著絲粒蛋白U對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、糖酵解的影響及機(jī)制

鄧桃枝，江雪梅，何周桃，蔡曼妮，陳超超，許澤文

1 海南省腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，?？?570312；2 海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，有較高發(fā)病率及病死率，盡管臨床在胃癌的診斷和治療方面已取得重大進(jìn)展，但研究顯示，與胃癌相關(guān)的病死率將繼續(xù)增加［1］。癌細(xì)胞異常代謝是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，有氧或缺氧環(huán)境下癌細(xì)胞均最先以糖酵解途徑供能，使癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐受能力［2］。研究表明，當(dāng)肺正常細(xì)胞由于外界環(huán)境因素或基因突變等發(fā)生癌變后，肺癌細(xì)胞新陳代謝速度加快，能量代謝活躍、細(xì)胞膜通透性增加、增殖速度加快，都導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)能量的需求量增加，最終通過增加糖酵解途徑加速提供能量及產(chǎn)生必要的大分子產(chǎn)物［3］。因此，有效抑制癌細(xì)胞糖酵解可能有助于改善和發(fā)現(xiàn)針對(duì)癌癥的新策略。研究表明，糖酵解途徑產(chǎn)生可三磷酸腺苷（ATP），而ATP 水解釋放的能量使著絲粒微管（著絲粒纖維）向細(xì)胞紡錘體極端延伸，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂［4］。著絲粒蛋白（CENPU）是有絲分裂階段染色體分離的主要成分，CENPU 是CENP家族一員，又稱為骨髓增生異常/髓樣白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）、KHSVLNA相互作用蛋白1（KLIP1）［5］。研究顯示，下調(diào)CENPU 表達(dá)可抑制惡性腫瘤進(jìn)展［6］。TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示，MLF1IP 即CENPU 在胃癌組織中異常高表達(dá)，但其在胃癌中的作用尚未明確。2020 年5 月—11 月，我們探討了CENPU對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、糖酵解的影響及機(jī)制，以期為臨床精準(zhǔn)治療胃癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27 均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。RPMI1640 培養(yǎng)基購自武漢益普生物科技有限公司；Lipo-fectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；si-CENPU、si-CENPU-NC 序列引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；CCK-8 試劑盒試劑盒購自福州飛凈生物科技有限公司；葡萄糖消耗（GC）、乳酸脫氫酶（LDH）、ATP、丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、兔抗人蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗均購自北京義翹神州科技股份有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司；ELx800 型酶標(biāo)儀、C1000型熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇并解凍GES-1、AGS、MKN45、HGC-27 細(xì)胞，于含10% 滅活胎牛血清（FBS）+90%RPMI1640 的培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。

1.3 各細(xì)胞系中CENPU mRNA 表達(dá)測定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。分別取對(duì)數(shù)生長期的各細(xì)胞并提取總RNA、測濃度，以RNA 為模板行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將所得cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。體系20 μL：10 μL ULtraSYBR mixture、2.0 μL cDNA、正反向引物各2.0 μL、4.0 μL H2O2；共40 個(gè)循環(huán)：95 ℃15 s、60 ℃60 s；溶解曲線60～95 ℃，每15 s 升溫0.3℃。以β-actin 為內(nèi)參，CENPU 正向引物：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；β-actin 正向引物：5'-GCAGAAGTGCGAAGAGGAGG-3'，反向引物：5'-GCTTGATGGAGTTGTCGGTGTA-3'。 采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各細(xì)胞中CENPU mRNA表達(dá)。

1.4 HGC-27 細(xì)胞分組及處理 選擇1.2 結(jié)果中CENPU mRNA 表達(dá)最高的HGC-27 細(xì)胞為研究對(duì)象。取對(duì)數(shù)生長期的HGC-27 細(xì)胞，接種于24 孔板（2.5×104/孔），待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，更換無FBS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為3 組：①陰性對(duì)照組（si-CENPU-NC 組）：先用無FBS 的培養(yǎng)液將LipofectamineTM3000 稀釋，用消毒的移液槍頭吸取5 μL LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑溶入250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基，吹打混勻，靜置5 min；用消毒移液槍頭吸取10 μL 含si-CENPU 的溶液溶入250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基，吹打混勻，靜置5 min；上述兩種靜置后的溶液放入同一EP 管中，吹打混勻，靜置20 min，后將混合液全部轉(zhuǎn)移到6 格板中的其中1 個(gè)小孔中，搖勻法晃動(dòng)6格板，使細(xì)胞培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染混合液充分混勻；②沉默CENPU 表達(dá)組（si-CENPU組）：操作同si-CENPU-NC 組；③同時(shí)將未經(jīng)特殊處理細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組（NG 組）。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 各組HGC-27細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。分別取1.4 各組HGC-27 細(xì)胞、消化，接種至24孔板（2.5×104/孔），分別于培養(yǎng)24 h 后嚴(yán)格按照CCK-8 試劑盒說明書加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測570 nm 處各孔細(xì)胞光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/NG 組OD值）×100%，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 各組HGC-27 細(xì)胞克隆形成率測定 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。分別取1.4 各組HGC-27 細(xì)胞，于6 孔板（每孔500 個(gè)細(xì)胞），每組6 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2、95%O2條件下培養(yǎng)15 d，4%多聚甲醛固定、0.25%結(jié)晶紫染色30 min；拍照并計(jì)算克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 各組HGC-27 細(xì)胞糖酵解過程關(guān)鍵指標(biāo)測定 采用ELISA 法。分別取1.4各組HGC-27細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LD檢測試劑盒說明書檢測上清中GC、LD 含量及關(guān)鍵酶HK、PK 水平；將細(xì)胞消化，接種至24 孔板（2.5×104個(gè)/孔），用生理鹽水洗滌細(xì)胞并制成細(xì)胞懸浮液，按照ATP 檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞中ATP 含量。以上操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒書進(jìn)行操作。

1.8 各組HGC-27 細(xì)胞AKT/STAT3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用免疫印跡法。分別取1.4 各組HGC-27 細(xì)胞，以RIPA 裂解并提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，放入脫脂奶粉溶封閉，分別加入LDHA（1∶500）、GLUT1（1∶500）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、STAT3（1∶500）、p-STAT3（1∶500）及內(nèi)參β-actin（1∶500）為一抗，過夜，加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育30 min，顯影、定影，以各基因條帶灰度值計(jì)算各目標(biāo)基因蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人胃癌不同細(xì)胞系中CENPU mRNA 表達(dá)比較 GES-1細(xì)胞、AGS、MKN45、HGC-27細(xì)胞中CENPU mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.15、1.58 ±0.23、1.79±0.26、2.13±0.32，與GES-1細(xì)胞比較，AGS、MKN45、HGC-27 細(xì)胞中CENPU mRNA 表達(dá)均升高（P均＜0.05），且HGC-27 細(xì)胞中CENPU mRNA表達(dá)最高（P＜0.05）。因此選擇HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組HGC-27 細(xì)胞增殖情況比較 NG 組、si-CENPU-NC 組、si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞增殖抑制率分別為0、（0.32 ± 0.03）%、（18.96 ± 2.87）%，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27細(xì)胞增殖抑制率升高（P均＜0.05）。

2.3 各組HGC-27 細(xì)胞克隆形成率比較 NG 組、si-CENPU-NC 組、si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞克隆形成率分別為（83.27±12.73）%、（85.95±12.89）%、（20.35 ± 3.01）%，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞克隆形成率均降低（P均＜0.05）。

2.4 各組HGC-27 細(xì)胞糖酵解過程關(guān)鍵指標(biāo)水平比較 與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞GC、LDH、ATP 水平及糖酵解關(guān)鍵酶HK、PK水平均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組HGC-27細(xì)胞GC、LDH、ATP、HK、PK水平比較（xˉ±s）

2.5 各組HGC-27 細(xì)胞AKT/STAT3 通路蛋白表達(dá)比較 NG 組、si-CENPU-NC 組、si-CENPU 組p-AKT/AKT 相對(duì)表達(dá)量分別為0.56 ± 0.09、0.58 ± 0.08、0.33 ± 0.05，p-STAT3/STAT3 相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.13、0.91±0.15、0.52±0.09，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞p-AKT/AKT、p-STAT3/STAT3 表達(dá)均降低（P均＜0.05）。

3 討論

癌細(xì)胞有絲分裂是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，DNA 在有絲分裂過程中可組裝成大的蛋白質(zhì)載體即著絲粒，進(jìn)而為細(xì)胞在有絲分裂中提供移動(dòng)動(dòng)力。CENPU 是CENP 家族成員之一，可以募集其他CENPs 如CENP-A 等及著絲粒，促進(jìn)癌細(xì)胞分裂［7-8］。王欣欣［9］研究顯示，CENPU 在肺癌組織中異常高表達(dá)，且可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究查閱Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan. path. uab.edu/analysis. html）結(jié)果顯示，MLF1IP 即CENPU 在胃腺癌組織中異常高表達(dá)，基于此本研究分析CENPU 在AGS、MKN45、HGC-27等不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常胃上皮細(xì)胞GES-1 細(xì)胞比較，AGS、MKN45、HGC-27 等胃癌細(xì)胞中CENPU mRNA 水平異常高表達(dá)，與數(shù)據(jù)庫中表達(dá)趨勢一致，且HGC-27 細(xì)胞中CENPU mRNA 水平最高。因此本研究以HGC-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，探究下調(diào)CENPU表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為及代謝的影響。

腫瘤細(xì)胞過度增殖是腫瘤進(jìn)展關(guān)鍵因素［10］。本研究結(jié)果顯示，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞增殖抑制率升高，克隆形成率降低。說明抑制CENPU表達(dá)可能抑制HGC-27細(xì)胞增殖。癌細(xì)胞異常代謝是癌癥發(fā)生發(fā)展的主要原因之一，為維持腫瘤細(xì)胞生存及滿足大分子合成需要，腫瘤細(xì)胞在缺氧或有氧條件下，將其能量代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒膺^程，為滿足癌細(xì)胞迅速增殖對(duì)能量的需求，癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量及消耗量均增加，并產(chǎn)生大量LDH，累積的LDH 可導(dǎo)致酸性微環(huán)境，細(xì)胞外基質(zhì)在酸性環(huán)境中變得相對(duì)不穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；此外，在糖酵解過程中有多種限速酶如PK、HK 等，直接影響糖酵解途徑［11-13］。研究表明，糖酵解途徑產(chǎn)生產(chǎn)生的ATP 水解釋放的能量，使著絲粒微管（著絲粒纖維）向細(xì)胞紡錘體極端延伸，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂［4］。CENPU 是著絲粒蛋白家族成員之一。本研究結(jié)果顯示，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU 組HGC-27 細(xì)胞GC、LDH、ATP 水平及糖酵解關(guān)鍵酶HK、PK 水平均降低。說明抑制CENPU表達(dá)可能抑制HGC-27細(xì)胞糖酵解過程。

癌細(xì)胞的生長和能量代謝過程復(fù)雜，AKT/STAT3 通路細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤中AKT異常活化并發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-AKT，進(jìn)而促進(jìn)下游基因STAT3 活化并發(fā)生磷酸化反應(yīng)生成p-STAT3，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、能量代謝［14-15］。周立強(qiáng)等［16］研究顯示，抑制AKT通路活化可抑制胃癌細(xì)胞增殖及糖酵解過程。王勝男等［17］研究顯示，抑制AKT/STAT3通路活化可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與NG 組、si-CENPU-NC 組比較，si-CENPU組HGC-27細(xì)胞p-AKT/AKT、p-STAT3/STAT3水平均降低。與既往研究結(jié)果一致，說明沉默CENPU表達(dá)可抑制HGC-27細(xì)胞增殖及糖酵解，可能通過抑制AKT/STAT3通路活化實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，沉默CENPU 表達(dá)可抑制HGC-27 細(xì)胞增殖及糖酵解，其機(jī)制可能通過抑制AKT/STAT3通路活化實(shí)現(xiàn)。