熱預(yù)適應(yīng)延緩運(yùn)動疲勞的分子機(jī)制的初步探究

曹慶雷

疲勞是一種由外周和中樞系統(tǒng)雙重因素影響的復(fù)雜現(xiàn)象，如糖原的耗竭、心血管勞損等（Neher et al.，2006）。運(yùn)動性疲勞的機(jī)制存在多種假說，包括中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡、內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)、氨基酸、離子代謝紊亂、自由基增多、能源衰竭和神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的平衡打破等（張?zhí)N琨等，2006）。Matsui等（2011）報道，長期的低血糖運(yùn)動會引起腦糖原降低，導(dǎo)致單胺代謝的激活引起中樞疲勞。長時間運(yùn)動產(chǎn)生的疲勞以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous sys‐tem，CNS）出現(xiàn)的保護(hù)性抑制為主，其中CNS的神經(jīng)遞質(zhì)參與了疲勞的產(chǎn)生與發(fā)展。過去的運(yùn)動性中樞疲勞研究多集中在腦和脊髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能方面，而運(yùn)動性中樞疲勞是如何激活、是否存在于人類運(yùn)動性中樞疲勞的相關(guān)基因群中，尚不清楚。運(yùn)動性中樞疲勞是機(jī)體對外界刺激做出的保護(hù)性反應(yīng)，其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，且基因表達(dá)存在著時間和組織特異性。因此，采用傳統(tǒng)的核酸印記雜交以及RT-PCR等方法難以獲得足夠的信息，特別是無法了解基因間的相互關(guān)系（Fernstrom et al.，2006）。

熱預(yù)適應(yīng)是指將實驗體短時間內(nèi)多次放置在高溫條件下進(jìn)行運(yùn)動，從而使實驗體的表皮和體內(nèi)溫度升高，為后續(xù)運(yùn)動或?qū)嶒炞鰷?zhǔn)備，這也成為研究運(yùn)動疲勞的一種實驗手段（Guy et al.，2015；Tyler et al.，2016；Weller et al.，2007）。熱預(yù)適應(yīng)作為一種安全有效且操作簡便的實驗手段，可減輕實驗體在實驗過程中產(chǎn)生的機(jī)體損傷，比如缺血預(yù)適應(yīng)后可保護(hù)腦組織、肌肉組織（劉亮等，2001；張銀環(huán)等，1995）。陳開祥等（2007）研究表明，熱預(yù)適應(yīng)可減輕心肌細(xì)胞損傷，從而起到一定的保護(hù)作用。熱預(yù)適應(yīng)作用的主要原理為：環(huán)境溫度的改變使得皮膚等表皮器官作為接收器，將熱應(yīng)激信號傳遞至下丘腦等相關(guān)區(qū)域，下丘腦整合為熱敏元信號釋放相關(guān)激素，影響中樞神經(jīng)甚至整個機(jī)體，引發(fā)中樞性疲勞或運(yùn)動性疲勞。有研究顯示，當(dāng)機(jī)體達(dá)到中樞性疲勞或運(yùn)動性疲勞時，會提高多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）的活性來抑制中樞性疲勞，提高運(yùn)動耐受力，從而延長運(yùn)動時間（張念云 等 ，2012；Hasegawa et al.，2008；Takatsu et al.，2010）。此外，機(jī)體還會產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，例如釋放相應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)、改變相應(yīng)受體表達(dá)從而調(diào)整受體數(shù)量，由此進(jìn)行全身性調(diào)節(jié)等以適應(yīng)環(huán)境的改變（胡琰茹 等，2015；Fuller et al.，1998；Rodrigues et al.，2003；Walters et al.，2000）。機(jī)體在長時間產(chǎn)生此種反應(yīng)調(diào)節(jié)后，必定會改變自身原有調(diào)節(jié)機(jī)制，適應(yīng)環(huán)境變化，推測其原有調(diào)節(jié)機(jī)制可能與某些基因的變化相關(guān)，變化的基因可能存在于上調(diào)基因或改變的轉(zhuǎn)錄本中。

在機(jī)體維持自身穩(wěn)態(tài)以適應(yīng)外界環(huán)境的過程中，必然會對作為運(yùn)動承受方及發(fā)出方的肌肉組織產(chǎn)生影響。主要的過程為：經(jīng)下丘腦區(qū)域激發(fā)產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)作用于相應(yīng)效應(yīng)器以刺激其釋放激素與肌肉細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響肌肉細(xì)胞內(nèi)部基因的表達(dá)，若肌肉細(xì)胞內(nèi)部失衡，下丘腦分泌相關(guān)激素作用于大腦皮層，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放，使運(yùn)動能力下降、運(yùn)動時間減少（盧文彪，2010）。大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)運(yùn)動后產(chǎn)生的神經(jīng)和中樞疲勞的信號被大腦皮層接收從而釋放神經(jīng)遞質(zhì)，進(jìn)行神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)，使機(jī)體逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，達(dá)到自身穩(wěn)態(tài)平衡（Neher et al.，2006）。大鼠神經(jīng)遞質(zhì)和激素在全身性調(diào)節(jié)下趨于平衡狀態(tài)，有可能適應(yīng)了實驗的熱應(yīng)激條件，推遲了運(yùn)動疲勞產(chǎn)生的時間（曹慶雷等，2019）。

實驗通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異基因與相關(guān)參考的注釋信息進(jìn)行比對，對因熱預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生改變的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析總結(jié)（竇金煥，2016），了解熱預(yù)適應(yīng)所影響的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組，該生物學(xué)方法在醫(yī)學(xué)、運(yùn)動學(xué)領(lǐng)域的研究，今后可能廣泛應(yīng)用于大鼠甚至人體。肌肉細(xì)胞作為運(yùn)動的承載者，與運(yùn)動及一切生命活動的關(guān)系最為緊密（謝永濤等，2011），因此本研究將大鼠肌肉細(xì)胞作為實驗對象，通過高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并分析轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的基因。

1 材料與方法

1.1 實驗?zāi)Ｐ徒⒑蜆悠凡杉?/h3>

成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量230～260 g（購自北京維通利華實驗動物公司），飼養(yǎng)于首都師范大學(xué)實驗動物中心大鼠飼養(yǎng)房，自由飲水、飲食，飼養(yǎng)房溫度18℃～24℃，空氣相對濕度40%～60%，晝夜節(jié)律正常。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱預(yù)適應(yīng)處理

大鼠隨機(jī)分為對照組和熱預(yù)適應(yīng)組，每組12只。將熱預(yù)適應(yīng)組大鼠置于42℃水中，使其不間斷水浴運(yùn)動，使大鼠內(nèi)臟器官溫度升高至肛溫42℃維持15 min，期間保持大鼠呼吸通暢。運(yùn)動結(jié)束后，將大鼠移出水浴鍋，全身擦干，置于常溫下1 h，再次水浴運(yùn)動至肛溫42℃維持15 min。每天進(jìn)行3次，連續(xù)7天。對照組大鼠正常飼養(yǎng)在室溫25℃的環(huán)境中，不做任何處理。所有的實驗程序均經(jīng)首都師范大學(xué)動物倫理審查委員會批準(zhǔn)，實驗方案符合首都師范大學(xué)實驗動物管理和使用規(guī)程。

1.2.2 RNA提取

取熱預(yù)適應(yīng)組大鼠和對照組大鼠的肌肉組織，利用Trizol試劑（Life Techonology公司，美國）提取總RNA，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。提取的各RNA樣品均以無DNase的DNaseI（TaKaRa公司，大連）進(jìn)行處理，以消除可能存在的基因組DNA污染，然后分別等量混合3個對照組和熱預(yù)適應(yīng)組的RNA樣品（30 μg）。使用Oligotex mRNA小量提取試劑盒（Qiagen公司，德國）分離和純化mRNA。通過 Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kitb Agilent公司，美國）檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片段大小。純度使用紫外分光光度計NanoDrop TM進(jìn)行檢測。

1.2.3 cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序

采用mRNA富集法對total RNA進(jìn)行處理，用帶有Ol‐igodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA以獲得片段化的RNA，隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用瓊脂糖凝膠電泳篩選目的片段，通過特異的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增富集所得到的cDNA文庫。高通量測序由廣州華大基因生物科技有限公司提供測序服務(wù)，使用BGISEQ-500進(jìn)行文庫的測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SOAPnuke軟件對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，將其包含的低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的測序片段進(jìn)行過濾篩選，經(jīng)數(shù)據(jù)過濾后獲得高質(zhì)量測序片段。使用Bowtie2將過濾后測序片段與參考序列進(jìn)行比對，以統(tǒng)計基因比對率，之后再使用RSEM計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。使用R語言軟件里的cor函數(shù)計算每兩個樣品之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進(jìn)行功能分類，根據(jù)KEGG注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進(jìn)行生物通路分類。使用PossionDis算法進(jìn)行差異基因檢測，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為FDR≤0.001且差異倍數(shù)在2倍以上。

2 實驗結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

用于轉(zhuǎn)錄組測序RNA先進(jìn)行質(zhì)量檢測，結(jié)果如表1所示。對照組和熱預(yù)適應(yīng)組樣品的OD260/280值均分別為2.00和2.02；RIN值分別為8.80和8.40，28S/18S值分別為1.20和1.10。這表明本研究所用的樣品組織RNA質(zhì)量較好，滿足轉(zhuǎn)錄組測序要求。

由于測序儀、試劑、樣品質(zhì)量等均能影響堿基質(zhì)量測序，因此原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，為保證測序reads的準(zhǔn)確性需要確定堿基質(zhì)量分布。正常情況下，reads中的前幾個堿基質(zhì)量值不高，是因為反轉(zhuǎn)錄時隨機(jī)引物不能很好地結(jié)合RNA模板；測序長度的增加在一定范圍內(nèi)有助于提高測序質(zhì)量，但長度達(dá)到一定閾值后，由于測序試劑的消耗，高質(zhì)量堿基的比例會降低。從整體上看，如果低質(zhì)量（Quality＜20）的堿基比例較低，說明測序質(zhì)量較好（表2）。

表2 測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計Table 2 Satistical Results of Sequencing Data

從上述結(jié)果可知，通過測序，共獲得了219.72 Mb條的reads，總堿基數(shù)為10.99 Gb，每個樣品均獲得了10 Gb以上的堿基，Q20在97%以上，Q30在90%以上。這表明轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)果質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)結(jié)果分析。得到過濾后reads之后，使用HISAT序列比對軟件將過濾后reads比對到參考基因組序列，結(jié)果如表3所示。兩個樣品分別獲得110 454 472和109 271 956個reads，以大鼠基因組為參考進(jìn)行比對，結(jié)果表明，平均每個樣品的比對率達(dá)到92.53%。比對到參考基因組某一位置過濾后reads平均值為67.50%。兩個樣品的reads與參考基因組的比對效率較高，說明本次測序結(jié)果具有較強(qiáng)可靠性。

表3 參考基因組對比結(jié)果統(tǒng)計表Table 3 Statistical Table of Comparison Results of Reference Genome

2.2 基因表達(dá)量分析

2.2.1 基因比對與表達(dá)

使用Bowtie2將過濾后reads比對到參考序列，之后再使用RSEM轉(zhuǎn)錄組分析軟件計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。以大鼠的表達(dá)基因序列為參考基因，對比及表達(dá)結(jié)果表明，reads比對到參考基因的比率平均為84.26%，reads比對到參考基因唯一位置的比例平均值為65.22%（表4）。說明兩組樣本的reads對表達(dá)基因序列的比對率較高，可以用于后期表達(dá)差異分析。從表5可以看出，在基因數(shù)、轉(zhuǎn)錄本數(shù)量上，兩組樣本間都存在明顯差異，熱預(yù)適應(yīng)組樣本的基因數(shù)量較對照組多，特別是新轉(zhuǎn)錄本（新轉(zhuǎn)錄本是指在參考注釋信息中未能找到已知注釋信息的轉(zhuǎn)錄本，即新轉(zhuǎn)錄本可能屬于已知基因的新的剪接亞型，或者屬于未知基因的新轉(zhuǎn)錄本）。這些新的轉(zhuǎn)錄本預(yù)示新的蛋白編碼，這些蛋白很可能在延緩肌肉疲勞的過程中發(fā)揮重要作用。

表4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測Table 4 Quality Testing of Transcriptome Sequencing Data

表5 基因和轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計Table 5 Statistics of Gene and Transcripts

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選

為了展示基因表達(dá)量的分布，對FPKM（FPKM＜1、FPKM 1～10、FPKM＞10）的3種情況進(jìn)行了基因數(shù)目統(tǒng)計。通過公式計算得到熱預(yù)適應(yīng)組及對照組大鼠肌肉組織FPKM值（圖1）。對照組FPKM＜1的基因占36.63%，F(xiàn)PKM＞10的基因占23.25%。熱預(yù)適應(yīng)組FPKM＜1的基因占34.49%，F(xiàn)PKM＞10的基因占28.18%。同時看出，已知基因和新基因在熱預(yù)適應(yīng)組中表達(dá)量高于對照組，說明大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后刺激了某些已知基因提高其表達(dá)量，或是誘導(dǎo)了某些新基因的表達(dá)，參與到延緩疲勞的過程中。

圖1 基因表達(dá)圖Figure 1.Gene Expression Map

2.2.3 差異表達(dá)基因檢測

為檢測大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的基因表達(dá)差異，進(jìn)一步使用IDEG6軟件，從差異倍數(shù)和顯著水平進(jìn)行評估，將差異倍數(shù)在2倍以上且顯著水平為P＜0.05定義為基因表達(dá)差異顯著。根據(jù)火山圖（圖2）所示，對照組和熱預(yù)適應(yīng)組存在較多的差異表達(dá)基因。與對照組相比，在熱預(yù)適應(yīng)后的肌肉組織中共獲得2 267個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)下調(diào)的基因555個，表達(dá)上調(diào)的基因1 712個（圖3）。表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目大約是表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)目的3倍，表明經(jīng)過熱預(yù)適應(yīng)處理后，跟對照組相比，更多的基因表達(dá)上調(diào)去適應(yīng)這種溫度的變化。換言之，熱預(yù)適應(yīng)處理過程中很多基因需要上調(diào)表達(dá)。表達(dá)量上調(diào)最多的基因是α-微管蛋白特異性1c鏈（tubulin specific 1C chain，TUBA1C），與對照組相比上調(diào)432倍，TUBA1C是組成微管的重要蛋白，微管蛋白在細(xì)胞運(yùn)動中具有重要作用，熱預(yù)適應(yīng)可以促進(jìn)微管蛋白的表達(dá)升高，表明熱預(yù)適應(yīng)也可以改變肌肉組織相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)對熱應(yīng)激的適應(yīng)。表達(dá)量下調(diào)最多的基因是乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶（acetyl-Co A C-acetyl‐transferase，AACT），是參與細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要功能酶，與對照組相比，其在熱預(yù)適應(yīng)后表達(dá)量顯著降低533倍，表明熱預(yù)適應(yīng)也會影響肌肉組織中相關(guān)蛋白酶的表達(dá)。這些結(jié)果顯示，熱預(yù)適應(yīng)處理組和對照組差異基因表達(dá)模式相差較大。在高溫處理后，大量基因表達(dá)發(fā)生明顯的變化，上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)量較多，這可能參與了大鼠高溫應(yīng)答的互作通路。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Figure 2. Volcanic plot of Differentially Expressed Genes

圖3 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計Figure 3.Statistics of Differentially Expressed Genes

2.2.4 差異表達(dá)基因GO功能分析

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，對其GO功能進(jìn)行分類及富集分析。對GO分析的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因按功能可以分為細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三大類，生物學(xué)過程所占比例最多。在生物學(xué)過程中，與生物體代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的過程（如代謝過程、生物過程的調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答等過程）最多，表明在熱預(yù)適應(yīng)后大鼠的肌肉組織中有大量的代謝調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，從而適應(yīng)此過程。在細(xì)胞組分分類中，細(xì)胞部分和細(xì)胞器、細(xì)胞膜所占比例最多，總體而言，組分類基因變化少于生物學(xué)過程基因，通過熱預(yù)適應(yīng)處理1周，該過程中肌肉細(xì)胞發(fā)生響應(yīng)，但是組分變化的作用低于代謝調(diào)控類基因變化的作用。在分子功能中，上調(diào)基因發(fā)揮的主要功能是催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性，說明熱預(yù)適應(yīng)過程中相關(guān)的催化活性蛋白或者結(jié)合蛋白發(fā)揮了重要作用，這些蛋白可能通過分子功能的改變適應(yīng)外界環(huán)境的變化。此外，在GO功能分類中，與運(yùn)動相關(guān)的生物學(xué)過程包括細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)過程、代謝過程、刺激應(yīng)答過程、分子或組織的生物合成過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等。由此可見，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠產(chǎn)生的差異轉(zhuǎn)錄組會作用到各種基因類型，共同參與細(xì)胞或者機(jī)體適應(yīng)環(huán)境。

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，對GO功能進(jìn)行分類及富集分析，GO功能對應(yīng)的差異表達(dá)基因上、下調(diào)統(tǒng)計結(jié)果見圖4。通過“基因本體功能富集”模塊對差異基因進(jìn)行富集分析，對每類基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，篩選出PDF≤0.01的通路。大鼠在熱預(yù)適應(yīng)后整體基因都處于上調(diào)狀態(tài)，下調(diào)基因數(shù)目較少，可以看出，在生物過程中，上調(diào)基因的GO terms與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)及代謝過程有關(guān)，主要參與細(xì)胞的生長發(fā)育，下調(diào)基因主要參與基因調(diào)控。在細(xì)胞組分中，上、下調(diào)基因主要參與生成細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程。在分子功能中，上調(diào)基因主要參與催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性與結(jié)合活性，下調(diào)基因參與細(xì)胞器的構(gòu)成。應(yīng)激反應(yīng)中的差異表達(dá)基因富集較為顯著，表明大鼠肌肉在熱預(yù)適應(yīng)過程中產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝的活動，為后續(xù)延緩運(yùn)動疲勞提供了可能性。

圖4 差異表達(dá)基因GO功能分類統(tǒng)計Figure 4.GO Function Classification Statistics of Differentially Expressed Genes

2.2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，我們對其進(jìn)行KEGG生物通路分類以及富集分析。將基因根據(jù)參與的KEGG代謝通路分為6個部分：細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾?。▋H限動物）、代謝、有機(jī)系統(tǒng)（圖5）（袁姣，2015）。差異基因在細(xì)胞過程中的主要功能是運(yùn)輸和分解代謝，在環(huán)境信息處理中參與信號傳導(dǎo)和信號分子交互過程，在遺傳信息處理中主要參與遺傳信息的折疊、排序和退化以及翻譯過程，在代謝方面主要參與脂質(zhì)代謝，在有機(jī)系統(tǒng)中主要參與免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)。由此可見，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠轉(zhuǎn)錄組發(fā)生的改變，主要體現(xiàn)在提高細(xì)胞的運(yùn)輸和代謝、增強(qiáng)信號分子傳導(dǎo)效率、參與遺傳信息表達(dá)過程和提高脂質(zhì)代謝的過程中。熱預(yù)適應(yīng)對大鼠肌肉組織轉(zhuǎn)錄組的影響主要在于提高細(xì)胞代謝、增強(qiáng)傳導(dǎo)效率，從而延緩運(yùn)動疲勞的產(chǎn)生（馬國強(qiáng)等，2014）。

圖5 差異基因的通路分類Figure 5.Pathway Classification of Differential Genes

使用R語言軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析，選取10條差異基因顯著的信號通路進(jìn)行解釋（表6）?？梢钥闯?，大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后差異基因主要參與蛋白酶體、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）受體相互作用、膀胱癌、肝纖維化、血管重建、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲等過程。其中，蛋白酶體富集最為顯著，其功能主要涉及細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等。

表6 差異表達(dá)基因通路功能富集部分結(jié)果示例Table 6 Examples of the Results of Pathway Functional Enrichment of Differentially Expressed Genes

將富集明顯的30條信號通路中基因的上、下調(diào)情況進(jìn)行了統(tǒng)計。實驗樣本富集通路差異基因上調(diào)的基因主要存在于蛋白酶體和谷胱甘肽（glutathione，GSH）代謝過程。蛋白質(zhì)是生命功能的體現(xiàn)者，而蛋白酶體直接影響某些蛋白質(zhì)的更新，其中包括錯誤折疊蛋白和許多在生命活動中起重要作用的蛋白質(zhì)，如p53、cyclin等。蛋白酶體對蛋白質(zhì)的降解通過泛素介導(dǎo)，泛素識別要被降解的蛋白質(zhì)，然后將這種蛋白質(zhì)送入蛋白酶體進(jìn)行降解。這就說明，參與蛋白合成和降解的基因表達(dá)都是上調(diào)的，換言之，經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后，機(jī)體在運(yùn)動過程中很可能通過提高代謝率緩解疲勞。

GSH作為一種細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)，既是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，并能激活多種酶，如巰基酶-輔酶等，從而促進(jìn)糖類、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。同時，GSH通過巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，可直接使自由基還原成酸性物質(zhì)，從而加速自由基的排泄，并對抗自由基，減輕其對重要臟器的損害。Haddad等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，GSH參與了脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)及I-κB/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)。NF-κB是具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，參與調(diào)控多種因子的基因表達(dá)，在免疫調(diào)控、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中起重要作用。NF-κB還可進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，通過迅速合成I-κB終止轉(zhuǎn)錄。NF-κB表達(dá)廣泛，功能及調(diào)節(jié)較為復(fù)雜，而且能夠誘導(dǎo)NF-κB和DNA結(jié)合的誘導(dǎo)物很多，對應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞黏附和增生均有重要的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

本研究對熱預(yù)適應(yīng)的大鼠肌肉組織轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行分析，經(jīng)測序得到17 951個基因，已知的基因17 616個，預(yù)測的新基因435個；同時，測序得到的9 825個新轉(zhuǎn)錄本中，8 325個屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型，435個屬于新的蛋白編碼基因，剩下的1 065個屬于長鏈非編碼RNA。在熱預(yù)適應(yīng)后的大鼠肌肉組織中共獲得2 267個差異表達(dá)基因，其中下調(diào)基因555個，上調(diào)基因1 712個。進(jìn)一步將這些差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG代謝途徑注釋。GO功能注釋分類表明，肌肉組織不同生理狀態(tài)差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞相關(guān)類別（細(xì)胞組分、細(xì)胞器等）、膜相關(guān)類別（包括膜、膜部分）、分子綁定、催化活性、分子傳感器活性、細(xì)胞過程、代謝過程等。這些結(jié)果表明，參與大鼠肌肉生理活動的差異基因除了集中于細(xì)胞內(nèi)，還廣泛分布于生物調(diào)節(jié)和代謝過程、刺激應(yīng)答過程、多生物體過程或發(fā)育過程、生物過程正反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞組分或生物合成信號通路等。在生物過程中，上調(diào)基因的GO terms與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)及代謝過程有關(guān)，主要參與細(xì)胞的生長發(fā)育。下調(diào)基因主要參與基因調(diào)控。在細(xì)胞組分中，上、下調(diào)基因主要參與生成細(xì)胞器、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程。在分子功能中，上調(diào)基因主要參與催化細(xì)胞中相關(guān)酶的活性、結(jié)合活性，下調(diào)基因參與細(xì)胞器的構(gòu)成。應(yīng)激反應(yīng)中的差異表達(dá)基因富集較為顯著，表明大鼠肌肉在熱預(yù)適應(yīng)過程中存在大量的代謝調(diào)控。此外，在肌肉細(xì)胞的表達(dá)基因中，分子綁定功能類別占有較高比例，進(jìn)一步證實分子綁定功能類別在肌肉中具有顯著表達(dá)，推測分子綁定在大鼠肌肉的生理活動中可能具有重要的作用。對差異基因進(jìn)行通路富集分析，可以確定差異表達(dá)基因參與的主要代謝途徑和信號傳導(dǎo)途徑，以及與其他基因的相互作用。本研究KEGG通路分析表明，差異表達(dá)基因共涉及326個通路，其中蛋白酶體、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路和ECM受體相互作用等4個通路被顯著富集。

蛋白酶體主要參與細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、抗原提呈、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、炎癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生等（Javitt et al.，2019）。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）由HIF-α和HIF-β兩個亞基組成，在低氧下能激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞、組織生長發(fā)育和生理應(yīng)激，以及某些病理過程中具有重要的作用。近年來，有關(guān)HIF-1在細(xì)胞低氧應(yīng)激時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是HIF-α介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究取得了巨大進(jìn)展。HIF-1可以上調(diào)血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，如促進(jìn)血管生成的VEGF及其受體的表達(dá)，這些基因的表達(dá)能夠誘導(dǎo)某些血管收縮因子的產(chǎn)生，如一氧化氮合酶（iNOS）ET-1和血紅素氧化酶1（HO-1）等，從而增加血流（王萍萍等，2011），為肌肉運(yùn)動提供更多氧氣，延緩運(yùn)動疲勞。

PI3K（phosphatidylinositide 3-kinases）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成，且與癌基因的產(chǎn)物相關(guān)。PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。AKT又稱PKB（protein kinase B），是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在多種細(xì)胞生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是PI3K重要的下游分子，包括至少3種形式，分別為AKT1、AKT2和AKT3。它們對于調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、遷移、存活以及糖代謝起到重要的作用，而且此信號通路只存在于經(jīng)刺激后的個體（黃秀蘭等，2008），這就解釋了大鼠在熱預(yù)適應(yīng)后，經(jīng)此信號通路既可以調(diào)控肌肉細(xì)胞生長，又可增加糖代謝為機(jī)體提供能量，從而達(dá)到延緩疲勞的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)是組成間質(zhì)和上皮血管中基質(zhì)的不溶性結(jié)構(gòu)成分，主要有膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。研究表明，ECM可影響細(xì)胞分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等生物學(xué)過程。

已有研究發(fā)現(xiàn)，中樞性疲勞與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌有關(guān)（曹慶雷等，2019；楊瑾，2013），了解熱預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的新轉(zhuǎn)錄本與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌有何關(guān)系，或許可以為延緩疲勞產(chǎn)生、研究預(yù)防措施和治療方法有一定的推動作用。有研究顯示，熱預(yù)適應(yīng)可改善神經(jīng)遞質(zhì)、延緩運(yùn)動性疲勞出現(xiàn)（王峰，2008）。雖然改變神經(jīng)遞質(zhì)的具體機(jī)制還不清楚，但實驗已證明，熱預(yù)適應(yīng)對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)活動網(wǎng)絡(luò)造成了影響，使實驗體預(yù)先進(jìn)入調(diào)節(jié)機(jī)制（鄧聰穎，2007）。而本研究的實驗結(jié)果表明，熱預(yù)適應(yīng)也可通過外界環(huán)境造成的體液調(diào)節(jié)影響激素分泌，甚至造成新轉(zhuǎn)錄本的出現(xiàn)影響實驗體本身。但研究結(jié)果都表明，外界刺激使得實驗體產(chǎn)生了適應(yīng)環(huán)境的改變。在轉(zhuǎn)錄組測序中，可變剪接需要用到已知的參考基因組序列和已經(jīng)注釋的可變剪接事件（王正志等，2006），由于注釋基因組對可變剪接注釋不夠全面，因此所得結(jié)論和研究的深度并不能完全相符，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及實驗研究的深入，研究結(jié)果也將不斷推進(jìn)。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)對大鼠經(jīng)熱預(yù)適應(yīng)后的肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，探討了大鼠不同生理狀態(tài)下肌肉組織差異表達(dá)基因的數(shù)量，獲得了差異表達(dá)基因的功能、分類和代謝通路，為豐富大鼠經(jīng)運(yùn)動處理后肌肉組織轉(zhuǎn)錄組信息、探究熱預(yù)適應(yīng)對基因轉(zhuǎn)錄組的影響以及揭示神經(jīng)遞質(zhì)在運(yùn)動疲勞過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。