超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定畜禽糞便中34 種抗生素含量

韓巖松，鄭 鋅，黃均明，保萬魁，劉紅芳，劉 蜜，王 旭*

［1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2．島津企業(yè)管理（中國）有限公司北京分公司，北京 100020］

目前，中國是全球最大的抗生素生產(chǎn)國和消費國，同時也是全球細(xì)菌耐藥最嚴(yán)重的國家之一［1］。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)抗生素每年總產(chǎn)量大約為21 萬t，消費量約18 萬t，其中用于畜牧及飼料行業(yè)的抗生素就有60 多種，高達(dá)9.7 萬t，約占消費總量的54%［2-3］。畜禽攝入的抗生素有30%～90%以原藥或代謝產(chǎn)物的形式排出體外，2013 年中國畜禽養(yǎng)殖使用抗生素總量接近10 萬t，估計畜禽排泄的抗生素達(dá)到5 萬多t［4-5］。排泄的抗生素隨著糞便進入農(nóng)田［6］，導(dǎo)致土壤抗生素污染［7］，且土壤中多種抗生素會產(chǎn)生加和、協(xié)同、拮抗等交互作用，對土壤中的植物、動物、微生物產(chǎn)生的復(fù)合污染毒性效應(yīng)，導(dǎo)致土壤中多種抗生素復(fù)合污染［8-11］。在畜禽糞便肥料化利用過程中，抗生素會被不同程度地降解或消減。堆肥化處理技術(shù)通過生物作用和非生物作用實現(xiàn)抗生素的有效降解，是目前畜禽糞便無害化和資源化處理的主要方式，包括好氧堆肥、高溫堆肥及厭氧消化3 種［12-23］。

有研究表明，磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素是畜禽養(yǎng)殖中最為常用的幾類抗生素，這些飼用抗生素若隨排泄物進入農(nóng)田后，可被長期累積，進而對耕地質(zhì)量、農(nóng)產(chǎn)品安全、人類和動物健康等造成很大危害［24-33］。然而，目前我國畜禽糞污中抗生素的檢測標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)薄弱，部分研究只針對四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類含量進行檢測，而對磺胺類、喹諾酮類的測定近乎空白［34-40］?？股氐臋z測方法有微生物法［41-42］、生物傳感法［43-44］、酶聯(lián)免疫法［45-48］、液 相 色 譜 法［49-53］、液 相 色 譜-質(zhì) 譜法［54-59］等。其中，微生物法和生物傳感法操作簡單、檢測效率高、成本低，但特異性差、靈敏度較低；酶聯(lián)免疫法前處理簡單、靈敏度高、分析速度快，但檢測結(jié)果會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；液相色譜法存在分析時間長、檢出限高等缺點；相比之下，液相色譜-質(zhì)譜法（尤其是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）具有選擇性強、靈敏度和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，特別適合基體復(fù)雜、抗生素含量低的樣品分析，現(xiàn)已成為抗生素的主流檢測方法。根據(jù)畜禽糞便樣品基體復(fù)雜等特點，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合測定方法研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

所用試劑和溶液的配制，在未注明規(guī)格和配制方法時，均應(yīng)按HG/T 3696 規(guī)定執(zhí)行。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用水為超純水。

甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。正己烷：色譜純。鹽酸：優(yōu)級純。氫氧化鈉：分析純。

氫氧化鈉溶液：c（NaOH）= 0.01 mol/L。

磷酸氫二鈉溶液：c（Na2HPO4）= 0.2 mol/L。檸檬酸溶液：c（C6H8O7）= 0.1 mol/L。

Mcllvaine 溶液：將磷酸氫二鈉溶液與檸檬酸溶液按體積比5∶8 混合。

Na2EDTA-Mcllvaine 提 取 液：c（Na2EDTAMcllvaine）= 0.1 mol/L。稱取37.2 g 二水乙二胺四乙酸 二 鈉（Na2EDTA·2H2O）于1 L Mcllvaine 溶 液中，用HCl 或NaOH 調(diào)至pH 值為4.0。

甲醇溶液：φ（CH3OH）=15%。甲醇溶液：φ（CH3OH）=65%。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺對甲氧嘧啶（SMD）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM′）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、磺胺二甲基異噁唑（SIZ）、苯甲?；前罚⊿B）、磺胺喹惡啉（SQ）、磺胺醋酰（SAA）、甲氧芐氨嘧啶（TMP）、磺胺苯吡唑（SPA）、金霉素（CTE）、四環(huán)素（TCY）、土霉素（OXY）、強力霉素（DOX）、依諾沙星（ENX）、氧氟沙星（OFX）、諾氟沙星（NOR）、培氟沙星（PEF）、環(huán)丙沙星（CIP）、洛美沙星（LOM）、達(dá)氟沙星（DAN）、恩諾沙星（ENF）、沙拉沙星（SAR）、雙氟沙星（DIF）、司帕沙星（SPX）單標(biāo)儲備液：ρ= 100 mg/L。（購買經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)，有效期2 個月）

34 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：ρ= 1 mg/L。分別吸取單標(biāo)儲備液0.1 至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于-20℃避光保存，有效期為1 周。

1.2 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCMS-8045，日本島津）；冷凍干燥機（德國Christ Beta 2-8 LD plus）；漩渦混合器（艾卡IKA-MS3）；超聲波清洗機（YUYI）；離心機（8000 r/min）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琦BUCHI R-100）；固相萃取裝置；HLB 固相萃取柱：500 mg；電子天平（精度0.0001 g）。

1.3 供試樣品

樣品來源于收集的牛糞、羊糞、豬糞、雞糞以及肥料樣品共若干個（表1）。

表1 供試樣品信息

1.4 樣品前處理

本方法采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次 提 取，超 聲10 min、離 心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 提取畜禽糞便中的抗生素。

1.4.1 試樣的制備

樣品經(jīng)冷凍干燥后，縮分至約100 g，迅速研磨至全部通過0.5 mm 孔徑試驗篩（如樣品潮濕，可通過1.00 mm 試驗篩），混合均勻，置于潔凈、干燥容器中，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 試樣溶液的制備

稱取試樣0.5 ～1 g（精確至0.0001 g）置于50 mL 離心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine 提取液10 mL，渦旋混勻，再加入10 mL 甲醇，渦旋混勻，常溫超聲提取10 min，在4 ℃下8000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至棕色分液漏斗，固體部分重復(fù)提取一次，合并提取液，加入10 mL 正己烷去脂后，下層濾液過0.45 μm 微孔濾膜，將過膜后液體在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（水浴溫度不超過40℃為宜）旋蒸至3 ～5 mL，用于凈化。

HLB 固相萃取柱使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化。將以上提取液以3 ～5 mL/min 流速過柱，用5 mL 的15%甲醇溶液淋洗HLB 固相萃取柱并抽干，用10 mL 的65%甲醇溶液洗脫目標(biāo)抗生素，洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至近干，用流動相定容至1 mL，過0.22 μm 膜，上機待測。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜參考條件

色 譜 柱：Shim-pack GIST，2 μm，（2.1×100）mm，或者相當(dāng)；流動相：由0.1%甲酸溶液（A）與乙腈（B）組成，梯度洗脫程序見表2。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜參考條件

表2 梯度洗脫程序

離子化模式：電噴霧電離（ESI），正離子模式；接口電壓：4500 V；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；加熱氣：空氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL 溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；接口溫度：300℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，MRM 參數(shù)見表3；駐留時間：5 ms；延遲時間：3 ms。對于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

1.6 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取若干份空白試樣，按1.4.2 步驟處理與凈化。然后用該空白試樣溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為10 ～200 μg/L 基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。該系列溶液需臨用現(xiàn)配。按濃度由低到高進樣檢測，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？筛鶕?jù)不同儀器靈敏度或樣品含量調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度。

1.7 試樣溶液的測定

1.7.1 定性

在色譜質(zhì)譜條件下，分別對基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液進行測定，34 種目標(biāo)抗生素質(zhì)譜選擇離子參數(shù)見表3。

表3 34 種抗生素MRM 優(yōu)化參數(shù)表

表3（續(xù)）

在相同實驗條件下進行樣品測定時，如果檢出色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，偏差在2.5%之內(nèi)；并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度相一致，偏差不超過表4 規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在該抗生素。

1.7.2 定量

表4 定性分析時相對離子豐度的最大允許相對偏差

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)、外標(biāo)法定量。34種抗生素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.99。所測樣品中抗生素的響應(yīng)值應(yīng)均在該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。若超出該線性范圍，則需減少試樣量重新實驗或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液做相應(yīng)稀釋后重新測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件的確立

針對樣品前處理條件的優(yōu)化，分別考察了鮮羊糞、鮮牛糞、鮮豬糞、鮮雞糞、處理豬糞及處理雞糞樣品所需提取劑用量及提取次數(shù)、超聲時間及離心時間、固相萃取時液體流速對結(jié)果的影響。

2.1.1 抗生素提取劑用量及提取次數(shù)優(yōu)化

實驗采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各5 mL 分2、3 次提取與各10 mL 分2 次對S1 ～S6空白基質(zhì)樣品進行提取實驗?？瞻谆|(zhì)樣品加標(biāo)量為50 μg/L，每個樣品進行兩次平行測定，處理豬糞結(jié)果見圖1。

圖1 S4 空白基質(zhì)34 種抗生素提取劑用量及提取次數(shù)優(yōu)化試驗

結(jié)果顯示，在S4 空白樣品中，采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次提取是抗生素的最佳提取次數(shù)。對S1、S2、S3、S5、S6空白樣品進行了同條件驗證，驗證結(jié)果與圖1 結(jié)果相吻合。

2.1.2 提取方式的選擇

實驗分別考察了超聲10、15 min，離心5、10 min 2 個時間點，試樣提取液固相萃取流速1、3 及5 mL/min 3 個時間點。各基質(zhì)空白樣品加標(biāo)量為50 μg/L，進行兩次平行測定，S4 空白樣品結(jié)果見圖2、3。

結(jié)果顯示，在S4 空白樣品中34 種抗生素藥物的提取，選擇超聲10 min、離心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 是抗生素提取的最佳條件，同條件也適合S1、S2、S3、S5、S6 空白樣品。

2.2 基質(zhì)匹配回歸方程、線性范圍和檢出限

用各基質(zhì)的空白試樣溶液和全混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成濃度為0.5 ～200 μg/L 基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在所選擇的最佳實驗條件下進行測定，得到回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表5、6。

圖2 S4 空白基質(zhì)34 種抗生素提取方式的選擇

圖3 S4 空白基質(zhì)34 種抗生素提取液固相萃取流速的確立

表5 S1 ～S3 基質(zhì)中34 種抗生素線性范圍及相關(guān)系數(shù)

（續(xù)表）

表6 S4 ～S6 基質(zhì)中34 種抗生素線性范圍及相關(guān)系數(shù)

（續(xù)表）

表5、6 結(jié)果顯示，在液質(zhì)聯(lián)用色譜法中，各基質(zhì)中磺胺類在0.5 ～200 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；在S1 和S2 基質(zhì)中，喹諾酮類及四環(huán)素類在0.5 ～200 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；在S3、S4、S5 及S6 樣品基質(zhì)中，喹諾酮類及四環(huán)素類在1 ～200 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

用各基質(zhì)空白樣品添加34 種混合抗生素濃度為0.2、0.5、1、2、5 μg/L，用上述前處理方法進行樣品處理，依照確定的色譜和質(zhì)譜條件進行分析，進樣5 μL，進樣次數(shù)10 次，用噪音理論確定34 種抗生素的檢出限（3 倍信噪比）和定量限（10 倍信噪比）。本方法6 種基質(zhì)中34 種抗生素檢出限為0.5 ～2.0 μg/kg，定量限為2.0 ～5.0 μg/kg。

2.3 精密度實驗

為考察超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的精密度，對各基質(zhì)進行添加回收實驗，添加量為20、50、100 μg/kg，每個添加量平行測定6 次，連續(xù)重復(fù)測定3 d，考察批內(nèi)和批間重復(fù)性。采用已建立的方法進行測定，各基質(zhì)中34 種抗生素含量見表7。結(jié)果表明各空白基質(zhì)方法批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)均不超過25%。

表7 各基質(zhì)中34 種抗生素含量 （μg/kg）

（續(xù)表）

2.4 準(zhǔn)確度實驗

通過加標(biāo)回收實驗來評價超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確性。在S1 ～S6 基質(zhì)樣品中，加入定量的34 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)兩次平行測定，統(tǒng)計本方法的回收率，基質(zhì)樣品本底值見表7。方法對各基質(zhì)樣品中的34 種抗生素回收率均在64.6%～117.9%之間（表8 ～10）。

2.5 10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液中34 種抗生素色譜圖

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LCMS-8045，日本島津）測定10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液中34 種抗生素色譜圖（圖4）。

表8 各基質(zhì)中34 種抗生素含量回收率（加標(biāo)量為20 μg/kg） （%）

表9 各基質(zhì)中34 種抗生素含量回收率（加標(biāo)量為50 μg/kg） （%）

表10 各基質(zhì)中34 種抗生素含量回收率（加標(biāo)量為100 μg/kg） （%）

圖4 10 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液中34 種抗生素色譜圖

3 結(jié)論

建立了同時測定畜禽糞便中34 種抗生素含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并對該方法的樣品前處理條件、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、可靠性等參數(shù)進行了研究。結(jié)果顯示，這種方法的精密度、準(zhǔn)確性等方法性能指標(biāo)均能滿足檢驗的要求，適合畜禽糞便中抗生素的檢測。方法的建立將進一步為以畜禽糞便為原料加工成肥料產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)督和市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐，從而有效地降低農(nóng)產(chǎn)品與耕地污染風(fēng)險，保護生態(tài)環(huán)境。