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    膠紅酵母胞外多糖抗氧化活性及對(duì)藥物性肝損傷的護(hù)肝機(jī)制

    2022-04-07 07:01:50李梅林馬文錦周彥兵張永顯于長(zhǎng)青
    食品與機(jī)械 2022年3期
    關(guān)鍵詞:異煙肼利福平毒性

    李梅林 馬文錦 王 博 周彥兵 張永顯 于長(zhǎng)青 彭 濤

    (甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司,甘肅 蘭州 730000)

    藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)是指在應(yīng)用治療劑量的藥物時(shí),由于藥物或其代謝產(chǎn)物引起的肝細(xì)胞毒性損傷,或肝臟對(duì)藥物及代謝產(chǎn)物的過(guò)敏反應(yīng)所致的疾病[1]。DILI約占所有藥物不良反應(yīng)的3.0%~9.0%,占肝炎患者的10%,隨著臨床藥物種類(lèi)的不斷增加,DILI的發(fā)病率也隨之增多。DILI目前尚無(wú)特效療法,關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)、早停藥,并特異性地給予保肝解毒藥物,其治療基本原則是停止用藥、查明原因、對(duì)癥支持治療[2]。因此,重視和加強(qiáng)DILI的發(fā)生與防治尤為重要。

    膠紅酵母(R.mucilaginosa)是酵母種屬的一種,為單細(xì)胞真核生物[3-4]。課題組前期通過(guò)形態(tài)學(xué)、碳源/氮源同化試驗(yàn)及18S rDNA生物學(xué)方法,鑒定菌株CM-1為膠紅酵母菌(R.mucilaginosa)。從R.mucilaginosaCM-1無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中分離得到水溶性胞外多糖RmEPS,其產(chǎn)量為7.35 g/L,多糖RmEPS經(jīng)纖維素交換柱、凝膠滲透等純化方法可得到單一組分多糖RmEPS-11。文章擬通過(guò)研究膠紅酵母胞外多糖對(duì)小鼠藥物引起肝損傷的保護(hù)作用,分析其潛在的分子機(jī)制,為膠紅酵母胞外多糖在功能性食品與藥品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料與試劑

    昆明小鼠:體重16~24 g,雄性,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;

    膠紅酵母(RhodotorulamucilaginosaCM-1)菌株:陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室;

    抗壞血酸:分析純,河北鴻韜生物工程有限公司;

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,北京百奧萊博科技有限公司;

    2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):分析純,湖南韻邦生物醫(yī)藥有限公司;

    偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH):分析純,上?;巧锟萍加邢薰?;

    異煙肼(INH):生物試劑,西安利君制藥有限責(zé)任公司;

    利福平(RIF):生物試劑,鐘祥市耀威生物科技有限公司;

    水飛薊素(Silymarin):生物試劑,上海西寶生物科技股份有限公司;

    超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒:上海朝瑞生物科技有限公司;

    2,4-二硝基苯肼:分析純,成都聯(lián)禾化工醫(yī)藥有限責(zé)任公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    酶標(biāo)分析儀:HBS-1096A型,南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

    高速冷凍離心機(jī):CT15RT型,上海天美生化儀器設(shè)備有限公司;

    數(shù)顯恒溫水浴鍋:HH-4型,金壇市宏華儀器廠;

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:M381409型,北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 抗氧化活性 根據(jù)課題組[5]前期研究測(cè)定DPPH自由基、ABTS自由基和氧自由基清除能力,以及還原力。

    1.2.2 對(duì)異煙肼和利福平肝毒性的保護(hù)作用 將雌雄小鼠隨機(jī)分為4組,雌雄各半,每組8只。小鼠飼養(yǎng)1周后,采用相同給藥方式,每天給藥1次,持續(xù)給藥7 d,其他飼養(yǎng)條件正常,最后1 d給藥后,禁食禁水12 h后進(jìn)行采樣處理。試驗(yàn)組:① 空白對(duì)照組:注射0.9% NaCl溶液(20 mL/kg 的0.9% NaCl注射液);② INH模型對(duì)照組:灌胃給藥INH(以0.74 mmol/kg按0.2 mL/10 g體重);③ RmEPS-11模型處理組:在INH模型組基礎(chǔ)上,注射RmEPS-11溶液(按100 mg/kg進(jìn)行肝保護(hù))和300 mg/kg RIF;④ 水飛薊素組:100 mg/kg 水飛薊素和300 mg/kg RIF體重灌胃。

    1.2.3 臟器指數(shù)測(cè)定及樣品處理

    (1)血樣處理和臟器指數(shù)測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[6-9]并修改。每只小鼠稱(chēng)重后,摘取眼球取血,將血樣保存用于后期生物理化指標(biāo)測(cè)定,包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白質(zhì)總濃度(T-Protein),丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)等。脫臼處死小鼠,剖腹取出肝和腎,觀察其顏色及大小變化程度,稱(chēng)重。取肝臟右葉部分組織,一部分凍存用于測(cè)定生物指標(biāo),一部分樣品用錫箔紙包好放入無(wú)RNAase的EP管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱用于后期分子學(xué)試驗(yàn);另一部分用10%福爾馬林固定后,用于后續(xù)光鏡下檢驗(yàn)其病理學(xué)變化。

    (2)肝勻漿制備:將保存的部分肝臟用生理鹽水清洗,精確稱(chēng)重,剪碎,與生理鹽水混勻制備肝勻漿組織[10],離心,上清液于4 ℃保存。

    (3)ALT/GPT的測(cè)定:按照試劑盒要求測(cè)定。

    (4)AST/GOT的測(cè)定:按照試劑盒要求測(cè)定。

    1.2.4 T-Protein測(cè)定 按照試劑盒要求測(cè)定。

    1.2.5 SOD測(cè)定 按照試劑盒要求測(cè)定。

    1.2.6 MDA測(cè)定 按照試劑盒要求測(cè)定。

    1.2.7 GSH-PX測(cè)定 按照試劑盒要求測(cè)定。

    1.2.8 病理學(xué)研究 經(jīng)HE染色劑染色后[11],光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)變化。正常:肝組織結(jié)構(gòu)相對(duì)正常,無(wú)變性等;1級(jí):小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞略有脂肪變性,伴有輕度壞死;2級(jí):變性程度加重,肝小葉可見(jiàn)明顯壞死;3級(jí)(+++):肝小葉結(jié)構(gòu)不清,可見(jiàn)明顯的大片狀壞死病灶。

    1.2.9 相關(guān)基因CYP2E1及表達(dá) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其相關(guān)基因CYP2E進(jìn)行定量表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參基因,將-80 ℃凍存的小鼠肝臟在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行CYP2E1和CYP1A2的差異研究。

    1.2.10 總RNA的提取純化 根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]并修改。

    (1)破碎勻漿:將樣品分別從-80 ℃冰箱中取出,加入液氮用研缽反復(fù)研磨成粉末狀,并于凍融前研碎,轉(zhuǎn)至加入RNAiso Plus的裂解液中,振蕩混勻。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,室溫靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

    (2)提?。簩⒙确录又羷驖{裂解液中,振蕩混勻,靜置。4 ℃、12 000 r/min離心5 min,吸取上清液,加入等體積異丙醇,混勻,靜置,4 ℃、12 000 r/min離心5 min。

    (3)RNA沉淀的清洗和溶解:向沉淀中加入乙醇溶液,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,除去乙醇,添加一定量的RNase-free水溶解沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

    (4)熒光實(shí)時(shí)定量PCR:按照試劑盒說(shuō)明加樣,在普通PCR的退火溫度附近選擇幾個(gè)溫度,用同一樣品,得到Ct值最小的為最佳溫度。

    (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗氧化活性分析

    2.1.1 DPPH自由基清除能力 由圖1(a)可知,DPPH自由基清除活性隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),RmEPS-11和維生素C的清除率分別為66.15%,97.62%。RmEPS-11的IC50值為2.96 mg/mL。綜上,RmEPS-11具有較高的DPPH自由基清除能力,提示RmEPS-11可以將電子或氫供給DPPH自由基。

    2.1.2 ABTS自由基清除能力 由圖1(b)可知,RmEPS-11對(duì)ABTS自由基的清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),RmEPS-11和維生素C的清除率分別為82.80%,99.57%,說(shuō)明RmEPS-11表現(xiàn)出一定的ABTS自由基清除活性。

    2.1.3 還原力 由圖1(c)可知,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0~8 mg/mL 時(shí),還原能力隨樣品濃度的增加而增大,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí),還原力高達(dá)0.753。

    2.1.4 氧自由基清除能力(ORAC值) 經(jīng)計(jì)算,RmEPS-11的ORAC值為(560.38±6.45)μmol TE/g。由圖1(d)可知,RmEPS-11具有強(qiáng)的氧自由基清除能力,主要因?yàn)槎嗵堑臍湓迂暙I(xiàn)給了環(huán)上的C—H鍵或醛糖、糖醛酸上的O—H和其他位點(diǎn)來(lái)清除自由基。

    圖1 多糖RmEPS-11和抗壞血酸的抗氧化活性Figure 1 Free radical scavenging and reducing power activities of ascorbic acid and RmEPS-11

    2.2 肝功能活性分析

    由表1可知,通過(guò)異煙肼和利福平處理后AST和ALT含量顯著提高(P<0.01),表明其增大了肝臟的氧化應(yīng)激。與空白對(duì)照組相比,模型組AST和ALT含量顯著升高(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組和RmEPS-11治療組與INH模型對(duì)照組相比,AST、ALT含量顯著降低(P<0.01),因此AST、ALT可作為異煙肼和利福平肝毒性的評(píng)估指標(biāo)。MDA、SOD和GSH含量也有類(lèi)似變化。異煙肼和利福平處理后,試驗(yàn)鼠體內(nèi)MDA含量升高,SOD和GSH含量降低(P<0.01),與空白對(duì)照組相比,表明脂質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致異煙肼和利福平中毒。陽(yáng)性對(duì)照組和RmEPS-11治療組與INH模型對(duì)照組相比,能降低MDA含量、調(diào)高SOD和GSH含量,最終接近模型組(P<0.01),表明RmEPS-11在逆轉(zhuǎn)肝損傷過(guò)程中起到一定作用。

    表1 通過(guò)RmEPS-11治療后血清中ALT、AST、SOD、MDA、GSH含量?Table 1 Effects of RmEPS-11 on serum ALT,AST levels and hepatic SOD activity,MDA and GSH content in rats

    由圖2可知,對(duì)照組的小鼠肝臟病理切片顯示正常組織形態(tài);用異煙肼和利福平處理的試驗(yàn)鼠呈現(xiàn)肝硬化、經(jīng)典的組織凝固性壞死、大量纖維化、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、脂肪變性和再生結(jié)節(jié)的形成。RmEPS-11治療組和陽(yáng)性對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)變化。綜上,RmEPS-11能夠治療和改善異煙肼和利福平引起的肝損傷。

    圖2 小鼠肝組織的病理切片F(xiàn)igure 2 Histological examination of liver tissue sections stained with HE(×400)

    2.3 CYP2E1的表達(dá)

    由圖3可知,CYP2E1在INH模型組中的表達(dá)量(1.90±0.42)與空白組(0.98±0.26)相比極顯著升高(P<0.01),但SC陽(yáng)性對(duì)照組(0.75±0.19)和RmEPS-11治療組(0.82±0.22)與INH模型組差異顯著(P<0.05),CYP2E1表達(dá)量明顯降低。

    異煙肼(INH)和利福平(RIF)是用于抗結(jié)核化療的一線(xiàn)藥物,具有潛在的肝毒性,可能導(dǎo)致藥物引起的肝損傷,如果這種肝毒性不能及早識(shí)別,后果是致命的,且引起肝毒性的發(fā)病機(jī)制是多方面的[16-17]。一些研究[18-20]表明,CYP2E1參與INH和RIF肝毒性的形成過(guò)程,可能是細(xì)胞內(nèi)過(guò)多自由基或毒性代謝產(chǎn)物堆積,造成氧化應(yīng)激引起肝毒性,而抗氧化劑可以保護(hù)細(xì)胞和組織免受各種疾病中活性氧和其他自由基的有害影響。

    1.空白對(duì)照組 2.模型組 3.陽(yáng)性對(duì)照組 4.RmEPS-11治療組圖3 CYP2E1 mRNA的表達(dá)Figure 3 The CYP2E1 mRNA expression in all groups

    3 結(jié)論

    在多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上評(píng)估了RmEPS-11對(duì)小鼠異煙肼和利福平引起的肝臟毒性的影響。結(jié)果顯示,與異煙肼和利福平處理的小鼠相比,RmEPS-11給藥后血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平和肝臟丙二醛含量顯著降低,肝臟超氧化酶活性和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量顯著恢復(fù)。此外,肝臟的組織病理學(xué)損傷和凋亡肝細(xì)胞數(shù)量改善顯著。機(jī)制研究表明,保護(hù)作用主要是由于CYP2E1mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié),導(dǎo)致有害自由基和ROS的形成減少,同時(shí)抗氧化能力提高,多糖RmEPS-11通過(guò)抑制肝CYP2E1抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,增加自由基的清除。在此基礎(chǔ)上,后續(xù)應(yīng)開(kāi)展膠紅酵母胞外多糖的急毒研究,研究半數(shù)致死量或最大耐受量,為其后期的開(kāi)發(fā)利用提供安全依據(jù)。

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