用有機(jī)溶劑萃取，這是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑可將醌類成分萃取分離，水溶性高的非醌類成分則保留在酸水溶液中，從而達(dá)到將醌類成分與水溶性高的非醌類成分分離的目的。采用醇提再酸堿處理及有機(jī)溶劑萃取的方法提取瑤藥苦賴咪的總醌提取物，大黃素對(duì)照品濃度在0.016 8～0.025 2 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，經(jīng)測(cè)定提取物的總醌含量為52.31%，提示該方法操作方便，所得總醌含量穩(wěn)定，可為后續(xù)藥理藥效實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)提供參考。

既往研究表明，天然來(lái)源的萘醌類可影響腫瘤細(xì)胞分裂及增殖，是治療腫瘤惡化的有效途徑[6-7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，朱砂七總蒽醌具有抑制荷瘤小鼠H22肝癌細(xì)胞[8]、S180肉瘤細(xì)胞[9]和人白血病HL-60細(xì)胞[10]的增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，還可降低S180肉瘤小鼠乳酸脫氫酶活性。天然藥物總醌提取物中的萘醌、總蒽醌成分大多具有抗腫瘤作用，萘醌、總蒽醌結(jié)構(gòu)可分為3部分，包括總醌母核、六元不飽和側(cè)鏈及側(cè)鏈羥基部分。部分總醌化合物的母核結(jié)構(gòu)有親電性，能夠與生物體內(nèi)的親核物質(zhì)結(jié)合，誘導(dǎo)活性氧簇的產(chǎn)生，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[6]。而細(xì)胞增殖、遷移、集落形成等一系列行為是惡性腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵[11]，因此天然藥材總醌提取物大多具有抗腫瘤活性。本研究考察了苦賴咪總醌提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明苦賴咪總醌可顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力，且具有一定的濃度依賴性，說(shuō)明苦賴咪總醌提取物具有較好的抗腫瘤活性，為下一步分離純化苦賴咪醌類提取物中抗腫瘤活性物質(zhì)做準(zhǔn)備。

TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子，它可以直接殺死腫瘤細(xì)胞并且對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的毒害作用。IL-8又稱為炎性趨化性因子，其可特異性地趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-8并不局限作用于中性粒細(xì)胞，其在支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，并與多種腫瘤疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。IL-8在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥細(xì)胞中均呈高表達(dá)，原因可能是IL-8具有促進(jìn)腫瘤的血管生成、有絲分裂以及腫瘤細(xì)胞增殖等作用[12]。因此，本研究選擇TNF-α、IL-8這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)一步探討苦賴咪總醌提取物抗肝癌活性的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，100 μg/mL苦賴咪總醌提取物組HepG2細(xì)胞中TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，而IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降(均P<0.05)，由此推測(cè)苦賴咪總醌提取物可能通過(guò)上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)IL-8表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，瑤藥苦賴咪總醌提取物可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力，其或通過(guò)上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)IL-8表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。關(guān)于苦賴咪提取物對(duì)其他腫瘤細(xì)胞增殖及炎癥因子表達(dá)抑制作用所涉及的具體信號(hào)通路，還有待深入研究以探索。