建立和驗(yàn)證藥物安全性評(píng)價(jià)中實(shí)驗(yàn)病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)參考值范圍的影響因素和方法

王曉秋，江佳佳

（1.蘇州西山中科藥物研究開發(fā)有限公司，江蘇蘇州 215104；2.江蘇大學(xué)澳洋腫瘤研究院，江蘇蘇州 215600）

臨床病理學(xué)檢測(cè)是藥物安全性評(píng)價(jià)中非常靈敏的重要研究手段，用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康檢查和篩選、疾病診斷和監(jiān)測(cè)，評(píng)估藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的毒性反應(yīng)類型和程度以及毒性反應(yīng)是否具有劑量關(guān)系、是否可逆等。藥物安全性評(píng)價(jià)中解讀給藥組動(dòng)物臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)改變時(shí)，除應(yīng)比較同期對(duì)照組動(dòng)物數(shù)據(jù)和給藥組動(dòng)物給藥前的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)之外，還應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的參考值范圍進(jìn)行綜合分析，這樣才能做出正確判斷[1]。臨床病理學(xué)檢測(cè)國際協(xié)調(diào)聯(lián)合科學(xué)委員會(huì)推薦了藥物安全性評(píng)價(jià)中血液學(xué)、臨床化學(xué)和尿液分析等臨床病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)[2]，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定量檢測(cè)指標(biāo)值與正常人相比差異較大，如北平頂猴外周血白細(xì)胞參考值范圍為（6.0～31.4）×109L-1[3]，人外周血白細(xì)胞參考值范圍則為（3.5～9.5）×109L-1[4]。因此，科學(xué)合理地建立和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床病理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的參考值范圍具有極其重要的意義，但目前國內(nèi)外在此方面尚未頒布明確的技術(shù)指南。雖然國內(nèi)外已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了不同動(dòng)物臨床部分病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)的參考值范圍[5-11]，但建立方法差異較大，科學(xué)性和規(guī)范性尚存疑問，且參考值范圍的驗(yàn)證也基本未有提及。因此，本文在參考國內(nèi)外臨床診斷和獸醫(yī)學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則及文獻(xiàn)[12-16]的基礎(chǔ)之上，結(jié)合藥物安全性評(píng)價(jià)工作的特殊性，探索性地提出藥物安全性評(píng)價(jià)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)參考值范圍的建立和驗(yàn)證應(yīng)考慮的影響因素和方法，為藥物安全性評(píng)價(jià)研究提供參考和借鑒。

1 參考值范圍的建立

臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)包括血液學(xué)、臨床生物化學(xué)、凝血和免疫學(xué)等指標(biāo)。建立這些定量檢測(cè)指標(biāo)參考值范圍可以通過前瞻性研究或回顧性研究2種方式，對(duì)于藥物安全性評(píng)價(jià)研究機(jī)構(gòu)而言，回顧性研究顯然更為可行。無論采取哪種方式，在獲得足夠的健康動(dòng)物臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)時(shí)，均應(yīng)盡快完成這些指標(biāo)參考值范圍的首次建立。

1.1 動(dòng)物參考群體分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡、性別、營養(yǎng)狀態(tài)、生殖狀況、飼養(yǎng)狀況、地理位置和活動(dòng)等因素均有可能會(huì)影響動(dòng)物參考群體各項(xiàng)臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)值[17-18]，故在理想情況下，應(yīng)為不同類別動(dòng)物建立單獨(dú)的參考值范圍。如不可行，參考群體應(yīng)根據(jù)上述因素進(jìn)行劃分，以獲得能代表健康動(dòng)物群體的臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)的生物學(xué)分布。實(shí)際工作中，至少應(yīng)按動(dòng)物性別和年齡分組來分別建立參考值范圍[10-11]。

1.2 動(dòng)物參考個(gè)體篩選標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)建立詳細(xì)的動(dòng)物參考個(gè)體篩選標(biāo)準(zhǔn)，如動(dòng)物體重、活動(dòng)性、飲食、排泄、傳染病檢查和腸道寄生蟲檢查等，以確保排除不健康的動(dòng)物[19-20]。

對(duì)于大動(dòng)物而言，可選擇未進(jìn)入研究專題的經(jīng)適應(yīng)期和檢疫期的健康貯備動(dòng)物，或研究專題中對(duì)照組中的健康動(dòng)物和（或）給藥組中給藥前的健康動(dòng)物。對(duì)于小動(dòng)物而言，可選擇未進(jìn)入研究專題的經(jīng)適應(yīng)期和檢疫期的健康貯備動(dòng)物，或選擇研究專題中對(duì)照組中的健康動(dòng)物。

1.3 動(dòng)物參考個(gè)體數(shù)量

參考值是通過對(duì)參考個(gè)體某一特定量進(jìn)行觀察或測(cè)量而得到的檢測(cè)結(jié)果。參考值范圍通常包括參考上限和參考下限，兩參考限之間（含2個(gè)參考限）的區(qū)間則為參考值范圍，通常是中間95%的數(shù)據(jù)分布范圍[1，12]。代表每一動(dòng)物參考群體的動(dòng)物參考個(gè)體至少需120只，以保證能正確建立90%置信水平的臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)的參考值范圍，如按99%置信水平來建立，則至少需要198 只動(dòng)物參考個(gè)體[12-13]。例如，王茵等[21]采用260只8～10周齡的SD大鼠，雌雄各130只，建立了多項(xiàng)血液生化指標(biāo)的參考值范圍，其中血清白蛋白和血糖的參考值范圍雌雄動(dòng)物之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故實(shí)際應(yīng)用時(shí)可合并計(jì)算，此時(shí)這2項(xiàng)指標(biāo)所建立的參考值范圍來源于260只SD大鼠，可達(dá)到99%置信水平；而膽固醇、血清總蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮的參考值范圍雌雄動(dòng)物之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)宜按雌雄性別分別統(tǒng)計(jì)，此時(shí)每組動(dòng)物參考個(gè)體數(shù)量為130只，則每組所建立的參考值范圍可達(dá)到90%置信水平。

通常根據(jù)置信水平的要求來考慮所需動(dòng)物參考個(gè)體數(shù)量即可，若納入更多數(shù)量的動(dòng)物參考個(gè)體并不會(huì)顯著提高參考值范圍的置信水平，且有可能增加樣品采集和檢測(cè)等各方面的成本。

1.4 樣品采集的要求

用于建立參考值范圍的動(dòng)物樣品的采集條件應(yīng)盡可能一致，如動(dòng)物禁食情況、動(dòng)物保定條件、樣品采集程序和樣品處理程序等[17-18]，以消除樣品采集環(huán)節(jié)對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果可能造成的影響。每一動(dòng)物參考個(gè)體每一定量檢測(cè)指標(biāo)只需采集一份樣品以獲得單一代表性的檢測(cè)數(shù)據(jù)，相同樣品類型需求的定量檢測(cè)指標(biāo)可以共用一份樣品。

1.5 樣品檢測(cè)的要求

用于樣品檢測(cè)的檢測(cè)系統(tǒng)，廣義上來說，包括檢測(cè)人員、檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等要素，應(yīng)為準(zhǔn)確度和精密度等技術(shù)指標(biāo)已驗(yàn)證合格的檢測(cè)系統(tǒng)或檢測(cè)方法，并定期參加官方機(jī)構(gòu)或第三方權(quán)威機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)且成績(jī)合格，且已為檢測(cè)系統(tǒng)制定了科學(xué)合理的常規(guī)校準(zhǔn)程序和室內(nèi)質(zhì)控程序，并嚴(yán)格按照試劑生產(chǎn)商的要求接收、儲(chǔ)存和使用各類檢測(cè)試劑。

樣品應(yīng)在采集后立即檢測(cè)[14-16]，如因故不能立即檢測(cè)，可以按穩(wěn)定性已驗(yàn)證的儲(chǔ)存條件和儲(chǔ)存周期進(jìn)行暫存后再進(jìn)行檢測(cè)[14]。檢測(cè)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照已制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)在所伴隨的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)符合接受標(biāo)準(zhǔn)的前提下，再經(jīng)過審核無誤后才能發(fā)放。

1.6 樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理

將每一定量檢測(cè)指標(biāo)的所有樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，并將最高值減去最低值以獲得數(shù)據(jù)全距（range，R），將次高值加上R/3，次低值減去R/3獲得一個(gè)新的范圍，如疑似離群值超過此范圍，則應(yīng)將其作為真實(shí)離群值進(jìn)行剔除[12]。若剔除離群值后樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)不足120個(gè)，則需補(bǔ)足[12]。若為前瞻性研究，則需新增動(dòng)物參考群體數(shù)量繼續(xù)檢測(cè)直至獲得足夠符合要求的數(shù)據(jù)量。若為回顧性研究，則可直接調(diào)用同一動(dòng)物參考群體中符合要求的數(shù)據(jù)以補(bǔ)足。

采用SAS和SPSS等專業(yè)統(tǒng)計(jì)分析軟件評(píng)估每一定量檢測(cè)指標(biāo)剔除離群值后的所有樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布（高斯分布）。對(duì)于符合正態(tài)分布的檢測(cè)數(shù)據(jù)，使用參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法按x±2SD來估算參考值范圍；對(duì)于不符合正態(tài)分布的檢測(cè)數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法按百分位數(shù)法來估算P2.5～P97.5的參考值范圍。

2 參考值范圍的驗(yàn)證

2.1 參考值范圍的驗(yàn)證條件

當(dāng)一個(gè)藥物安全性評(píng)價(jià)研究機(jī)構(gòu)的臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)的參考值范圍首次建立后，在動(dòng)物參考群體的來源、樣品采集條件以及檢測(cè)系統(tǒng)未發(fā)生改變時(shí)，通常不需要定期驗(yàn)證參考值范圍的適用性或定期更新參考值范圍。

但如發(fā)生下列情況時(shí)，則在參考值范圍首次建立后需進(jìn)行驗(yàn)證：①動(dòng)物參考群體的來源、樣品采集條件以及檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)生改變時(shí)，如動(dòng)物供應(yīng)商改變、更換樣本采集裝置、檢測(cè)儀器更新、檢測(cè)試劑更換等；②首次建立參考值范圍時(shí)因故未能獲得足夠數(shù)量的檢測(cè)數(shù)據(jù)；③考慮直接引用來自其他藥物安全性評(píng)價(jià)研究機(jī)構(gòu)公布的參考值范圍。

2.2 參考值范圍驗(yàn)證的實(shí)施

采集可以代表每一動(dòng)物參考群體的20只動(dòng)物參考個(gè)體的樣品進(jìn)行檢測(cè)。按1.6處理方式，檢查每一定量檢測(cè)指標(biāo)全部20個(gè)樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)中是否存在離群值，如有則需剔除并用其它動(dòng)物參考個(gè)體的樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)足。

如果20個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)中只有不超過2個(gè)數(shù)據(jù)不在原參考值范圍之內(nèi)，則說明該參考值范圍仍適用。

如果超過2個(gè)數(shù)據(jù)不在原參考值范圍之內(nèi)，則應(yīng)再取另外20只動(dòng)物參考個(gè)體的樣品進(jìn)行檢測(cè)，同樣進(jìn)行離群值檢查、剔除和檢測(cè)數(shù)據(jù)補(bǔ)足，如果新獲得的20個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)中只有不超過2個(gè)數(shù)據(jù)不在原參考值范圍之內(nèi)，則說明該參考值范圍適用，否則需要重新建立參考值范圍。

3 參考值范圍的應(yīng)用和解析

在評(píng)估檢疫期動(dòng)物的健康狀態(tài)、藥物安全性評(píng)價(jià)研究中對(duì)照組動(dòng)物的健康狀態(tài)、給藥組動(dòng)物給藥前的健康狀態(tài)時(shí)，可以直接依據(jù)臨床病理學(xué)參考值范圍來評(píng)估臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)是否異常以及異常的程度，并結(jié)合動(dòng)物一般檢查、籠邊觀察、體重、攝食量和體溫等情況對(duì)動(dòng)物的健康狀態(tài)進(jìn)行綜合判斷。

在評(píng)估給藥組動(dòng)物給藥后的臨床病理學(xué)指標(biāo)是否出現(xiàn)毒性改變以及毒性改變的程度時(shí)，由于同一藥物安全性評(píng)價(jià)研究中給藥組動(dòng)物和對(duì)照組動(dòng)物來源、年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、飼養(yǎng)和處置方式相同，故應(yīng)先比較給藥組動(dòng)物與同期對(duì)照組動(dòng)物的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)均值之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1-2]。給藥組動(dòng)物與對(duì)照組動(dòng)物的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)均值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，可以初步判斷給藥組動(dòng)物給藥后臨床病理學(xué)指標(biāo)未出現(xiàn)毒性改變。給藥組動(dòng)物與對(duì)照組動(dòng)物的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)均值之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，則繼續(xù)檢查給藥組動(dòng)物給藥后臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)是否已超出參考值范圍。

若給藥組動(dòng)物給藥后的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)未超過參考值范圍，則可初步判斷給藥組動(dòng)物給藥后臨床病理學(xué)指標(biāo)未出現(xiàn)毒性改變，與同期對(duì)照組動(dòng)物檢測(cè)數(shù)據(jù)之間的差異雖具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但并不具有生物學(xué)意義和毒理學(xué)意義。若給藥組動(dòng)物給藥后的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)超過參考值范圍，則分析是否僅屬于藥效指標(biāo)發(fā)生改變，例如，促紅細(xì)胞生成素引起的紅細(xì)胞數(shù)量上升、特立帕肽（teriparatide）引起的血鈣升高等表明藥效指標(biāo)發(fā)生了改變。那么這些藥效指標(biāo)的改變僅具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義，但并不具有毒理學(xué)意義。

若給藥組動(dòng)物給藥后的臨床病理學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)超過參考值范圍，且不屬于藥效指標(biāo)，則可初步判斷這些指標(biāo)的改變具有毒理學(xué)意義，并進(jìn)一步結(jié)合給藥組動(dòng)物給藥前檢測(cè)數(shù)據(jù)和同期其他劑量組給藥動(dòng)物檢測(cè)數(shù)據(jù)來綜合評(píng)估臨床病理學(xué)指標(biāo)毒性改變的程度以及是否具有劑量依賴性。

另外，由于藥物安全性評(píng)價(jià)研究中各組動(dòng)物數(shù)量較少，尤其是大動(dòng)物（如食蟹猴和Beagle犬），因此無論給藥組和對(duì)照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均應(yīng)觀察各組動(dòng)物個(gè)體數(shù)據(jù)是否超過參考值范圍。如超過，則需結(jié)合該動(dòng)物的臨床觀察指標(biāo)和組織病理學(xué)檢查結(jié)果等進(jìn)行綜合判斷，從而完整地評(píng)價(jià)藥物毒性作用。

4 結(jié)語

目前，已有研究報(bào)道了不同周齡幼年SD大鼠以及不同品系不同周齡小鼠的生化指標(biāo)參考值范圍[10-11，22]。此外，北平頂猴、食蟹猴和 Beagle犬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液學(xué)和血液生化指標(biāo)的參考值范圍也有報(bào)道[3，9，23-24]，但凝血指標(biāo)參考值范圍的報(bào)道較少，僅見SD大鼠的凝血酶原時(shí)間的研究報(bào)道[25]。臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)參考值范圍在藥物安全性評(píng)價(jià)研究中對(duì)于正確解讀臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)、正確評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病診斷和治療以及正確評(píng)估藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毒性等具有非常重要的意義。如何科學(xué)、規(guī)范地建立和驗(yàn)證臨床病理學(xué)定量檢測(cè)指標(biāo)的參考值范圍是一項(xiàng)亟待解決的問題，希望在不遠(yuǎn)的將來能夠出臺(tái)相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，從而為新藥研發(fā)助力。