60Co γ射線照射對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響

閆凱欣，趙亞偉，王溢豪，易 靜，段 晗，陶 寧，王 華，，胡舜英

（1.解放軍總醫(yī)院心血管病醫(yī)學(xué)部，北京 100853；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032）

放射性心臟?。╮adiation-induced heart disease，RIHD）是臨近心臟的胸部腫瘤放療時，射線損傷心臟所產(chǎn)生的遲發(fā)性心臟并發(fā)癥[1]。近年來，對于與縱膈放療相關(guān)的心血管并發(fā)癥的研究發(fā)現(xiàn)，相比無放療史的患者，有縱隔放療史的患者的冠心病發(fā)生率更高，對RIHD長期發(fā)展的影響更大[2]。臨床研究顯示，縱隔淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和食管癌患者在接受局部放療后多年誘發(fā)心臟毒性的風(fēng)險明顯增加，且產(chǎn)生的心臟毒性均與RIHD的發(fā)生有關(guān)[3-4]。但是，放射治療是癌癥治療一種重要的手段，通過放療可提高許多癌癥患者的生存率，為改善腫瘤患者的長期預(yù)后，需高度重視放療所帶來的RIHD并發(fā)癥，深入研究RIHD發(fā)病機(jī)制具有重要臨床意義[5]。

相比于心臟組織中其他類型的細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞對于輻射更為敏感[6]。目前認(rèn)為，RIHD的發(fā)病機(jī)制主要在于射線對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致冠脈受損[7]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠接受20 Gy射線心臟局部照射，在照射后120 d，照射組大鼠心肌微循環(huán)灌注較未照射組顯著下降[7]。但血管內(nèi)皮細(xì)胞的放射損傷機(jī)制仍未完全闡明[8]。放射生物學(xué)的經(jīng)典理論認(rèn)為，射線導(dǎo)致DNA損傷是機(jī)體放射損傷的主要機(jī)制[9]，而有研究顯示，射線導(dǎo)致細(xì)胞中線粒體代謝障礙在放射損傷的發(fā)病機(jī)制中可能亦起著重要作用[3]。

當(dāng)細(xì)胞受到放射、化療藥物和缺氧等外部刺激時，線粒體作為一種調(diào)節(jié)生物能量和生物合成途徑中的重要細(xì)胞器，可快速調(diào)節(jié)自身功能以滿足細(xì)胞的代謝需求[12]。線粒體功能狀態(tài)與線粒體膜電位、線粒體膜通道孔、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和線粒體分裂等變化密切相關(guān)[13]，健康的線粒體網(wǎng)絡(luò)對于心血管功能至關(guān)重要[14]。本研究通過60Co γ射線照射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），觀察線粒體功能和線粒體結(jié)構(gòu)，尤其是線粒體分裂及相關(guān)蛋白的變化，探討60Co γ射線照射對HUVEC線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

HUVEC，美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)基、ROS檢測試劑盒，美國Thermo公司；胎牛血清，美國Gemini公司；RIPA裂解液和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）（ΔΨm）檢測試劑盒，碧云天公司；細(xì)胞線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）檢測試劑盒，上海杰美基因公司；APC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，美國Biogens公司；一抗：β肌動蛋白單抗，美國Proteintech公司；兔抗大鼠磷酸化動力相關(guān)蛋白1（power-related protein1，DRP1）和磷酸化線粒體分裂因子（mitochodrial division factor，MFF）單抗，基因集團(tuán)基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光液，北京莊盟公司。Power-Pac164-5050電泳儀，美國Bio-Rad公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司；X-Light V3轉(zhuǎn)盤共聚焦，意大利CrestOptics公司；7500Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國ABI公司；Tanon5200全自動化學(xué)發(fā)光成像儀，上海天能公司；VarioskanFlash光譜掃描多功能讀數(shù)儀，美國Thermo公司；60Co γ射線輻照裝置由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供，單次照射劑量率為64.46 cGy·min-1。

1.2 HUVEC培養(yǎng)和傳代

以含有10%胎牛血清與1%HEPES液的低糖DMEM為HUVEC的培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時傳代，傳代比例為1∶3。

1.3 HUVEC分組處理

將生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞以3×106L-1的密度接種于6孔板內(nèi)（每孔2 mL）置37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞均勻貼壁后，分別進(jìn)行5，10和20 Gy60Co γ射線照射，同時設(shè)未照射細(xì)胞為細(xì)胞對照組，①照射后24和48 h進(jìn)行相關(guān)檢測或②照射后48 h進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

利用顯微鏡觀察1.3分組①處理的細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量并拍照記錄。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVEC凋亡率

收集1.3分組①處理的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化貼壁的HUVEC細(xì)胞，300×g離心5 min，收集細(xì)胞后用磷酸鹽緩沖液漂洗2次。加5 μL APCAnnexinⅤ混勻，室溫避光孵育15 min；再加入PI細(xì)胞核染料5 μL混勻，室溫避光孵育10 min。洗滌后加入PBS 400 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡率〔早期凋亡細(xì)胞（APC+PI-）和晚期凋亡或壞死細(xì)胞（APC+PI+）〕。

1.6 化學(xué)熒光染色法檢測HUVEC中ROS水平

取1.3分組①處理的細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，更換2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入2 μL H2DCFDA 探針 10 mmol·L-1，使探針終濃度為 10 μmol·L-1，孵育 30 min。孵育結(jié)束后用 PBS漂洗3次，在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻部位，觀察貼壁細(xì)胞，進(jìn)行定性分析。綠色熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)和化學(xué)熒光染色法檢測HUVEC線粒體膜電位

1.7.1 流式細(xì)胞術(shù)

將試劑盒中的 CCCP（10 mmol·L-1）按照 1∶1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μmol·L-1，處理細(xì)胞 20 min 作為陽性對照。JC-1單體的最大激發(fā)波長為514 nm，最大發(fā)射波長為529 nm；JC-1聚合物的最大激發(fā)波長為585 nm，最大發(fā)射波長為590 nm。

取1.3分組①處理的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清，用PBS漂洗1次，加培養(yǎng)基500 μL重懸細(xì)胞；再加染色工作液500 μL，混勻置培養(yǎng)箱避光孵育20 min；4℃，300×g離心5 min，棄上清，用預(yù)冷1×緩沖液漂洗2次；1×緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測HUVEC細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞百分比，定量MMP。

1.7.2 化學(xué)熒光染色法

取1.3分組①處理的細(xì)胞，按線粒體膜電位化學(xué)熒光染色法檢測試劑盒操作說明操作。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL和JC-1染色工作液0.5 mL，充分混勻，孵育20 min；孵育結(jié)束后吸棄上清，用預(yù)冷1×JC-1緩沖液洗滌2次，加細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻部位，觀察貼壁細(xì)胞，進(jìn)行定性分析。以紅色熒光與綠色熒光比值定量MMP（ΔΨm）。

1.8 化學(xué)熒光染色法檢測HUVEC細(xì)胞線粒體膜通道孔開放狀態(tài)

取1.3分組①處理的細(xì)胞，按mPTP檢測試劑盒操作說明操作。小心吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加37℃預(yù)熱的清理液0.5 mL清洗1次，再加染色工作液0.5 mL，充分混勻，置培養(yǎng)箱37℃避光孵育20 min，孵育結(jié)束后吸棄染色工作液，用預(yù)熱的清理液清洗2次，在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻部位，觀察貼壁細(xì)胞，進(jìn)行mPTP開放定性分析。綠色熒光減弱表明mPTP活性增強(qiáng)、開放增加。

1.9 透射電鏡觀察HUVEC細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)

取1.3分組②處理的細(xì)胞，軟毛刷輕輕刮下細(xì)胞，用2.5%戊二醛2%多聚甲醛混合固定液4℃固定過夜后，吸棄廢液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.1 mol·L-1，pH 7.4）洗3次；1%四氧化鋨（OsO4）常溫下固定1 h；回收 OSO4廢液；再次用 PBS（0.1 mol·L-1，pH 7.4）洗滌3次，每次10 min；梯度乙醇脫水后，分別用3∶1，1∶1的丙酮和環(huán)氧樹脂進(jìn)行樣本浸透。置烘箱60℃聚合24 h。用ImageJ軟件計算線粒體個數(shù)，并測量周長和面積。

1.10 Western印跡法檢測HUVEC中p-Drp1和p-Mff蛋白表達(dá)水平

取1.3分組②處理的細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，10 000×g，4℃離心10 min，吸取上清液。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整各組蛋白質(zhì)濃度，以4∶1體積比加入5×上樣緩沖液混勻，100℃煮10 min。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為20 μg，分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗（抗p-Drp1和p-Mff抗體，稀釋比均為1∶2000），4℃孵育過夜。TBS-T清洗4次，每次5 min。隨后加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（1∶5000），室溫孵育1 h，TBS-T洗膜4次，每次5 min。以β肌動蛋白作為內(nèi)參對照。發(fā)光、顯影、掃描后分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白IA比值表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用GraphPad-Prism7進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析和正態(tài)分布t檢驗分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 60Co γ射線照射對HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響

形態(tài)觀察結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞經(jīng)60Co γ射線照射后24和48 h，細(xì)胞對照組（0 Gy）生長狀態(tài)均良好，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞延展性較好，貼壁牢固，折光性好；而5，10和20 Gy照射組，隨照射劑量增加，HUVEC細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，且細(xì)胞均有不同程度變小、皺縮，貼壁不牢固（圖1）。

Fig.1 Effect of60Co γ-ray irradiation on human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）morphology at 24 and 48 h post-irradiation under microscope.

2.2 60Co γ射線照射對HUVEC細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果顯示，60Co γ射線照射后24和48 h，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組HUVEC細(xì)胞凋亡率均增加（P＜0.01）（圖2）。

Fig.2 Effect of60Co γ-ray irradiation on apoptosis of HUVECs evaluated by flow cytometry.A2 and B2 were the quantitative results of A1（24 h）and B1（48 h），respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0 Gy（cell control）group.

2.3 60Co γ射線照射對HUVEC中ROS水平的影響

熒光染色結(jié)果顯示，60Co γ射線照射后24和48 h，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組HUVEC綠色熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），表明60Co γ射線照射導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加（圖3）。

Fig.3 Effect of60Co γ-ray irradiation on reactive oxygen species（ROS）production in HUVECs by laser confocal fluorescence imaging.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1（24 h）and B1（48 h），respectively.FI：fluorence intensity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 60Co γ射線照射對HUVEC線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，60Co γ射線照射后24和48 h，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組HUVEC紅色熒光細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01）（圖4），表明線粒體膜電位下降。

Fig.4 Effect of60Co γ-ray irradiation on mitochondrial membrane potential（MMP）in HUVECs by flow cytometry.A2 and B2 were the quantitative results of A1（24 h）and B1（48 h），respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，60Co γ射線照射后24和48 h，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組HUVEC紅色熒光與綠色熒光比值顯著降低（P＜0.01）（圖5）。

Fig.5 Effect of60Co γ-ray irradiation on MMP in HUVECs by laser confocal fluorescence imaging.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1（24 h）and B1（48 h），respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 60Co γ射線照射對HUVEC線粒體膜通道孔開放的影響

結(jié)果顯示，60Co γ射線照射后24和48 h，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組HUVEC綠色熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05，P＜0.01）（圖6），提示60Co γ射線照射導(dǎo)致HUVEC的mPTP開放程度提高。

Fig.6 Effect of60Co γ-ray irradiation on mitochondrial permeability transition pore（mPTP）opening in HUVECs by laser confocal fluorescence imaging.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1（24 h）and B1（48 h），respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 60Co γ射線照射對HUVEC線粒體結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，細(xì)胞對照組線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體脊保存完好。5，10和20 Gy照射組線粒體內(nèi)部有不同程度的腫脹，線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，特異性結(jié)構(gòu)脊不清晰（圖7A）。與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy組單個線粒體面積顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖7B1）；10和20 Gy組單個線粒體周長增加（P＜0.01）（圖7B2）；5，10和20 Gy組線粒體密度顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）（圖7B3）；5，10和20 Gy組異常線粒體比例顯著增加（P＜0.01）（圖7B4）。

Fig.7 Effect of60Co γ-ray irradiation on mitochondrial morphology in HUVECs under transmission electron microscope.Arrows show the mitochondrial structure.B1，B2，B3 and B4 were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.7 60Co γ射線照射對HUVEC中p-Drp1和p-Mff蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡實驗結(jié)果（圖8）顯示，與細(xì)胞對照組相比，5，10和20 Gy照射48 h組，p-Drp1和p-Mff蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.8 Effect of60Co γ-ray irradiation on levels of phosphorylated dynamin-related protein 1（p-Drp1）and p-mitochondrial fission factor（p-Mff）in HUVECs by Western blotting.HUVECs were radiated for 48 h.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1（p-Drp1）and B1（p-Mff），respectively.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

利用放射療法治療腫瘤是一種常見的治療手段，但在放射治療時，心臟被歸屬為放射不敏感器官，因而心臟的放射損傷并未得到應(yīng)有的重視，而且放射治療導(dǎo)致的心臟并發(fā)癥多發(fā)生在患者進(jìn)行放療很多年以后，已經(jīng)不在隨訪范圍內(nèi)[15]。而且，射線幾乎可以對心臟的所有結(jié)構(gòu)造成損傷，包括心臟瓣膜病、心包疾病、冠脈疾病、心肌病、傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病等[16]，因此放射性心臟損傷的發(fā)生率有低估的可能。目前研究認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞是射線損傷的靶細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，會導(dǎo)致心臟循環(huán)障礙繼發(fā)心肌細(xì)胞的變性及心肌纖維化[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，60Co γ射線照射可對HUVEC造成損傷，加重線粒體分裂，導(dǎo)致顯著的線粒體功能障礙，可能是放射性心臟損傷的重要機(jī)制之一。

本研究結(jié)果顯示，HUVEC受到60Co γ射線照射后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞皺縮，貼壁不牢，細(xì)胞凋亡顯著增多，同時活性氧生成增多，細(xì)胞功能受損；此外，線粒體膜電位下降、線粒體膜通道孔開放增加，顯示放射誘導(dǎo)顯著的線粒體功能障礙。線粒體是制造能量的細(xì)胞器，當(dāng)線粒體功能受損后，細(xì)胞中能量生成減少，會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙；而細(xì)胞功能受損，又會影響線粒體的正常功能。輻射對細(xì)胞損傷的早期作用，有可能是通過線粒體功能紊亂進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

本研究電鏡結(jié)果顯示，照射后HUVEC線粒體內(nèi)部有不同程度的腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，特異性結(jié)構(gòu)脊不清晰；線粒體密度明顯下降，單個線粒體面積、單個線粒體周長和異常線粒體數(shù)量明顯增加，顯示線粒體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。線粒體分裂在維持線粒體穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)線粒體功能中發(fā)揮重要作用[17]。線粒體分裂是線粒體動態(tài)變化的重要特征之一[18]，目前發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)線粒體分裂的主要蛋白分子包括位于細(xì)胞基質(zhì)中的Drp1[19]。線粒體的表面受體，可以招募Drp1，從而使線粒體發(fā)生分裂[19]，目前已知的受體包括 Mff，F(xiàn)is1，MiD49 和 MiD51[20]。本研究結(jié)果顯示，受照后HUVEC中線粒體相關(guān)分裂蛋白p-Drp1和p-Mff表達(dá)水平升高，表明60Co γ射線照射可以促進(jìn)線粒體分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)，加重了線粒體分裂。

本研究結(jié)果顯示，60Co γ射線照射促進(jìn)HUVEC凋亡，ROS生成增多，MMP下降、mPTP開放增加，誘發(fā)了線粒體功能障礙；電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，60Co γ射線照射顯著加重HUVEC線粒體結(jié)構(gòu)損傷，線粒體分裂相關(guān)蛋白表達(dá)增多，促進(jìn)線粒體分裂。提示放射誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞放射損傷的重要機(jī)制，放射誘導(dǎo)的線粒體分裂可能在其中起著重要作用。但本研究仍有很多不足之處，需要進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗得以驗證；輻射誘導(dǎo)的線粒體分裂相關(guān)蛋白變化是如何調(diào)控線粒體分裂以及線粒體功能功能，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。