牛印記基因的研究進(jìn)展

王丁香，趙紅波

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250000)

基因組印記是來(lái)自父方和母方的等位基因通過(guò)精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生DNA甲基化和組蛋白乙?；刃揎?，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達(dá)特性，是一種不遵循孟德?tīng)柖傻倪z傳學(xué)現(xiàn)象。印記基因在染色體上呈簇狀分布且高度保守。目前，印記基因的研究主要集中在人和小鼠中，被鑒定的印記基因超過(guò)200個(gè)，而牛上印記基因的研究相對(duì)較少。本研究概括了印記基因的特點(diǎn)及其對(duì)牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為牛的印記基因研究提供參考。

1 牛印記基因表達(dá)的特點(diǎn)

印記基因主要特點(diǎn)可以概括為：(1)單等位基因表達(dá)，相鄰基因具有相反印記作用模式。(2)富含CpG島，易于被高度甲基化修飾。(3)成簇排列，具有差異甲基化區(qū)。鄰近的兩個(gè)基因在印記簇中心往往交互印記。(4)大多通用，即在鼠中發(fā)現(xiàn)的印記基因大部分在其它哺乳動(dòng)物也表現(xiàn)出印記特征。(5)與個(gè)體發(fā)育階段密切相關(guān)。(6)具有組織特異性，即基因只在特定的組織表現(xiàn)出印記作用。(7)與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及胎盤(pán)的功能有關(guān)，一般父源基因表達(dá)促進(jìn)生長(zhǎng)，母源基因表達(dá)抑制生長(zhǎng)。因此，印記基因?qū)?dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

1.1 通過(guò)單等位基因的表達(dá)鑒定印記基因

當(dāng)基因在組織中被檢測(cè)到呈現(xiàn)單等位基因表達(dá)時(shí)，就可以確定該基因在組織中是印記基因，相反，當(dāng)基因呈現(xiàn)非單等位基因表達(dá)時(shí)，則該基因?yàn)榉怯∮浕?。印記基因鑒定的主要方法就是核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測(cè)。Li等人發(fā)現(xiàn)環(huán)指蛋白3(makorinringfingerprotein3，MKRN3)、黑色素瘤抗原樣基因2(melanomaantigen-likegene2，MAGEL2)和黑色素瘤抗原(Necdin，NDN)基因在牛的組織中呈單等位基因表達(dá)[1]。Dong等人發(fā)現(xiàn)重組人RWD域蛋白(impactRWDdomainprotein，IMPACT)和氧固醇結(jié)合蛋白樣蛋白1A(oxysterolbindingprotein-like1A，OSBPL1A)基因在牛成年組織中均呈亞型特異性單等位基因表達(dá)[2]。Chen等人鑒定了牛Prader-Willi綜合征區(qū)域的印跡基因(imprintedgeneinthePrader-Willisyndromeregion，IPW)的同源序列及其在多個(gè)組織的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)IPW呈單等位基因表達(dá)[3]。楊文志通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)克隆并分析了位于MEG8與MEG9基因間的2組表達(dá)序列—LINC24062和LINC24063在牛8個(gè)組織(心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌、皮下脂肪和大腦)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LINC24062和LINC24063在牛被檢測(cè)組織中均呈單等位基因表達(dá)[4]。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究印記基因的功能和分析基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。當(dāng)基因在組織中被檢測(cè)到呈現(xiàn)單等位基因表達(dá)時(shí)，就可以確定該基因在組織中是印記基因，相反，當(dāng)基因呈現(xiàn)非單等位基因表達(dá)時(shí)，則該基因?yàn)榉怯∮浕?。王冠楠等人發(fā)現(xiàn)接頭蛋白(Grb2-associatedbindingprotein1，GAB1)和蛋白編碼基因(Scm-likewithfourmbtdomains2，SFMBT2)基因在被檢測(cè)的7個(gè)組織中均呈雙等位基因表達(dá)，表明這兩個(gè)基因是非印記基因[5]。

1.2 印記基因的組織特異性

印記基因在不同組織中的表達(dá)狀態(tài)可能存在差異。Xu等人發(fā)現(xiàn)了多個(gè)牛印記基因在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)狀態(tài)。受體酪氨酸激酶基因(Anexelekto，AXL)在4個(gè)成年牛組織(心臟、肝臟、脾臟和脂肪)中呈單等位表達(dá)，而在其他組織(如肺、腎、肌肉、腦和胎盤(pán))中呈雙等位表達(dá)[6]。而溶質(zhì)載體家族38成員4(solutecarrierfamily38member4，SLC38A4)基因在成年牛心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、肌肉、脂肪和大腦等8個(gè)組織中都沒(méi)有印記，但SLC38A4在5個(gè)異質(zhì)胎盤(pán)中呈多態(tài)性狀態(tài)，其中3個(gè)呈父系單等位表達(dá)，2個(gè)呈雙等位表達(dá)，除了DNA甲基化之外，還有其他表觀(guān)遺傳學(xué)特征在調(diào)節(jié)牛SLC38A4的印記表達(dá)[7]。

1.3 印記基因在不同動(dòng)物間的比較研究

目前已有研究證明，印記基因在不同物種間可能表現(xiàn)出相同的印記狀態(tài)，對(duì)物種間印記基因的比較分析有助于研究基因組印記的生物學(xué)意義和調(diào)控機(jī)制。趙姝君等人分析了含PH同源域蛋白家族A成員2(pleckstrinhomology-likedomainfamilyAmember2，PHLDA2)在成年牛組織中的表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果表明PHLDA2基因在牛的心、肝、脾、肺、腎、大腦、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盤(pán)10個(gè)組織中均呈單等位基因表達(dá)[8]。這與人、鼠和豬中PHLDA2基因表達(dá)模式相同，即均是母源表達(dá)的印記基因。Khatib對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白(Neuroendocrinesecretoryprotein55，NESP55)基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了NESP55基因外顯子在各組織中的轉(zhuǎn)錄本均呈單等位基因表達(dá)，這與小鼠、人類(lèi)的表達(dá)模式相同[9]。另外Khatib基于多態(tài)性的方法對(duì)比研究蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitor，PI)基因在人、羊和牛中的表達(dá)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)該基因在各物種的組織均呈散在型的復(fù)雜表達(dá)模式，即在某些組織中優(yōu)先表達(dá)單等位基因表達(dá)，在其他組織中優(yōu)先雙等位基因表達(dá)[10]。

1.4 印記基因在胚胎發(fā)育各階段的特異性表達(dá)

印記基因在胚胎發(fā)育各階段呈特異性表達(dá)。趙德超等人檢測(cè)到黑色素瘤抗原基因2(melanomaantigen-likegene2，MAGEL2)、肌糖(sarcoglycanepsilon，SGCE)和小核內(nèi)核糖核蛋白(Smallnuclearribonucleoprotein-associatedproteinN，SNRPN)這3個(gè)母源性基因在體外受精(In vitro Fertilization，IVF)各階段的胚胎中都有表達(dá)，但MAGEL2基因在牛孤雌激活(Parthenogenetic Activation，PA)胚胎中不表達(dá)；SGCE基因在PA胚胎的2～4細(xì)胞階段表達(dá)，在其他發(fā)育階段均不表達(dá)；SNRPN基因在PA胚胎的2細(xì)胞和囊胚階段的表達(dá)水平較低[11]。牛IGF2基因座是由5個(gè)啟動(dòng)子(P0、P1、P2、P3和P4)控制的具有不同轉(zhuǎn)錄本的基因組區(qū)域。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可以影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，從而影響隨后的生物學(xué)效應(yīng)。Willhelm等人評(píng)估了牛IGF2基因啟動(dòng)子特異性表達(dá)模式，結(jié)果表明，P0、P1和P2在早期階段起次要作用，P3與后期的發(fā)育相關(guān)，P4是牛卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過(guò)程中IGF2表達(dá)的主要途徑。因此，在胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育生物學(xué)研究中，P4是影響體外生長(zhǎng)胚胎(In vitro production of embryos，IVP)的主要靶點(diǎn)[12]。

1.5 胚胎發(fā)育中印記基因的父系表達(dá)和母系表達(dá)

胚胎發(fā)育過(guò)程中印記基因有父系表達(dá)和母系表達(dá)兩種表達(dá)方式。Gu等人檢測(cè)了鋅指蛋白597(ZincFingerProtein597，ZNF597)在成年牛胎盤(pán)組織和體細(xì)胞中的等位基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZNF597基因是在胎盤(pán)和包括大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和肌肉的其他7個(gè)組織中均呈單等位表達(dá)的母系表達(dá)基因[13]。Liu等人研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體(insulin-likegrowthfactorⅡreceptor，IGF2R)、反義RNA(antisenseRNA，AIR)和神經(jīng)元外單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員3(extraneuronalmonoaminetransportermember3，SLC22A3)基因在牛心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉、脂肪和大腦等8個(gè)組織中均呈單等位基因表達(dá)的；在胎盤(pán)中，IGF2R和SLC22A3基因呈母系表達(dá)，而AIR基因呈父系表達(dá)[14]。

2 印記基因的表達(dá)調(diào)控研究

2.1 基因印記位點(diǎn)的DNA甲基化與細(xì)胞重編程

DNA的異常甲基化會(huì)造成印記基因表達(dá)紊亂，從而影響器官的正常發(fā)育，這可能是導(dǎo)致克隆效率低下和克隆動(dòng)物器官發(fā)育異常的主要原因之一。

2.1.1 甲基化參與印記基因的調(diào)控 DNA甲基化調(diào)節(jié)許多生物過(guò)程，如基因組印記、X染色體失活和轉(zhuǎn)座子沉默。此外它在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。印記基因通常在染色體上呈簇狀出現(xiàn)，并由涉及差異DNA甲基化修飾的順式印記控制區(qū)進(jìn)行調(diào)節(jié)。Wang等人發(fā)現(xiàn)印記基因抗體周期蛋白依賴(lài)激酶抑制因子1C抗原(cyclin-dependentkinaseinhibitor1C，CDKN1C)在牛的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉和皮下脂肪中呈單等位基因表達(dá)，另外在在肝、脾和肺3個(gè)組織中分析了差異甲基化區(qū)域(Differentially methylated region，DMR)—CDKN1CDMR和KVDMR1 DMR的特異性甲基化模式。結(jié)果表明，在CDKN1CDMR中，3個(gè)組織中2個(gè)親本等位基因均未發(fā)生甲基化，而相同組織中KVDMR1 DMR，2個(gè)親本等位基因的甲基化水平存在顯著差異，證明該區(qū)域?yàn)镵VDMR1的DMR，這表明在3個(gè)組織中，KVDMR1區(qū)域的DNA甲基化可能在調(diào)節(jié)牛的CDKN1C基因的印記表達(dá)方面發(fā)揮了重要作用[15]。Mendon?a等人研究發(fā)現(xiàn)，與完全體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎相比，體外胚胎中的IGF2基因DNA甲基化水平更高，且雄性體外胚胎中的DNA甲基化水平較雌性更高[16]。王巍的研究表明H19-IGF2基因簇呈父系印記，其印記控制區(qū)(imprinting control regions，ICRs)在父系染色體呈甲基化狀態(tài)并且隨父源基因組一起經(jīng)歷甲基化的消除和重建，因此該ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化變化情況能夠間接的反映父系DNA的甲基化動(dòng)態(tài)變化模式[17]。同理PWS/AS基因簇的ICR區(qū)(PWS-IC)呈母系印記狀態(tài)，其ICR區(qū)在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化變化模式可以反映母系染色體的甲基化模式。Lafontaine等發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-likegrowthfactor2，IGF2R)、小核核糖核蛋白多肽N(smallnuclearribonucleoproteinpolypeptideN，SNRPN)和肝癌父系高表達(dá)基因(paternallyexpressed10，PEG10)等印記基因的甲基化水平受培養(yǎng)條件和胎牛血清的影響，而且供卵細(xì)胞的年齡也影響編碼緩慢激活延遲整流鉀通道基因(KQT-likesubfamilymember1，KCNQ1)和多型性腺瘤基因樣蛋白1(pleiomorphicadenomagene-like1，PLAGL1)的甲基化；同時(shí)不同的輔助生殖技術(shù)也會(huì)導(dǎo)致牛胚胎特異性表達(dá)印記基因的甲基化[18]。Smith等分析了牛印記基因SNRPN、H19和IGF2R的DMR，發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)觀(guān)察到的甲基化模式(人工授精)相比，印記等位基因和體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)胚胎的雙等位基因表達(dá)普遍存在低甲基化[19]。這些結(jié)果表明，在早期發(fā)育時(shí)體細(xì)胞核的重編程過(guò)程中印記標(biāo)記可能被擦除，而且這種表觀(guān)遺傳異?？赡芘c克隆動(dòng)物的死亡率和發(fā)病率高有關(guān)。

2.1.2 印記基因影響細(xì)胞核移植過(guò)程中供核細(xì)胞的表觀(guān)重編程 表觀(guān)遺傳重編程在保證機(jī)體正常發(fā)育和克隆動(dòng)物的細(xì)胞核全能性方面具有重要作用。SCNT已成功用于多種哺乳動(dòng)物的克隆。馬馨等人研究發(fā)現(xiàn)死亡克隆牛胎盤(pán)中印記基因H19及肝癌高表達(dá)基因抗原(Paternallyexpressedgene10，PEG10)出現(xiàn)超甲基化狀態(tài)，推測(cè)體細(xì)胞核移植過(guò)程影響了供核細(xì)胞的表觀(guān)重編程，并影響胎盤(pán)及內(nèi)臟器官的正常發(fā)育[20]。Ma等人發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄共抑制因子TRIM28的敲除對(duì)H19基因的影響最大[21]。進(jìn)一步的研究表明，TRIM28在卵母細(xì)胞成熟期間高度表達(dá)，并在2細(xì)胞期達(dá)到峰值水平；相比之下，這一階段的SCNT胚胎中TRIM28的表達(dá)顯著降低，表明在SCNT期間TRIM28轉(zhuǎn)錄本丟失，并可能導(dǎo)致克隆胚胎無(wú)法印記。已知10-11易位3(thatten-eleventranslocation3，TET3)負(fù)責(zé)牛著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中的DNA去甲基化，Zhang等人在體外構(gòu)建了過(guò)表達(dá)TET3的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)利用這些成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞的囊胚率比SCNT增加了約18%[22]。牛SCNT胚胎中TET3的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致多能性基因NANOG和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Octamer-bindingtranscriptionfactor，OCT-4)的整體DNA甲基化水平的降低和轉(zhuǎn)錄活性的增加。盡管如此，SCNT胚胎中印記基因H19-IGF2 DMR的DNA甲基化仍然不受TET3過(guò)表達(dá)的影響，保持了親本特異性活性以供進(jìn)一步發(fā)育，該研究結(jié)果實(shí)現(xiàn)更高的克隆效率提供了一種有效的方法。

2.1.3 營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)印記基因甲基化的影響 孕期母體的營(yíng)養(yǎng)水平是決定胎兒發(fā)育的重要因素，對(duì)胎兒印記基因的表達(dá)有影響，并可能誘發(fā)后代的長(zhǎng)期表觀(guān)遺傳變化。Wang等人的研究表明孕期母體營(yíng)養(yǎng)水平與肉牛后代肌肉中印跡基因和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的差異表達(dá)有關(guān)[23]。Devos等人的研究結(jié)果表明，在安格斯肉牛中，不同的產(chǎn)前營(yíng)養(yǎng)和RFI遺傳潛力會(huì)導(dǎo)致出生后胰島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin-likegrowthfactor2，IGF2)和IGF2R甲基化模式的組織特異性改變，而且這些模式也會(huì)隨著年齡的變化而變化[24]。Graugnard等人發(fā)現(xiàn)對(duì)早期斷奶的安格斯牛飼喂高淀粉會(huì)引起脂肪生成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的代謝印記[25]。Paradis等人的研究表明，在妊娠后半期不同營(yíng)養(yǎng)水平可以改變胎兒肌肉中生長(zhǎng)基因，肌源性和脂肪原基因的表達(dá)，雖然不會(huì)在胎兒表型上產(chǎn)生明顯差異，但這種影響因肌肉功能或纖維而異。另外IGF2甲基化水平的差異以及miRNA表達(dá)的差異可能是基因表達(dá)差異之前的功能機(jī)制，并可能導(dǎo)致跨代表觀(guān)遺傳編程[26]。

2.2 特殊基因的印記表達(dá)作用

近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)研究領(lǐng)域發(fā)展迅速。已知反義lncRNA(antisenseclong non-coding RNAs，antisense lncRNAs)、基因間lncRNA(intergenetic lncRNAs，lincRNA)和增強(qiáng)子lncRNA(enhancer lncRNAs，eRNA)可以調(diào)節(jié)基因組印記，導(dǎo)致基因呈親本來(lái)源特異性的單基因表達(dá)。然而，內(nèi)含子lncRNA(intronic ncRNAs)在基因組印記中的功能尚不清楚。Yang等從MEG8基因的cDNA序列中鑒定出3種新的lncRNAs，分別命名為MEG8內(nèi)含子RNA1(MEG8-it1)、MEG8內(nèi)含子RNA 2(MEG8-it2)和MEG8內(nèi)含子RNA 3(MEG8-it3)，這3個(gè)lncRNA與MEG8的表達(dá)模式相似，在所有被測(cè)的8個(gè)牛組織中均呈單等位基因表達(dá)，表明它們?cè)谂Ｉ鲜怯∮浀腫27]。Choo等人證實(shí)了哺乳動(dòng)物父系表達(dá)基因3(paternallyexpressedgene3，PEG3)位點(diǎn)具有反義轉(zhuǎn)錄基因APEG3，并且呈父系等位基因特異性表達(dá)[28]。由于A(yíng)PEG3定位于PEG3基因的3'非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，且APEG3轉(zhuǎn)錄本可以與PEG3轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)，因此APEG3更有可能參與PEG3的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，并且對(duì)印記區(qū)域的功能具有潛在作用。

2.3 基因的異常印記表達(dá)與印記障礙

印記基因的異常表達(dá)常引發(fā)伴有復(fù)雜突變和表型缺陷的多種疾病，例如使用輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)孕育的后代通常會(huì)得大胎綜合癥(large offspring syndrome，LOS)從而導(dǎo)致牛胎兒過(guò)度生長(zhǎng)[29]。目前證實(shí)ART誘導(dǎo)的LOS是一種印記丟失(loss of imprinting，LOI)的表觀(guān)遺傳綜合征，基因印記模式的改變會(huì)引起甲基化的改變進(jìn)而導(dǎo)致印記丟失，從而誘發(fā)綜合征。Hori等人在患有LOS的胎兒頸部半透明組織厚度檢查和體外授精(in vitro fertilization，IVF)小牛中研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1反義轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1oppositestrand/antisensetranscript1，KCNQLOT1)/周期蛋白依賴(lài)激酶抑制因子1C(cyclin-dependentkinaseinhibitor1C，CDKN1C)基因結(jié)構(gòu)域印記控制區(qū)域的異常低甲基化狀態(tài)，即KCNQLOT1的雙等位基因表達(dá)量增加而CDKN1C的表達(dá)量減少，表明牛KCNQLOT1/CDKN1C結(jié)構(gòu)域的異常印記可能會(huì)產(chǎn)生ART技術(shù)孕育的LOS犢牛[30]。父本泛素蛋白連接酶E3A(ubiquitinproteinligaseE3A，UBE3A)等位基因的沉默被認(rèn)為是由父本表達(dá)的UBE3A-ATS反義RNA轉(zhuǎn)錄引起的，UBE3A基因的異常印記表達(dá)與幾種神經(jīng)發(fā)育綜合征和心理障礙有關(guān)[31]。目前已經(jīng)在小鼠和豬中研究了UBE3A基因的異常印記表達(dá)，但在牛中還未有進(jìn)一步研究。

3 問(wèn)題與展望

印記基因分為父系印記基因和母系印記基因，它的表達(dá)具有組織和胚胎特異性，在胚胎期不同時(shí)間段的表達(dá)也有一定差異，為深入了解印記基因的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。DNA甲基化在調(diào)控印記基因的表達(dá)中起重要作用，而且印記基因在細(xì)胞核移植過(guò)程影響了供核細(xì)胞的表觀(guān)重編程，這種表觀(guān)遺傳異?？赡茉诳寺?dòng)物的死亡率和發(fā)病率中起關(guān)鍵作用，但是具體機(jī)制仍需再研究。妊娠特定階段的母體營(yíng)養(yǎng)水平會(huì)導(dǎo)致胎兒和生后發(fā)育的重編程，并影響印記基因的甲基化水平，但關(guān)于母體飲食對(duì)肉牛印記基因表達(dá)的影響的現(xiàn)有數(shù)據(jù)有限。目前在牛中只發(fā)現(xiàn)極少印記基因的異常表達(dá)和印記障礙。隨著基因組印記相關(guān)的表觀(guān)遺傳研究越來(lái)越深入，將為動(dòng)物胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的調(diào)控機(jī)制研究提供更多理論依據(jù)。