米糠蛋白源ACE抑制肽的酶解制備及活性研究

張玲瑜 苗建銀 曹 愚 戴偉杰 劉 果 李振偉 曹 庸

(1. 華南農業(yè)大學食品學院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 廣東惠爾泰生物科技有限公司，廣東 廣州 511356；3. 河源綠純食品有限公司，廣東 河源 517000)

高血壓是一種心血管疾病，臨床癥狀表現為血壓升高，伴隨頭暈、頭痛等[1]。隨著人口老齡化及城鎮(zhèn)化進程的加速，高血壓發(fā)病人數持續(xù)增加，目前中國高血壓患者約2.45億人[2]，高血壓的防治已成為備受關注的問題。神經緊張素轉換酶(Angiotensin I-converting Enzyme,ACE)是一類鋅蛋白酶，主要存在于肺部毛細血管和腎臟上皮細胞，在腎素—血管緊張素系統(tǒng)中，ACE可以將血管緊張素Ⅰ裂解為可引起血管收縮的血管緊張素Ⅱ，進而引起高血壓[3-5]。因此，研究中常用抑制ACE的手段達到降血壓的效果。

市面上常見的降壓藥如卡托普利、賴諾普利等化學合成類物質，雖具有明顯的降壓效果，但服用會伴隨一些副作用，如咳嗽、皮膚過敏、味覺紊亂等[6]。食源性生物活性肽來源廣泛，安全性高，是化學合成藥品的理想替代物，而目前有大量研究表明具有ACE抑制活性的食源性生物活性肽有顯著的降血壓功效，如南瓜籽肽[7]、大米肽[8]、芝麻籽肽[9]、香菇蛋白肽[10]等。

中國水稻產量豐富，稻谷年均總產量達2億t以上，但稻米加工仍處于初加工狀態(tài)，有效利用率只有60%～65%，大量米糠等資源未得到有效開發(fā)[11]。米糠是稻谷脫殼后精碾大米的副產物，稻米在加工為食用大米時約產生10%的米糠，而這些米糠含有的營養(yǎng)物質幾乎占整個稻米的65%[12]。米糠中含有約12%～20%的蛋白質，氨基酸含量十分豐富[13]，米糠蛋白經水解后可獲得多種生物活性肽，如阿片拮抗肽[14]、抗氧化肽[15]、免疫功能調節(jié)肽[16]等。目前關于米糠蛋白ACE抑制肽的研究報道較少，且在酶解工藝上多采用堿性蛋白酶[17-18]，而過高的pH在實際生產中易對工廠設備造成腐蝕損耗且后續(xù)加工增加了脫鹽環(huán)節(jié)。此外酶添加量、酶解時間、溫度等因素的選擇都會對實際生產的能耗產生影響，因此尋求經濟、環(huán)保的生產工藝值得深入探討。

試驗擬以ACE抑制率為指標，從酶種類、pH、酶添加量、底物質量濃度、酶解溫度等方面進行酶解工藝的優(yōu)化以獲取ACE抑制肽制備的最優(yōu)工藝條件，并檢測其氨基酸組成，通過超濾進行初步分離，以期為進一步對ACE抑制肽進行分離純化和研究其ACE抑制機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米糠：由實驗室自制；

胃蛋白酶：3.0×103NF·U/mg，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

木瓜蛋白酶：2.0×105U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：2.5×105U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

中性蛋白酶：5 U/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、血管緊張素轉換酶(ACE，來源于兔肺)：美國Sigma公司；

氫氧化鈉：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

鹽酸：分析純，河南標準物質研發(fā)中心。

1.1.2 主要儀器設備

pH計：PHS-3CW型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市華城海龍實驗儀器廠；

電子天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

多功能酶標儀：2300型，美國Perkin Elmer公司；

臺式低速離心機：L530型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

冷凍干燥機：FD-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-C型，常州澳華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠蛋白酶解物制備 稱取一定量的米糠蛋白粉，用蒸餾水溶解后調節(jié)pH至合適范圍，將樣品放入水浴鍋，待樣液溫度達到設定溫度后添加一定比例蛋白酶，水浴酶解3 h，90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心20 min，取上清液，即為米糠蛋白酶解物。

1.2.2 ACE抑制率測定 參照駱琳等[19]的方法，修改如下：用96孔板，在樣品孔中分別添加40 μL的樣液、50 μL的呋喃丙烯酰三肽(FAPGG)和10 μL的ACE酶；在空白孔中分別加入40 μL的HEPES緩沖溶液、50 μL的FAPGG和10 μL的ACE酶，使用酶標儀檢測其340 nm處的吸光值并記錄，在37 ℃下恒溫保存30 min后再檢測一次其在340 nm處的吸光值并記錄，按式(1)計算ACE抑制率。

(1)

式中：

R——ACE抑制率，%；

a1——空白孔340 nm處的初始吸光度；

a2——37 ℃保溫30 min后空白孔340 nm處的吸光度；

b1——樣品孔340 nm處的初始吸光度；

b2——37 ℃保溫30 min后樣品孔340 nm處的吸光度。

1.2.3 最優(yōu)酶的篩選 選取胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，底物質量濃度為4 g/100 mL蒸餾水，酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解3 h，以及各自最適pH和溫度條件下制備米糠蛋白酶解物，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最優(yōu)蛋白酶。

1.2.4 單因素試驗

(1)pH對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL底物質量濃度混合均勻，在pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳pH條件。

(2)酶解溫度對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL底物質量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶分別在35，40，45，50，55 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳酶解溫度條件。

(3)底物質量濃度對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水分別按2，4，6，8，10 g/100 mL的底物質量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.3 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳底物質量濃度條件。

(4)酶添加量對ACE抑制率的影響：用米糠蛋白與蒸餾水按4 g/100 mL的底物質量濃度混合均勻，在pH為7.0條件下加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/100 g米糠蛋白的酶在45 ℃下酶解3 h，將酶解物稀釋10倍后測定其ACE抑制率以篩選出最佳酶添加量條件。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎上，選取pH、底物質量濃度和酶解溫度3個因素，根據Box-Benhnken試驗設計原理，以米糠蛋白ACE抑制率為響應變量進一步優(yōu)化酶解工藝。

1.2.6 酶解物和超濾組分ACE抑制活性評價 將最佳工藝條件下制備的酶解液通過超濾將其分成分子量>3 kDa 和<3 kDa兩部分，隨后將最優(yōu)酶解物和超濾組分冷凍干燥至粉末，在0.5，1.0 mg/mL兩個質量濃度下分別計算其ACE抑制率。

1.2.7 氨基酸組分測定 參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的外標法，酸水解后測定酶解物中氨基酸的組成及其含量，在此測定中色氨酸被完全破壞。

1.2.8 數據處理 部分數據圖采用Origin 8.6進行繪制。采用Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗的設計與分析，采用SPSS Statistics 21軟件以單因素ANOVA法和Duncan法分析數據間差異，P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

天然食源性蛋白質經體外酶解或體內消化后，能產生具有特殊生理功能的肽段，而不同的蛋白酶因具有不同酶切位點，即使使用同種蛋白質原料，酶解后產生的肽段活性也存在差異[20]。如圖1所示，中性蛋白酶酶解產物顯示出最高的ACE抑制活性，ACE抑制率為(67.39±2.78)%，明顯優(yōu)于其他3種蛋白酶(P<0.05)。因此，后續(xù)試驗均使用中性蛋白酶對米糠蛋白進行酶解。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖1 蛋白酶種類對ACE抑制率的影響Figure 1 The effect of protease types on ACE inhibition rate

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響 由圖2 可知，pH為7.0時，酶解物顯示最好ACE抑制率，明顯優(yōu)于當pH為5.5，6.0，6.5時的(P<0.05)。這可能是pH偏離中性時中性蛋白酶的活性受到抑制，活性基團的解離狀態(tài)發(fā)生改變，酶和底物的結合能力降低從而導致酶解效果不佳[21]，所以最佳pH為7.0。

2.2.2 底物質量濃度對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響 由圖3可知，底物質量濃度在一定范圍內變化較為明顯，在到達4 g/100 mL的質量濃度后，雖有正增長，但變化緩慢，在8 g/100 mL的底物質量濃度條件下有最大ACE抑制率為(69.70±2.79)%，但與10 g/100 mL的底物質量濃度條件下ACE抑制率差異并不顯著，可能是因為在此酶添加量下，底物已達到飽和，所以即使再加大底物質量濃度也不會再提高酶解液的ACE抑制率。所以，確定最佳底物質量濃度條件為8 g/100 mL。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖3 底物質量濃度對ACE抑制率的影響Figure 3 The effect of mass concentration of substrate on ACE inhibition rate

2.2.3 酶解溫度對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響

由圖4可知，當酶解溫度條件設置為45 ℃時，有最好的ACE抑制率(64.35±1.25)%，此結果明顯優(yōu)于其他溫度下的(P<0.05)。中性蛋白酶最適宜的溫度條件是45 ℃，溫度在一定范圍內升高，促進分子運動的加快，酶與底物的碰撞幾率增大，從而提高酶的活性，得以釋放更多肽段[22]。但是過高的溫度又會一定程度上破壞酶的結構，而導致酶的活力受到影響甚至失活。所以選取的最佳酶解溫度條件為45 ℃。

字母不同表示在P<0.05水存在顯著性差異圖4 酶解溫度對ACE抑制率的影響Figure 4 The effect of enzymatic temperature on ACE inhibition rate

2.2.4 酶添加量對米糠蛋白酶解物ACE抑制率的影響

如圖5所示，酶添加量與ACE抑制率在0.1～0.3 g/100 g 米糠蛋白濃度范圍內呈正相關關系，在酶到達0.3 g/100 g米糠蛋白的添加量后，基本不再變化，有最大ACE抑制率為(68.73±2.11)%，此時再加大酶添加量，ACE抑制率變化并不顯著，可能是因為在底物一定的情況下，酶添加量已達到飽和。從經濟角度出發(fā)，確定最佳酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖5 酶添加量對ACE抑制率的影響Figure 5 The effect of the enzyme addition on ACE inhibition rate

2.3 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，選定酶添加量為0.3 g/100 g米糠蛋白，以pH、底物質量濃度和酶解溫度3個因素(見表1)進行進一步優(yōu)化，響應面設計及結果如表2所示。

表1 響應面因素水平設計表Table 1 Response surface factor level design

表2 響應面設計方案及試驗結果Table 2 Response surface design scheme and experimental results

運用Design-Expert 8.0對響應面結果進行多元回歸擬合，得到ACE抑制率對于pH、底物質量濃度和酶解溫度的二次回歸方程為：

Y=72.08+4.02A+3.20B+2.02C-0.065AB+2.31AC-0.35BC-4.06A2-1.47B2-3.72C2。

(2)

根據方差分析(表3)，回歸模型高度顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.01)，表明此模型比較穩(wěn)定和理想。決定系數R2=0.964 2，表明模型與實際試驗擬合較好。因素A、B、C的一次項均顯著(P<0.01)，說明pH、底物質量濃度和酶解溫度均對酶解產生顯著的影響。交互項AB、AC、BC均不顯著，說明任意兩因素間交互作用不顯著，兩個因素間的交互作用詳見圖6。比較表3各因素的F值，可以得知3個因素對酶解液ACE抑制率的影響作用大小順序為：pH>底物質量濃度>酶解溫度。

圖6 pH、酶解溫度、底物質量濃度交互作用對ACE抑制率的影響Figure 6 The influence of the interaction of pH,enzymatic hydrolysis temperature,and substrate mass concentration on the inhibition rate of ACE

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression model

根據模型預測，在pH 7.23，底物質量濃度8.22 g/100 mL，酶解溫度46.43 ℃時有最好的ACE抑制率73.96%，按實際情況將工藝調整為pH為7.2，底物質量濃度為8.2 g/100 mL，酶解溫度為46 ℃，酶解3 h后測其ACE抑制率為(74.63±1.01)%，結果符合模型預測，證明此模型與實際情況較為相符。因此，米糠蛋白源ACE抑制肽的酶解制備最優(yōu)工藝為：pH 7.2，底物質量濃度8.2 g/100 mL，酶解溫度46 ℃，酶添加量0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解時間3 h。

2.4 酶解物和超濾組分ACE抑制活性評價

利用3 kDa超濾膜超濾分離酶解物，冷凍干燥后測定酶解物和不同超濾組分在同一濃度條件下的ACE抑制率，同時與降血壓藥物卡托普利、馬來酸依那普利進行陽性對照，結果如圖7所示。在1.0 mg/mL的質量濃度下，陽性藥物卡托普利和馬來酸依那普利有最好的ACE抑制活性，其他組分都表現出顯著的ACE抑制活性，分子量<3 kDa組分的ACE抑制率[(81.68±1.08)%]顯著優(yōu)于酶解物[(72.64±1.61)%]和分子量>3 kDa組分的[(58.65±2.31)%]。Yu等[23]將魚膠原蛋白酶解物超濾分成4個不同分子量大小的組分，結果表明最小分子量組分有最好的ACE抑制率；Yang等[24]將阿拉斯加鱈魚皮蛋白酶解物分成分子量>10，3～10，<3 kDa的組分，其中<3 kDa組分有最好的ACE抑制率。說明分子量大小與ACE抑制率有顯著的聯系，分子量越小，其ACE抑制率越高。

2.5 氨基酸組成分析

由表4可知，米糠蛋白酶解物中有16種氨基酸，包含除色氨酸外的7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其中谷氨酸含量最高(11.88 g/100 g)，占氨基酸總量的18.75%，其次是精氨酸(5.62 g/100 g)和亮氨酸(5.14 g/100 g)。

表4 米糠蛋白酶解物中的氨基酸含量?Table 4 Amino acid content in rice bran enzymatic hydrolysate

必需氨基酸總含量為22.82 g/100 g，占氨基酸總量的36.01%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白模式[25]。同時，酶解物中疏水性氨基酸含量豐富，約為23.09 g/100 g。研究[26-27]發(fā)現，氨基酸C端疏水性和正電荷正向影響肽的ACE抑制活性，這是因為肽的C端氨基酸有助于抑制劑在ACE活性位點的結合，ACE抑制活性依賴疏水性氨基酸，所鑒定的疏水氨基酸含量較高的ACE抑制肽通常比疏水氨基酸含量較低的ACE抑制肽活性更高。說明米糠是提取ACE抑制肽的理想原料，有很好的應用前景。

3 結論

以米糠蛋白為原料，以神經緊張素轉換酶抑制率為指標，利用響應面法優(yōu)化酶解工藝。用4種不同的蛋白酶對其進行酶解，選取中性蛋白酶進行單因素以及響應面試驗，最佳酶解工藝參數為：pH 7.2，底物質量濃度8.2 g/100 mL，酶解溫度46 ℃，酶添加量0.3 g/100 g米糠蛋白，酶解時間3 h，此工藝參數反應條件溫和，應用于工業(yè)生產較為經濟友好。在此條件下制備獲得的酶解物的神經緊張素轉換酶抑制率為(74.63±1.01)%，有顯著的ACE抑制活性。酶解物超濾后通過活性分析表明分子量大小顯著影響其神經緊張素轉換酶抑制活性。氨基酸分析顯示米糠蛋白酶解物有22.82 g/100 g的必需氨基酸和23.09 g/100 g的疏水性氨基酸，與前人[26-27]認為神經緊張素轉換酶抑制活性與疏水性氨基酸有關的研究一致。試驗僅限于體外的神經緊張素轉換酶抑制功效，后續(xù)將繼續(xù)對酶解物進行分離純化和結構鑒定以得到單體肽段，并深入探究其抑制神經緊張素轉換酶的具體機制。

字母不同表示在P<0.05水平存在顯著性差異圖7 不同組分在同一質量濃度(1 mg/mL)下的ACE抑制率Figure 7 ACE inhibition rate of different components at the samemass concentrations (1 mg/mL)