嵌合抗原受體-T細(xì)胞治療多發(fā)性骨髓瘤研究進(jìn)展

吳琪琪，郭健敏，梁 純，楊 威，

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541199；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評(píng)價(jià)分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評(píng)價(jià)與研究工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510990；3.香港科技大學(xué)生命科學(xué)部，香港 999077）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種血液系統(tǒng)惡性克隆性漿細(xì)胞疾病，多發(fā)于65～74歲老年人群，全球MM發(fā)病率在2/萬(wàn)～3/萬(wàn)。2020年的數(shù)據(jù)顯示，全球有≥10萬(wàn)MM患者死亡[1]。MM病因尚不完全清楚，但流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，MM的發(fā)生可能與電離輻射、遺傳、基因突變、病毒感染、化學(xué)藥物和環(huán)境變化等因素有關(guān)[2-4]。該病早期較難診斷，多數(shù)MM患者確診時(shí)已為中、晚期，典型的臨床癥狀可表現(xiàn)為骨痛、貧血及肝和脾等免疫器官出現(xiàn)病變等，總生存期為2～3年[5]。近10年來(lái)，隨著蛋白酶體抑制劑、單克隆抗體、免疫調(diào)節(jié)藥物和組蛋白去乙酰化酶抑制劑等藥物的問(wèn)世，使得MM的治療有了很大進(jìn)展[6-8]。但MM患者往往因耐藥而復(fù)發(fā)，致使MM復(fù)雜難治，至今無(wú)法完全治愈。因此，尋找更有效、更具特異性且藥效更持久的MM治療藥物尤為重要。

嵌合抗原受體-T細(xì)胞（chimericantigenreceptor-T cells，CAR-T細(xì)胞）免疫療法是指將患者外周血中分離出的T細(xì)胞，通過(guò)基因工程技術(shù)改造成表面攜帶有特定跨膜受體CAR的T細(xì)胞，經(jīng)體外大量擴(kuò)增后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以特異性激活T細(xì)胞增殖，并迅速招募更多的免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷[9-10]。目前，該療法是一種非常有潛力的治療難治性和復(fù)發(fā)性惡性血液腫瘤的輔助手段。近10年間，靶向CD19的自體CAR-T細(xì)胞免疫療法相繼成功應(yīng)用于急性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等血液腫瘤的臨床治療[11-12]，使得該療法倍受關(guān)注。該療法用于MM治療最理想的方式是使目標(biāo)抗原能夠精準(zhǔn)地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，而正常細(xì)胞或組織不表達(dá)。因此篩選最為合適的靶點(diǎn)可為臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持。

1 CAR的結(jié)構(gòu)與發(fā)展

CAR是CAR-T細(xì)胞中最核心的結(jié)構(gòu)，是一種合成的融合蛋白，由細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)合域〔通常指抗原特異性單鏈可變片段（single chain variable fragment，scFv）〕、細(xì)胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。隨著CAR結(jié)構(gòu)發(fā)展，除細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域除T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域（CD3 ζ）外，還可添加不同的共刺激域（如4-1BB和CD28）和（或）蛋白分子（如細(xì)胞因子）激活信號(hào)區(qū)。當(dāng)表達(dá)CAR的T細(xì)胞在體內(nèi)與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合后，特異性激活T細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子和趨化因子。CAR-T細(xì)胞還可改變T細(xì)胞活化之后的作用方向，靶向性地對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性免疫監(jiān)視[13]。其中，CAR的scFv還可被受體胞外區(qū)取代，也可被與受體結(jié)合的配體所取代，目前已報(bào)道的結(jié)構(gòu)包括自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK細(xì)胞）活化型受體NKG2D（NK cell group 2D）、白細(xì)胞介素13（interleukin-13，IL-13）和整合素αvβ6結(jié)合肽等。

T細(xì)胞活化在機(jī)體免疫應(yīng)答中最為關(guān)鍵，T細(xì)胞增殖、分化為效應(yīng)T細(xì)胞至發(fā)揮免疫效應(yīng)這一過(guò)程除需抗原特異性信號(hào)外，還需共刺激信號(hào)。T細(xì)胞通過(guò)TCR識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）表面的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）傳遞抗原特異性識(shí)別信號(hào)。共刺激信號(hào)主要由T細(xì)胞和APC表面的共刺激配體（如B7配體）與共刺激因子受體（如CD28）以非共價(jià)鍵形成復(fù)合體，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生，參與機(jī)體免疫識(shí)別、應(yīng)答和清除。腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)抑制MHC達(dá)到自我保護(hù)，并通過(guò)抑制APC對(duì)T細(xì)胞的激活實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。而CAR-T細(xì)胞可通過(guò)scFv直接識(shí)別并傳遞抗原特異性信號(hào)，且第2代以后的CAR結(jié)構(gòu)中帶有刺激復(fù)合體，可使T細(xì)胞快速分化后發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)。整個(gè)過(guò)程不涉及MHC呈遞抗原的環(huán)節(jié)，因此具有很強(qiáng)的特異性，這是其突出的優(yōu)點(diǎn)之一。

雖然CAR-T細(xì)胞免疫療法已取得一定進(jìn)步，但CAR-T細(xì)胞體內(nèi)持續(xù)增殖、腫瘤識(shí)別能力和安全性等方面仍需進(jìn)一步完善。隨著結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的不斷改進(jìn)，CAR已發(fā)展到第5代（表1）。1989年Gross等[14]首次提出CAR的概念，證實(shí)CAR結(jié)構(gòu)與抗體的相似性，將表達(dá)特定抗體的基因嵌入細(xì)胞毒性T細(xì)胞，使T細(xì)胞可以識(shí)別半抗原2，4，6-三硝基苯基，以非MHC限制的活化方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。在此基礎(chǔ)上，研究者們構(gòu)建了第1代CAR。第1代CAR只有1個(gè)胞內(nèi)信號(hào)分子CD3 ζ激活T細(xì)胞，雖然也可引起細(xì)胞毒性，但由于信號(hào)強(qiáng)度很弱，在體內(nèi)持續(xù)擴(kuò)增有限。第2代CAR由Gong等[15]和Imai等[16]提出，是在第1代CAR的基礎(chǔ)上增加1種共刺激信號(hào)，如CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子（inducible T-cell costimulator）和DNAX激活蛋白10（DNAX-activated protein 10）。與第1代相比，第2代CAR可顯著刺激T細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。第三代CAR則是在第2代的基礎(chǔ)上增加≥2個(gè)共刺激信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)效果[17]。第4代CAR則是在第3代的基礎(chǔ)上增加編碼CAR以及啟動(dòng)子的載體，使得CAR表達(dá)相關(guān)功能性轉(zhuǎn)基因蛋白[18]，使其可釋放IL-12和IL-18等細(xì)胞因子、分泌干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、顆粒酶B（granzyme B）和穿孔素（perforin）等效應(yīng)因子，并招募NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞以殺傷腫瘤細(xì)胞。通用型CAR除同時(shí)激活TCR、共刺激域和細(xì)胞因子三重信號(hào)[19]，還可通過(guò)解除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制效應(yīng)、插入安全開(kāi)關(guān)以達(dá)到減少脫靶效應(yīng)的目的。

表1 嵌合抗原受體-T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）中5代CAR的主要結(jié)構(gòu)

2 CAR-T細(xì)胞免疫療法治療MM的靶點(diǎn)和應(yīng)用

決定CAR-T細(xì)胞療效和持續(xù)性的關(guān)鍵因素之一是靶抗原的選擇[20]。治療MM的靶抗原需考慮兩方面：一是具有靶向性和特異性，二是不表達(dá)于正常組織。雖然尚未發(fā)現(xiàn)可用來(lái)高度特異性識(shí)別MM的理想抗原，但目前全球已有較多針對(duì)MM各類靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞正進(jìn)行非臨床和臨床研究，如靶向B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）、CD38、CD138、免疫球蛋白κ輕鏈、CD319、CD56和NKG2D的研究，其中以靶向BCMA的研究最多。

2.1 靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞

BCMA是來(lái)自腫瘤壞死因子超家族17的跨膜蛋白，是一種在骨髓瘤、漿母細(xì)胞和終末分化的漿細(xì)胞表面高度選擇性表達(dá)的特異性抗原，不表達(dá)于其他正常組織和重要器官表面。有研究表明，BCMA在MM患者惡性漿細(xì)胞中高表達(dá)，在多個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的MM靶點(diǎn)中，僅BCMA表達(dá)在進(jìn)展的MM中處于上調(diào)狀態(tài)[21-22]，這使得BCMA成為治療MM藥物研發(fā)的一大熱點(diǎn)。據(jù)病情惡化程度，MM可分為意義未明單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathies of un-determined significance）、冒煙型骨髓瘤（smoldering myeloma）和MM。有研究表明，BCMA在漿細(xì)胞上的表達(dá)水平與MM病情的惡化程度成正比，MM的發(fā)展與漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞BCMA表達(dá)升高有關(guān)[23-24]。因此，BCMA水平可作為MM患者預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。

Ali等[25]構(gòu)建了帶有鼠源性BCMA抗體和CAR的CAR-T細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后輸注至MM荷瘤小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，鼠源CAR-T細(xì)胞可識(shí)別小鼠MM細(xì)胞的BCMA，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。在首次人臨床試驗(yàn)中，Brudno等[26]用人源BCMA單克隆抗體并以γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒為轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞，進(jìn)行Ⅰ期臨床研究。該研究納入26例復(fù)發(fā)性或難治性多發(fā)性骨髓瘤（relapsed or refractory MM，R/R MM）患者，10例接受低劑量治療（0.3×106細(xì)胞·kg-1），16例接受高劑量治療（9.0×106細(xì)胞·kg-1），給藥前均服用環(huán)磷酰胺等化療藥物。其中，低劑量組有8例病情得到控制，2例得到部分緩解和暫時(shí)性部分緩解。高劑量組有1例獲得完全緩解（complete remission，CR）；1例短期病情雖得到控制，但預(yù)后不佳，于66周后復(fù)發(fā)而死亡。由美國(guó)藍(lán)鳥生物公司（Bluebird Bio）和美國(guó)新基醫(yī)藥（Celgene）公司共同研發(fā)的靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞 bb2121（idecabtagene vicleucel，ide-cel）和bb21217均具有明顯的抗MM效果，兩者在非臨床試驗(yàn)中動(dòng)物生存率均高達(dá)100%。在bb2121的Ⅰ期臨床研究中，接受高劑量（1.5×107細(xì)胞·kg-1）治療的18例MM患者中有17例癥狀明顯緩解，其中7例達(dá)到CR，3例達(dá)到未經(jīng)確認(rèn)的CR[27]。bb21217是在離體的條件下對(duì)bb2121產(chǎn)品進(jìn)行改造，使用與bb2121相同的CAR結(jié)構(gòu)，在磷脂酰肌醇3激酶抑制劑bb007存在的情況下在體外進(jìn)行CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)。隨后進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，12例MM患者總體有效率為83%，CR為40%[28]。在由南京傳奇生物科技公司設(shè)計(jì)的西達(dá)基侖賽（ciltacabtagene autoleucel，cilta-cel）注射液的Ⅱ期臨床研究中招募了97例MM患者，給藥前均使用環(huán)磷酰胺去除淋巴細(xì)胞，給藥客觀緩解率（objective response rate，ORR）達(dá)到97%，67%獲得CR[29]；在隨訪的8個(gè)月內(nèi)，20%患者復(fù)發(fā)，僅1例患者發(fā)生神經(jīng)毒性。在抗人BCMA CAR-T細(xì)胞注射液（上海恒潤(rùn)達(dá)生物科技公司設(shè)計(jì)）Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究中納入20例MM患者，ORR為85%，CR為45%[30]。在CT053（上?？茲?jì)生物醫(yī)藥公司設(shè)計(jì)）Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究中納入17例MM患者，ORR為87.5，CR為79.2%[31]。

構(gòu)建CAR-T細(xì)胞最常用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體，但技術(shù)難度大，耗時(shí)長(zhǎng)，基因片段長(zhǎng)度有限，同時(shí)還存在安全性風(fēng)險(xiǎn)。而非病毒載體可克服上述困難，在CAR分子構(gòu)建中逐漸受到重視。P-BCMA-101是2019年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）獲批臨床的靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞，通過(guò)非病毒載體轉(zhuǎn)座子piggy-BAC電轉(zhuǎn)系統(tǒng)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，由CD3 ζ或4-1BB信號(hào)結(jié)構(gòu)域與非免疫球蛋白centyrin支架組成，優(yōu)點(diǎn)是親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性高和不需病毒載體，生產(chǎn)工藝相比病毒轉(zhuǎn)染更方便且高效，可顯著延長(zhǎng)CAR-T細(xì)胞的持久性。從其Ⅰ期臨床研究報(bào)道可見(jiàn)，23例MM患者在試驗(yàn)結(jié)束后未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）和神經(jīng)毒性，總體有效率為63%[32]。2015-2020年共有640例MM患者接受了不同靶向BCMA CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)，平均ORR為80.5%，CR為44.8%，無(wú)進(jìn)展生存期為12.2個(gè)月，CRS發(fā)生率為80.3%，神經(jīng)毒性發(fā)生率為10.5%[33]。相較于其他靶點(diǎn)，臨床上靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞治療MM和R/R MM的療效和安全性數(shù)據(jù)較好，抗腫瘤活性高，不良反應(yīng)發(fā)生率低[34]。BCMA是較為理想的MM治療靶點(diǎn)，但BCMA表達(dá)降低或丟失仍不可避免地導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸。因此，藥物研發(fā)過(guò)程中提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性和靶點(diǎn)特異性是對(duì)抗MM復(fù)發(fā)的難點(diǎn)。

2.2 靶向CD38的CAR-T細(xì)胞

CD38，又稱環(huán)腺苷二磷酸核糖水解酶，是一種在惡性B細(xì)胞上高度表達(dá)的Ⅱ型跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附[35]。有研究表明，CD38不僅在正常漿細(xì)胞和MM細(xì)胞上表達(dá)，在正常淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞及一些非造血組織上亦有表達(dá)[36]，這種“非腫瘤靶向”使得自身免疫反應(yīng)加劇。CD38作為MM的一種重要靶抗原，可在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生免疫抑制作用，將促炎環(huán)境轉(zhuǎn)化為含有腺苷的抗炎環(huán)境從而促進(jìn)MM細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，在靶向CD38的CAR-T細(xì)胞研發(fā)中需進(jìn)一步改進(jìn)，降低其毒性反應(yīng)。在一項(xiàng)非臨床研究中，靶向CD38的CAR-T細(xì)胞可在體外殺傷MM細(xì)胞，且在MM荷瘤免疫缺陷小鼠體內(nèi)也觀察到較強(qiáng)的抗腫瘤作用[37]。臨床研究中，CD38單靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞主要用于治療R/R MM，也有用于聯(lián)合BCMA等多靶個(gè)靶點(diǎn)組合治療的報(bào)道[38]。

2.3 靶向CD138的CAR-T細(xì)胞

CD138是一種在漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白，又稱為黏結(jié)蛋白聚糖1，與細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。與CD38相同，CD138不僅在MM細(xì)胞上高表達(dá)，在正常T細(xì)胞上亦有表達(dá)，因此也具有“非腫瘤靶向”的特點(diǎn)。CD138高表達(dá)一般表現(xiàn)在MM復(fù)發(fā)期和進(jìn)展期，在早期表達(dá)較少，因此CD138可作為MM的基本診斷指標(biāo)，監(jiān)測(cè)MM的進(jìn)展。Kawano等[39]于2016年首次使用靶向CD138 CAR-T細(xì)胞治療5例MM患者，其中4例得到緩解，且治療3個(gè)月后經(jīng)復(fù)查均能從患者骨髓和血液中檢測(cè)到CD138，治療過(guò)程中無(wú)明顯的毒性反應(yīng)，僅出現(xiàn)輕微的CRS。

2.4 靶向免疫球蛋白κ輕鏈的CAR-T細(xì)胞

免疫球蛋白κ和λ輕鏈通常在正常B淋巴細(xì)胞和大多數(shù)淋巴細(xì)胞瘤的表面同時(shí)表達(dá)，當(dāng)B淋巴細(xì)胞惡化時(shí)，則只表達(dá)單一的κ輕鏈或λ輕鏈。Ramos等[40]設(shè)計(jì)了一種作用于κ輕鏈的CAR，可選擇性識(shí)別MM細(xì)胞上的κ輕鏈，從而殺傷MM細(xì)胞而不傷害其他正常組織或細(xì)胞。目前他們?cè)O(shè)計(jì)的該靶向免疫球蛋白κ輕鏈的CAR-T細(xì)胞進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，7例MM患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，病情穩(wěn)定且可持續(xù)2～17個(gè)月。但免疫球蛋白κ輕鏈在MM細(xì)胞上表達(dá)較弱，因此在研發(fā)中需著重提高對(duì)MM細(xì)胞上免疫球蛋白κ輕鏈的靶向性。

2.5 靶向CD319的CAR-T細(xì)胞

CD319，也稱CS1或淋巴細(xì)胞激活信號(hào)家族成員 F7（signaling lymphocytic activation molecule family member 7，SLAMF7），是一種作用于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，在漿細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中高表達(dá)[41]。SLAMF7是MM中正常漿細(xì)胞和惡性漿細(xì)胞的標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定，且可以此為生物標(biāo)志物在低溫環(huán)境下從MM患者樣品中分離出惡性漿細(xì)胞。早期研究發(fā)現(xiàn)，SLAMF7與NK細(xì)胞黏附有關(guān)，通過(guò)與NK細(xì)胞相互作用，不僅可殺傷MM細(xì)胞，且還可持續(xù)活化NK細(xì)胞，從而產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫力[42]。由于其在NK細(xì)胞和T細(xì)胞上均有表達(dá)，因此在靶向SLAMF7的CAR-T中需采用基因敲除技術(shù)避免NK細(xì)胞和T細(xì)胞“自相殘殺”[43]。Wang等[44]設(shè)計(jì)了2種分別靶向BCMA和SLAMF7的CAR-T細(xì)胞，兩者均對(duì)MM細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用。因此，SLAMF7可能是繼BCMA后又一理想的MM治療靶點(diǎn)。

2.6 靶向CD56的CAR-T細(xì)胞

CD56是一種跨膜糖蛋白，正常漿細(xì)胞無(wú)表達(dá)，僅在骨髓瘤細(xì)胞上表達(dá)，可介導(dǎo)MM細(xì)胞的歸巢，在MM治療中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因此其可能成為MM治療的潛在靶點(diǎn)。由于CD56在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)與神經(jīng)毒性有關(guān)，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞黏附，因此也稱為神經(jīng)細(xì)胞黏附因子。在一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，靶向CD56的CAR-T細(xì)胞雖在37例R/R MM患者中顯示出抗MM活性，但約50%患者出現(xiàn)神經(jīng)毒性[45]。雖然CD56可用以監(jiān)測(cè)MM的進(jìn)展，但仍有小部分MM患者不表達(dá)CD56，所以現(xiàn)階段臨床上主要將CD56與BCMA等靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合，提高M(jìn)M治療的靶向性。

2.7 靶向NKG2D的CAR-T細(xì)胞

NKG2D也是MM治療的一個(gè)熱門靶點(diǎn)。NKG2D基因主要位于NK基因復(fù)合體，可表達(dá)于人和小鼠NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及其他免疫活性細(xì)胞，但通常不表達(dá)于CD4+T細(xì)胞[46]。它作為一種激活性受體可活化免疫細(xì)胞，殺傷靶細(xì)胞。MM患者的CD8+T細(xì)胞NKG2D表達(dá)明顯高于健康人群。NKG2D在CD8+T細(xì)胞中發(fā)揮共刺激分子的作用，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能，其表達(dá)水平可作為MM患者病情進(jìn)展和預(yù)后間接預(yù)測(cè)因子。Baumeister等[47]評(píng)估了靶向NKG2D的CAR-T細(xì)胞1×106，3×106，1×107和3×107細(xì)胞·kg-1共4個(gè)劑量的安全性，該試驗(yàn)共有12例患者，包括5例MM患者和7例急性髓系白血病患者，在治療過(guò)程中未觀察到嚴(yán)重毒性，未出現(xiàn)CRS反應(yīng)，提示該靶點(diǎn)相比于其他靶點(diǎn)更具潛力。

3 CAR-T細(xì)胞免疫療法的不良反應(yīng)

3.1 細(xì)胞因子釋放綜合征

CRS是由于CAR-T細(xì)胞被過(guò)度激活和增殖，從而招募T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，通過(guò)釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子使腫瘤細(xì)胞大量凋亡，同時(shí)過(guò)量的細(xì)胞因子被釋放入血而引發(fā)的嚴(yán)重全身性炎癥反應(yīng)。

CRS是CAR-T細(xì)胞治療血液腫瘤的一種主要且最常見(jiàn)的不良反應(yīng)，多發(fā)生在CAR-T細(xì)胞回輸后1～3周內(nèi)[48]，嚴(yán)重者可危及生命。治療初期主要表現(xiàn)為發(fā)熱、惡心或肌肉酸痛，隨后可迅速發(fā)展為低血壓、器官受損或呼吸困難。多項(xiàng)研究表明，IL-6是引起CRS的主要細(xì)胞因子，IFN-γ、腫瘤壞死因子α、IL-1β和IL-2等細(xì)胞因子水平明顯升高也與嚴(yán)重CRS密切相關(guān)。其中IFN-γ又可通過(guò)進(jìn)一步激活單核巨噬細(xì)胞，分泌腫瘤壞死因子α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10等細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[49]。目前臨床重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的細(xì)胞因子主要有IL-6和IFN-γ。CRS的嚴(yán)重程度也與患者腫瘤類型、體內(nèi)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷量和CAR-T細(xì)胞輸注量相關(guān)，腫瘤負(fù)荷大的患者血清中IL-6和IFN-γ等細(xì)胞因子升高更為明顯[50]。2018年美國(guó)血液與骨髓移植學(xué)會(huì)上，將CRS按臨床不良反應(yīng)（如發(fā)熱、低血壓和低氧血癥）及臨床指標(biāo)（如體溫、IL-7、C反應(yīng)蛋白和鐵蛋白等水平）進(jìn)行分級(jí)，各級(jí)臨床表現(xiàn)和治療方法見(jiàn)表2。低血壓患者用藥需根據(jù)CRS嚴(yán)重程度調(diào)整，必要時(shí)需使用IL-6抑制劑〔如托利珠單抗（tocilizumab）和司妥昔單抗（siltuximab）〕或糖皮質(zhì)激素治療[51]。但在臨床上如何最大程度降低CRS導(dǎo)致的不良反應(yīng)，延長(zhǎng)患者生存率，仍是CAR-T細(xì)胞免疫療法研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

表2 CAR-T細(xì)胞免疫療法中細(xì)胞因子釋放綜合征的臨床分級(jí)、臨床表現(xiàn)和治療方法

3.2 巨噬細(xì)胞活化綜合征

在系統(tǒng)性炎癥疾病中，巨噬細(xì)胞活化綜合征是一種潛在威脅患者生命的并發(fā)癥[52]，又稱噬血性淋巴組織細(xì)胞增生癥。CRS和巨噬細(xì)胞活化綜合征存在一定的相似性，原因是CRS的促炎細(xì)胞因子主要來(lái)源于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。一項(xiàng)人源化小鼠CRS模型研究表明，CAR-T細(xì)胞可誘導(dǎo)、招募大量單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，產(chǎn)生IL-6、IL-1β和一氧化氮等炎癥因子[53]。另一項(xiàng)CRS機(jī)制研究表明，當(dāng)CAR-T細(xì)胞特異性接觸腫瘤細(xì)胞表面時(shí)可募集免疫細(xì)胞釋放顆粒酶B和穿孔素等效應(yīng)因子，通過(guò)激活胱天蛋白酶3/胃泌素E信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡，而焦亡的細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)、招募大量免疫細(xì)胞（如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）釋放促炎細(xì)胞因子，從而引發(fā)CRS。人體自身T細(xì)胞不引起胱天蛋白酶3/胃泌素E信號(hào)通路激活[54]。因此，與人體自身T細(xì)胞相比，CAR-T細(xì)胞在獲得更多炎癥因子殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，更需關(guān)注其安全性問(wèn)題。

3.3 神經(jīng)毒性

神經(jīng)毒性，也稱免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS），是CAR-T細(xì)胞免疫治療過(guò)程中的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，癥狀嚴(yán)重者可危及生命。其臨床表現(xiàn)為頭痛、表達(dá)性失語(yǔ)、意識(shí)障礙、癲癇或腦部水腫等。2019年，美國(guó)移植與細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ASTCT）共識(shí)將其定義為：經(jīng)過(guò)任何免疫治療后可能涉及到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理過(guò)程。這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性或輸注后的T細(xì)胞及其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活[55]，其機(jī)制仍不明確，但該癥狀與CRS相關(guān)。與神經(jīng)毒性相關(guān)的促炎細(xì)胞因子不僅在血液中產(chǎn)生，在腦脊液中也會(huì)大量存在。因此，炎癥因子可能會(huì)被動(dòng)擴(kuò)散于大腦，這將導(dǎo)致炎癥因子急劇升高，造成內(nèi)皮損傷、增加血管通透性及破壞血腦屏障。血腦屏障通透性增加則被認(rèn)為是腦脊液細(xì)胞因子水平升高的主要原因[56]。

近年來(lái)，許多研究機(jī)構(gòu)采用神經(jīng)毒性分級(jí)系統(tǒng)（CARTOX-10）對(duì)神經(jīng)毒性進(jìn)行分級(jí)。該系統(tǒng)主要用于監(jiān)測(cè)與評(píng)估認(rèn)知功能，如言語(yǔ)、辨認(rèn)方向和書寫等（表3）。雖然IL-6抑制劑可以緩解CRS的癥狀，但由于抗體藥物難以透過(guò)血腦屏障，臨床上通常給予≥2級(jí)ICANS患者糖皮質(zhì)激素（地塞米松）緩解癥狀，緩解過(guò)程中出現(xiàn)癲癇時(shí)首選左乙拉西坦（levetiracetam）；伴顱內(nèi)壓升高的3級(jí)ICANS患者常聯(lián)合給予糖皮質(zhì)激素和乙酰唑胺（acetazolamide）；出現(xiàn)4級(jí)且腦水腫的ICANS患者則給予大劑量糖皮質(zhì)激素、機(jī)械通氣及脫水藥物治療。有研究表明，IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（anakinra）有抑制CRS和神經(jīng)毒性的作用[57]。

表3 CAR-T細(xì)胞免疫療法中相關(guān)腦病綜合征系統(tǒng)分級(jí)、評(píng)估分?jǐn)?shù)、臨床表現(xiàn)和治療方法

3.4 脫靶效應(yīng)

CAR-T細(xì)胞在特異性靶向腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體其他的正常組織造成殺傷，這種現(xiàn)象被稱為脫靶效應(yīng)（off-target effect）。因此，在CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中，首先需要考慮腫瘤特異性抗原的選擇，保證正常組織或細(xì)胞不被殺傷，這就需要足夠的可特異性識(shí)別APC表面抗原的CAR-T細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)下調(diào)或可逆性地丟失其表面抗原，從而逃脫CAR-T細(xì)胞攻擊，尤其是在實(shí)體瘤中，腫瘤微環(huán)境的存在導(dǎo)致該情況更為顯著，使得CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的應(yīng)用面臨更艱難的挑戰(zhàn)[58]。Ahmed 等[59]研究表明，具有低親和力的scFv及低劑量的CAR-T細(xì)胞可最大程度地降低對(duì)正常組織或細(xì)胞毒性，但抗腫瘤活性相對(duì)較低。因此，尋找合適的靶抗原非常重要。

3.5 T細(xì)胞耗竭

T細(xì)胞耗竭是指在T細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于持續(xù)性抗原的過(guò)程中，T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞逐漸失去效應(yīng)功能，直至T細(xì)胞功能完全喪失。因此，T細(xì)胞耗竭是癌癥患者免疫功能障礙的主要因素之一。一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究表明，耗竭的T細(xì)胞功能降低，使CAR-T細(xì)胞的療效受到限制。在慢性感染性疾病患者或長(zhǎng)期癌癥患者的T細(xì)胞中，常見(jiàn)許多典型的耗竭生物標(biāo)志物高表達(dá)[60]。對(duì)健康小鼠和T細(xì)胞耗竭小鼠的基因組進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，兩者的基因表達(dá)模式具有顯著差異：T細(xì)胞耗竭小鼠出現(xiàn)了T細(xì)胞表達(dá)活性失衡的現(xiàn)象，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的關(guān)鍵原因在于一種可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的主要基因c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）。該研究揭示了JNK表達(dá)降低也會(huì)抑制T細(xì)胞活性[61]。因此，T細(xì)胞耗竭也是CAR-T細(xì)胞免疫治療中出現(xiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)之一。

4 治療MM的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品審批進(jìn)展

截至2022年6月，全球共有8款CAR-T細(xì)胞上市，分別為KYMRIAH、YESCARTA、TECARTUS、BREYANZI、ABECMA、瑞基奧侖賽（relmacabtagene antoleucel，relma-cel）注射液、西達(dá)基侖賽（clitacabtagent autoleucel，cilta-cel）注射液和阿基侖賽（axicabtagent ciloleucellnjection，axi-cel）注射液，其中靶向BCMA的ABECMA和西達(dá)基侖賽注射液用于治療MM，目前已獲美國(guó)FDA和歐盟批準(zhǔn)上市。伊基倫賽注射液是國(guó)內(nèi)首款靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，目前已納入國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心優(yōu)先審評(píng)品種公示。

ABECMA于2021年3月獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，是全球首個(gè)獲批靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞，適應(yīng)證為接受≥3次化療后的R/R MM成人患者。在一項(xiàng)128例R/R MM患者Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，總緩解率為73%，完全緩解率為33%[62]。

西達(dá)基侖塞注射液是Janssen（楊森）和傳奇生物共同研發(fā)的靶向BCMA的CAR-T細(xì)胞，在2020年底提交美國(guó)FDA上市申請(qǐng)，并于2022年2月正式獲批上市，是全球首款由中國(guó)企業(yè)參與研發(fā)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的CAR-T細(xì)胞，適應(yīng)證為R/R MM成人患者。為期18個(gè)月的臨床隨訪數(shù)據(jù)顯示，總緩解率高達(dá)97%，完全緩解率為80%[63]。目前西達(dá)基侖賽注射液已在國(guó)內(nèi)提交上市申請(qǐng)，尚未獲批。

截至2022年6月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心共受理＞160項(xiàng)細(xì)胞治療產(chǎn)品的申請(qǐng)。在受理的94款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中，用于MM治療的有11項(xiàng)（表4）。

表4 國(guó)內(nèi)治療MM CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品受理和獲批情況（截至2022年6月6日）

5 展望

CAR-T細(xì)胞免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得非常顯著的療效。大量臨床試驗(yàn)研究結(jié)果表明，CAR-T細(xì)胞在MM治療中具有很好的臨床應(yīng)用前景。臨床上應(yīng)用CAR-T細(xì)胞聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑等靶向藥物可進(jìn)一步提高療效。在給予靶向SLAM7 CAR-T細(xì)胞的同時(shí)，與來(lái)那度胺（lenalidomide）聯(lián)用可明顯提高CAR-T細(xì)胞對(duì)MM患者的抗腫瘤活性[64]，CAR-T細(xì)胞可在MM患者體內(nèi)存活3～6個(gè)月，且持續(xù)對(duì)腫瘤細(xì)胞造成殺傷。但由于MM患者年齡、疾病狀態(tài)可能會(huì)潛在地影響T細(xì)胞活性和數(shù)量，這為CAR-T細(xì)胞質(zhì)量和治療作用增加很多阻礙。有研究表明，患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)量與持久性呈正比趨勢(shì)[65]。目前提高T細(xì)胞活性的方法主要是通過(guò)擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞數(shù)量以保證其持續(xù)性、減少其凋亡速度并促進(jìn)細(xì)胞因子釋放。例如，bb2121是通過(guò)增加磷脂酰肌醇3激酶抑制劑bb007[66]，使機(jī)體CAR-T細(xì)胞中記憶T細(xì)胞數(shù)量增多且療效持久。多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞免疫療法是通過(guò)聯(lián)合、串聯(lián)CAR-T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞在同一表達(dá)載體上共表達(dá)。相比于單靶點(diǎn)，多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞可降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，增加持久性，因此多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞免疫療法亦備受關(guān)注。

盡管CAR-T細(xì)胞免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得顯著療效，為患者帶來(lái)了更多的選擇和希望，但仍存在安全性和可控性等難題，至今其回輸人體后產(chǎn)生的毒性反應(yīng)導(dǎo)致患者耐藥而腫瘤復(fù)發(fā)、甚至死亡機(jī)制尚未明確。其中，CRS是最主要也是最危險(xiǎn)的不良反應(yīng)，在早期安全性評(píng)價(jià)中，對(duì)于IL-6和IFN-γ等重要典型的細(xì)胞因子水平需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。為使患者不良反應(yīng)最小化，研究者們通過(guò)插入“自殺基因”和“安全開(kāi)關(guān)”及使用抗粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子單抗和強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）（doxycycline）等方式提高CAR-T細(xì)胞免疫療法的有效性和可控性，使得在MM治療過(guò)程中CRS癥狀得到控制[67]。由于患者個(gè)體化差異大且CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品制備周期長(zhǎng)，因此對(duì)于CAR-T輸注風(fēng)險(xiǎn)以及CAR-T細(xì)胞質(zhì)量及其控制是患者能否得到及時(shí)并有效治療的最大阻礙。因此開(kāi)發(fā)異體通用型CAR-T細(xì)胞顯得非常必要。異體通用型CAR-T細(xì)胞是異體移植，因此還需考慮機(jī)體宿主排斥反應(yīng)。目前主要通過(guò)敲除異體TCR和MHC基因等方法消除患者對(duì)于異體通用型CAR-T細(xì)胞的排異反應(yīng)[68]。

CAR-T細(xì)胞是一類特殊藥品，其產(chǎn)品供應(yīng)模式和安全性風(fēng)險(xiǎn)與傳統(tǒng)藥物存在顯著區(qū)別，至今仍無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)制備方式和理想的治療方案。目前CAR-T細(xì)胞免疫療法的發(fā)展仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如患者來(lái)源的T細(xì)胞如何標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；如何實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)制備過(guò)程自動(dòng)化，降低生產(chǎn)周期；如何實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)及藥物監(jiān)管部門如何做好監(jiān)管工作等。因此，對(duì)于實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化生產(chǎn)及質(zhì)量、療效和風(fēng)險(xiǎn)可控仍是目前的首要任務(wù)。阿基侖賽注射液和瑞基奧侖賽注射液在國(guó)內(nèi)上市，表明在MM治療中，越來(lái)越多的CAR-T細(xì)胞免疫療法已被國(guó)內(nèi)接納。由于CAR-T細(xì)胞免疫療法已在急性淋巴白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療方面取得了重大成就，期待不久的將來(lái)，CAR-T細(xì)胞免疫療法也能為MM患者帶來(lái)福音。