敲除大麻素Ⅱ型受體影響APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能與激活Pl3K/Akt/mTOR通路有關(guān)

袁蜜蜜，劉坤璐，陳美樺，陳浩正，史敬璞，李 錦，孫家廣，王 勃

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050000；3.邢臺(tái)市人民醫(yī)院麻醉科，河北 邢臺(tái) 054000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病。據(jù)估計(jì)，AD患者占全世界癡呆病例的60%～70%。神經(jīng)源性炎癥是AD發(fā)病早期的一個(gè)重要原因[1]，AD患者中炎癥標(biāo)志物水平升高及與天然免疫功能相關(guān)的AD風(fēng)險(xiǎn)基因的確認(rèn)，均表明神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、調(diào)控神經(jīng)發(fā)生和調(diào)節(jié)突觸功能等方面發(fā)揮重要生理作用[3]。越來越多的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞及其參與的神經(jīng)炎癥在AD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2，4]，且小膠質(zhì)細(xì)胞的不同表型在AD不同發(fā)展階段可發(fā)揮不同的作用[5]，通過調(diào)整AD不同發(fā)展階段不同腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型以改善AD癥狀已成為治療AD的一種策略[2]。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，EC）包括大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid receptor type 1，CB1R）和CB2R、內(nèi)源性大麻素及合成與分解這些化合物的酶[6]。CB2R主要存在于外周循環(huán)免疫細(xì)胞、脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。AD模型小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)炎癥或應(yīng)激損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞CB2R特異性高表達(dá)[7-8]。

本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CB2R激動(dòng)劑JWH-015可通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，參與AD模型小鼠（APP/PS1小鼠）學(xué)習(xí)和記憶能力的改變[9]。本研究用敲除CB2R的APP/PS1小鼠模型探討AD發(fā)病早期CB2R對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響及其可能的分子機(jī)制，并嘗試為AD的早期預(yù)防提供有益線索。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

鼠尾裂解液和DNA Marker，北京博邁德公司；2×Taq PCR Master Mix，美國(guó)ApexBio公司；蛋白激酶K，美國(guó)Merck公司；瓊脂糖，北京擎科生物公司；Star Green safe Nucleic Acid Dye，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)公司；PCR引物，上海生工生物公司；人β淀粉樣蛋白 1-40（amyloid β-protein 1-40，Aβ1-40）和人Aβ1-42ELISA試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；RNA提取試劑盒，德國(guó)Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）預(yù)混液（Power Up SYBR Green Master Mix）試劑盒，美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶公司；Triton-100、Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗）和封片劑（含DAPI），北京中杉金橋公司；兔抗小鼠磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化 Akt（phosphorylated-Akt，p-Akt）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、p-p38 MAPK和β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），美國(guó)CST公司；兔抗小鼠離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）多克隆抗體（一抗），日本W(wǎng)ako公司。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（SLY-WMS），北京碩林苑公司；梯度PCR擴(kuò)增儀（VeritiTM 96-Well Thermal Cycler），美國(guó)Thermo公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96TMOptics Module），美國(guó)Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀（Synergy H1），美國(guó)Bio Tek公司；恒溫冰凍切片機(jī)（CM 1950），德國(guó)萊卡公司；激光共聚焦顯微鏡（LSM 880），德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠（APPswe，PSEN1dE9）和全身性CB2R基因敲除（Cnr2tm1Dgen/J，CB2-/-）小鼠，雄性，體重24～26 g，均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。APP/PS1小鼠與CB2-/-小鼠交配獲得APP/PS1＊CB2-/-小鼠，野生型（wild type，WT）對(duì)照小鼠為C57BL6/J背景下非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠。小鼠由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)繁殖，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～22℃，濕度40%～60%，12/12 h明暗循環(huán)，光照時(shí)間8∶00～20∶00，小鼠每籠5～6只，自由攝食飲水。所有實(shí)驗(yàn)遵循軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.3 小鼠基因型鑒定

小鼠出生約21 d時(shí)，剪下2～3 mm鼠尾，加入鼠尾裂解液、20 g·L-1蛋白激酶K和β-巰基乙醇，55℃水浴過夜。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系包括2×Taq PCR Master Mix，上、下游引物10 μmol·L-1和DNA模板。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min?；蛞镄蛄幸姳?，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增后基因型片段中CB2+/+引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為385 bp的為WT小鼠；CB2-/-引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為550 bp的為CB2-/-小鼠；β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）引物擴(kuò)增長(zhǎng)度約為377 bp，早老素1（presenilin-1，PS1）引物擴(kuò)增長(zhǎng)度約為608 bp，同時(shí)377，385和608 bp 3條電泳條帶均存在的為APP/PS1小鼠；而同時(shí)377，550和608 bp 3條電泳條帶均存在的為APP/PS1＊CB2-/-小鼠。

Tab.1 Primers used in reverse transcription PCR

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)小鼠按照基因型分組，分為WT組、CB2R敲除組（CB2-/-）、模型組（APP/PS1）和模型+CB2R敲除組（APP/PS1＊CB2-/-），每組10只。飼養(yǎng)到4月齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)束行為實(shí)驗(yàn)，各組小鼠在麻醉、生理鹽水灌流后，分別取前額葉皮質(zhì)和海馬腦區(qū)，液氮速凍，-80℃保存，用于組織蛋白和基因表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

連續(xù)5 d，每天4次將小鼠分別從Morris水迷宮4個(gè)象限邊緣中點(diǎn)面壁放入水中，令其自由探索，尋找平臺(tái)。在60 s內(nèi)，若小鼠登上平臺(tái)并停留10 s，視為成功登上平臺(tái)，并記錄潛伏期；若未能成功登上平臺(tái)，則人工將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)，并停留10 s，其潛伏期記錄為60 s。小鼠每天進(jìn)入水迷宮的象限隨機(jī)且不同，計(jì)算每天4次訓(xùn)練的平均潛伏期。第6天時(shí)去除水下平臺(tái)，從第Ⅲ象限將小鼠放入水池內(nèi)，記錄60 s內(nèi)穿過原隱藏平臺(tái)位置的次數(shù)和目標(biāo)象限的停留時(shí)間[10]。

1.6 ELlSA檢測(cè)小鼠前額葉皮質(zhì)和海馬A β含量

取冰凍的腦組織勻漿，4℃，5000×g離心5 min，取上清液，依照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)前額葉皮質(zhì)和海馬中Aβ1-42和Aβ1-40含量。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)小鼠腦內(nèi)炎癥因子IL-6，TNF- α和iNOS mRNA表達(dá)水平

用RNA提取試劑盒提取小鼠前額葉皮質(zhì)和海馬腦區(qū)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)參照預(yù)混液使用說明進(jìn)行，引物序列見表2。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用2-△△Ct法計(jì)算待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.2 Primers used in real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）

1.8 免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉，4%多聚甲醛灌流后取全腦。4%多聚甲醛固定6 h，蔗糖溶液梯度脫水，冰凍切片（厚度20 μm）?？焖倏乖迯?fù)液修復(fù)10 min，PBS洗3次，加兔抗小鼠Iba1抗體（1∶50）4℃孵育過夜，PBST洗3次，加Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶100），室溫避光孵育1 h，PBST洗3次，最后用含DAPI的封片劑封片固定，使用LSM 880激光共聚焦拍照。

1.9 Western印跡法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取小鼠前額葉皮質(zhì)組織提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量，用10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗（抗 PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK、p38 MAPK 和β肌動(dòng)蛋白抗體，稀釋比均為1∶5000）4℃孵育過夜。清洗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶5000），室溫孵育1 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，用Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以磷酸化蛋白條帶與其總蛋白條帶積分吸光度比值表示蛋白磷酸化水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用雙因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖1所示，1和2號(hào)小鼠出現(xiàn)385 bp的特異性條帶，為WT小鼠；3和4號(hào)小鼠出現(xiàn)550 bp的特異性條帶，為CB2-/-小鼠；5和6號(hào)小鼠分別出現(xiàn)377，608和385 bp的特異性條帶，為APP/PS1小鼠；7和8號(hào)小鼠分別出現(xiàn)377，608和550 bp的特異性條帶，為APP/PS1＊CB2-/-小鼠。

Fig.1 Genotype identification of mice by primers of APP（A），PS1（B）and CB2（C）by reverse transcription PCR.M：marker；lanes 1-2：mice of wild type mice；lanes 3-4：mice of CB2-/-mice；lanes 5-6：APP/PS1 mice；lanes 7-8：APP/PS1＊CB2-/-mice.

2.2 CB2R敲除不影響APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，與WT組相比，CB2-/-小鼠潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與APP/PS1組相比，APP/PS1＊CB2-/-小鼠潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此提示，CB2R敲除不影響APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。

Fig.2 Effect of CB2R knockout on escape latency（A），percentage of total time spent in target quadrant（B）and numbers of platform crossing（C）in WT and APP/PS1 mice by Morris water maze test.±s，n=8.

2.3 CB2R敲除升高APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)A β 11--4422含量

ELISA結(jié)果（圖3）顯示，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中Aβ1-42和Aβ1-40含量均顯著升高（P＜0.01）；與 CB2-/-小鼠相比，APP/PS1＊CB2-/-小鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中Aβ1-42和Aβ1-40含量均顯著升高（P＜0.01）；與APP/PS1小鼠相比，APP/PS1＊CB2-/-小鼠前額葉皮質(zhì)中Aβ1-42含量顯著升高（P＜0.05），海馬中Aβ1-42和Aβ1-40含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.3 Effect of CB2R knockout on contents of amyloid β -protein 1-42 （A β1-42） and A β1-40in prefrontal cortex（A）and hippocampus（B）of WT and APP/PS1 mice by ELlSA.x ± s，n=8. ＊＊P＜0.01，compared with WT group；##P＜0.01，compared with CB2-/-group；△ P＜0.05，compared with APP/PS1 group.

2.4 CB2R敲除升高APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)IL-6 mRNA表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果（圖4）顯示，與CB2-/-小鼠相比，APP/PS1＊CB2-/-小鼠前額葉皮質(zhì)IL-6mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與APP/PS1小鼠相比，APP/PS1＊CB2-/-小鼠前額葉皮質(zhì)IL-6mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），海馬IL-6，TNF-α和iNOSmRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.4 Effect of CB2R knockout on mRNA expressions of IL-6，TNF- α and iNOS in prefrontal cortex（A）and hippocampus（B） of WT and APP/PS1 mice by RT-qPCR.±s，n=8.##P＜0.01，compared with CB2-/-group；△P＜0.05，compared with APP/PS1 group.

2.5 CB2R敲除改變APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，WT組小鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，突起呈現(xiàn)較長(zhǎng)的分支狀結(jié)構(gòu)。CB2-/-組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。APP/PS1組小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體較大，突起和分支變短變粗，呈現(xiàn)出阿米巴狀樣形態(tài)。APP/PS1＊CB2-/-組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)有明顯差異，胞體較小，突起明顯以細(xì)、長(zhǎng)分支結(jié)構(gòu)為主。

Fig.5 Effect of CB2R knockout on morphological changes in microglia in prefrontal cortex of WT and APP/PS1 mice by immunofluorescence assay.Green and blue represent Ionized calcium binding adapter molecule 1（Iba1）and DAPI.

2.6 CB2R敲除升高APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)中Pl3K蛋白水平及Akt和mTOR磷酸化水平

Western印跡結(jié)果（圖6）顯示，與WT相比較，CB2-/-組小鼠前額葉皮質(zhì)PI3K蛋白水平及Akt，mTOR，ERK1/2和p38 MAPK蛋白磷酸化水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與CB2-/-組相比，APP/PS1＊CB2-/-組小鼠前額葉皮質(zhì)PI3K蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與 APP/PS1 組相比，APP/PS1＊CB2-/-組PI3K蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），ERK1/2和p38 MAPK蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.6 Effect of CB2R knockout on expression level of phosphoinositide 3 kinase（Pl3K） protein and phosphorylation levels of protein kinase B（Akt），mammalian target of rapamycin（mTOR），extracellular signal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and p38 mitogen-activated protein kinase（p38 MAPK）protein in prefrontal cortex of WT and APP/PS1 mice by Western blotting.A2 and A3 were the semi-quantitative results of A1.B3 was the semi-quantitative result of B1 and B2.±s，n=8.#P＜0.05，##P＜0.01，compared with CB2-/-group；△P＜0.05，compared with APP/PS1 group.

3 討論

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)通過定位航行潛伏期和目標(biāo)象限探索時(shí)間及穿臺(tái)次數(shù)，可以有效評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力[11]，其中涉及到多個(gè)腦區(qū)的共同參與，包括海馬[10-12]和前額葉皮質(zhì)[13]，而海馬腦區(qū)在空間學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果表明，與4月齡APP/PS1小鼠相比，敲除CB2R并未影響APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。但與APP/PS1小鼠相比，4月齡敲除CB2R的APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)Aβ1-42含量明顯升高，Aβ1-40含量也有升高的趨勢(shì)，而海馬腦區(qū)Aβ1-42和Aβ1-40含量無顯著改變，表明CB2R可能與腦內(nèi)Aβ沉積的病理改變有關(guān)，尤其在前額葉皮質(zhì)腦區(qū)更顯著，具有明顯的腦區(qū)特異性。文獻(xiàn)報(bào)道，Aβ1-42和Aβ1-40含量的變化最早發(fā)生在大腦皮質(zhì)[14]，這與本研究結(jié)果一致。因此推測(cè)，在AD早期，CB2R在前額葉皮質(zhì)腦區(qū)的特異性作用不能顯著影響APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。為證明該假設(shè)，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了前額葉皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化。同樣發(fā)現(xiàn)，與APP/PS1小鼠相比，敲除CB2R后APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)IL-6mRNA表達(dá)水平明顯增加，海馬未發(fā)現(xiàn)此變化，進(jìn)一步表明CB2R介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有腦區(qū)特異性。本研究采用免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，4月齡APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞呈阿米巴樣形態(tài)，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致；敲除CB2R后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌有關(guān)，M1表型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，包括介導(dǎo)神經(jīng)毒性的IL-6和TNF-α[16]。因此推測(cè)，在AD早期，CB2R可通過調(diào)節(jié)前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和釋放促炎因子，參與AD神經(jīng)源性炎癥病理過程。

PI3K/Akt/mTOR通路在調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突和軸突延伸、調(diào)節(jié)突觸可塑性及在神經(jīng)退行性疾病中調(diào)控自噬和清除蛋白聚集物方面均發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，AD患者腦內(nèi)PI3K/Akt/mTOR通路處于失調(diào)狀態(tài)，具體表現(xiàn)為顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元Akt活性增加，mTOR在絲氨酸殘基2448位點(diǎn)的磷酸化水平增加[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，4月齡CB2R敲除的APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)中PI3K蛋白水平及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均顯著升高。AD患者腦組織p-ERK1/2活性異常升高可能與AD多方面潛在病理改變有關(guān)，包括Aβ形成、tau蛋白磷酸化和神經(jīng)炎癥[18]。與APP/PS1小鼠相比，4月齡CB2R敲除的APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)p-ERK1/2表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，提示CB2R介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路與MAPK家族中ERK1/2可能相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，6月齡APP/PS1小鼠腦組織中Aβ聚集可進(jìn)一步激活p38 MAPK，p-p38 MAPK可誘導(dǎo)tau過度磷酸化、NF-κB活化、谷氨酸興奮性毒性、突觸可塑性破壞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。但本研究結(jié)果表明，與APP/PS1小鼠相比，4月齡CB2R敲除的APP/PS1小鼠前額葉皮質(zhì)中p-p38 MAPK表達(dá)水平并無顯著性差異，推測(cè)p-p38 MAPK表達(dá)水平可能與APP/PS1小鼠疾病進(jìn)程相關(guān)。

綜上所述，在AD早期，CB2R主要通過影響前額葉皮質(zhì)腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)控腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，其中PI3K/Akt/mTOR通路主要參與CB2R介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥病理改變?；贑B2R發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)源性炎癥的重要作用，本研究可為CB2R作為AD早期預(yù)防炎癥的靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。