胃癌組織中miR-200a、miR-92a表達(dá)變化與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

郭青，趙艷爭(zhēng)，季艷霞，卓雷，王忠瑜，孫彩云

1 邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤四科，河北 邯鄲 056000；2 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院整形美容科

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示我國(guó)2019 年胃癌發(fā)病人數(shù)612 821 例，粗發(fā)病率為43.1/10 萬(wàn)胃，胃癌死亡人數(shù)421 539例，病死率為29.6/10 萬(wàn)，早期胃癌無(wú)特異性癥狀，檢出率低，患者預(yù)后較差［1］。微小核糖核酸（miRNAs）可通過(guò)與信使RNA（mRNA）結(jié)合誘導(dǎo)mRNA 降解，抑制蛋白翻譯調(diào)整下游基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖分化以及凋亡，在惡性腫瘤中，多數(shù)miRNAs 表達(dá)異常，發(fā)揮致癌或抑癌基因作用［2］?，F(xiàn)有研究顯示，miR-200a 在宮頸癌［3］、上皮性卵巢癌［4］、膀胱癌［5］等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與癌細(xì)胞增殖及腫瘤患者預(yù)后均有關(guān)。miR-92a 是與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成有關(guān)的miRNAs，miR-92a 表達(dá)異常與癌細(xì)胞惡性增殖分化、新生血管形成關(guān)系密切，miR-92a已被證實(shí)是結(jié)直腸癌［6］、食管癌［7］、前列腺癌［8］的潛在標(biāo)志物。2017 年1 月—2018 年4 月，我們檢測(cè)了104 例胃癌患者癌組織中miR-200a、miR-92a 表達(dá)，并探討其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年1 月—2018 年4 月邯鄲市中心醫(yī)院收治的104 例胃癌患者，男57 例、女47 例，年齡50～71（60.23 ± 6.79）歲；腫瘤直徑≥4 cm 55 例，＜4 cm 49 例；組織分化程度：低分化44例，高、中分化60 例；浸潤(rùn)深度：黏膜及黏膜下層34例，肌層、漿膜下及其外70 例；T 分期：T1-2期35 例，T3-4a期69例；N分期：N0期72例，N1-3期32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受胃癌根治手術(shù)治療，術(shù)后病理組織學(xué)證實(shí)為胃癌；②術(shù)前未接受放化療；③符合手術(shù)治療指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)證實(shí)的其他部位原發(fā)腫瘤；②pTNM 分期Ⅲ期以上，術(shù)前接受新輔助放化療患者或采取保守治療者；③隨訪期間失去聯(lián)系者。所有患者及其家屬均知情同意并簽署同意書。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-1204）。

1.2 miR-200a、miR-92a 表達(dá)檢測(cè)方法 手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本及癌旁（距離癌組織邊緣5 cm 以上）經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常胃組織，采用液氮冷凍保存。取胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本各0.2 g，采用JXFSTPRP-Ⅱ冷凍研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）研磨組織，加入TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司）提取組織中總RNA。采用Multiskan SkyHigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）選取OD260/OD280為1.8～2.0 樣本，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)賽默飛公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入RT-qPCR 反應(yīng)體系，CFX96實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析。反應(yīng)體系包括PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，cDNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，加水至20μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30 次，每個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間遞增1 s，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。引物設(shè)計(jì)由金斯瑞生物科技公司合成。miR-200a 正向引物：5′-GAGGATGAT TGCTGACGTGGA-3′，反向引物：5′-TCl CAGATGGTGAGCGAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度113 bp。miR-92a正向引物：5′-AGCTCTACGACTGTCACTCG-3′，反向引物：5′-GTATGCATTCTATCGTAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度108 bp。U6（內(nèi)參）正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，DYCZ-30C 雙板夾芯式垂直注塑電泳儀進(jìn)行凝膠成像分析。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-200a、miR-92a 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 胃癌患者出院后均定期電話隨訪，術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第2年每6個(gè)月隨訪1次，隨訪3 年。統(tǒng)計(jì)隨訪期間胃癌患者總生存和無(wú)瘤生存情況，總生存時(shí)間為自病理確診到全因死亡或隨訪結(jié)束時(shí)間，無(wú)瘤生存時(shí)間為自病理確診到腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、全因死亡或隨訪結(jié)束時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。Kolmogorov-SmiRnov 法檢驗(yàn)miR-200a、miR-92a 擬合優(yōu)度，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以-x±s表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 生存分析不同miR-200a、miR-92a 表達(dá)胃癌患者生存情況，Log-Rank檢驗(yàn)比較生存率差異，Cox回歸分析影響胃癌患者生存的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中miR-200a、miR-92a 表達(dá)比較 胃癌組織和癌旁組織中miR-200a 相對(duì)表達(dá)量分別為1.49±0.47、3.19±1.07，miR-92a 相對(duì)表達(dá)量分別為2.93 ± 0.48、1.24 ± 0.30，胃癌組織中miR-92a 表達(dá)高于癌旁組織（P＜0.05），miR-200a表達(dá)低于癌旁組織（P＜0.05）。

2.2 胃癌組織中miR-200a、miR-92a 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 浸潤(rùn)至肌層、漿膜下及其外、T3-4a期、N1-3期胃癌患者癌組織中miR-200a 表達(dá)低于浸潤(rùn)至黏膜及黏膜下層、T1-2期、N0胃癌患者（P均＜0.05），miR-92a 表達(dá)高于浸潤(rùn)至黏膜及黏膜下層、T1-2期、N0期胃癌患者（P均＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤直徑、組織分化程度miR-200a、miR-92a 表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中miR-200a、miR-92a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-200a、miR-92a 表達(dá)與胃癌患者生存的關(guān)系 隨訪期間胃癌死亡33 例，復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果示miR-200a＜1.49（56例）胃癌患者3年總生存率為58.93%（33/56），3年無(wú)瘤生存率為44.64%（25/56），低于miR-200a≥1.49（48 例）胃癌患者的79.17%（38/48）、70.83%（34/48），miR-92a≥2.93（57例）胃癌患者3年總生存率為61.40%（35/57），3 年無(wú)瘤生存率為45.61%（26/57），低于miR-92a＜2.93（47 例）胃癌患者的78.72%（37/47）、70.21%（33/47）（Log-Rankχ2miR-200a 分別為5.177、8.089，P分別為0.023、0.005；Log-Rankχ2miR-92a 分別為3.990、8.392，P分別為0.046、0.004）。

2.4 影響胃癌患者預(yù)后的Cox 回歸分析 單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，T 分期、N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93 與胃癌患者預(yù)后有關(guān)（P均＜0.05），見(jiàn)表2。多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93是胃癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 影響胃癌患者預(yù)后的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

表3 影響胃癌患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

胃癌是全球第五大常見(jiàn)癌癥和第三大癌癥死亡原因，幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽攝入量、水果和蔬菜攝入量低是胃癌發(fā)病的高危因素。胃癌早期以上腹不適、反酸、噯氣、食欲減退等非特異性癥狀為主，易與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病混淆，早期檢出率低，多數(shù)患者確診即晚期，生存率低［9］。miRNAs 是廣受關(guān)注的新型小分子非編碼RNA，通過(guò)抑制mRNA 翻譯或促進(jìn)mRNA 降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與惡性腫瘤、心血管疾病、代謝疾病在內(nèi)的多種疾病病理過(guò)程［10］?，F(xiàn)有研究顯示，多種miRNAs參與胃癌的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程［11-12］。

miR-200a 是上皮表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，位于1號(hào)染色體，主要表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞器周邊，可靶向E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子E 盒鋅指蛋白1、Smad相互作用蛋白1 調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移［13］。研究顯示，miR-200a 在乳腺癌中通過(guò)抑制致癌基因—去乙酰化酶沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1表達(dá)抑制乳腺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程［14］。miR-200a 在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)miR-200a可上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1-α 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、集落形成和侵襲［3］。miR-200a 被認(rèn)為是浸潤(rùn)性膀胱癌侵襲的正向調(diào)節(jié)因子，miR-200a 通過(guò)抑制miR-16 表達(dá)，上調(diào)c-Jun 氨基末端激酶2 表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶-2 轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致浸潤(rùn)性膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。本研究結(jié)果表明，miR-200a 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-200a 低表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、T 分期、N 分期均有關(guān)，這與miR-200a 在乳腺癌［14］的作用機(jī)制一致，但與宮頸癌、膀胱癌［3，15］的作用機(jī)制相反，說(shuō)明miR-200a 在不同惡性腫瘤中可能發(fā)揮不同作用。基礎(chǔ)研究顯示，miR-200a 過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)蛋白3表達(dá)和受體相互作用蛋白激酶1泛素化，促進(jìn)半光天冬酶-8 裂解，腫瘤壞死因子-α 相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體激活，引起胃癌細(xì)胞凋亡［16］。miR-200a-3p還可通過(guò)與Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子12 的3'-UTR 區(qū)結(jié)合抑制Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子12 表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯于G1/S 期，抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移，促使胃癌細(xì)胞凋亡［17］。由此可見(jiàn)在胃癌中miR-200a 可能發(fā)揮抑癌基因作用，miR-200a 表達(dá)缺失可能是胃癌惡性進(jìn)展的原因之一。通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-200a 低表達(dá)與胃癌患者低生存率有關(guān)，miR-200a 低表達(dá)是胃癌患者術(shù)后生存率低下的原因，提示miR-200a 可以作為胃癌預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)。

miR-17～92 基因簇位于染色體基因座13q31.3，編碼miR-92a、miR-17、miR-18a、miR-19a/b、miR-20a，其中miR-92a是目前研究最多的miRNAs 之一，可調(diào)控心、肺、免疫系統(tǒng)等器官發(fā)育及血管形成過(guò)程，在惡性腫瘤中，miR-92a 可促使腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮致癌基因作用［18］。miR-92a 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)直接靶向抑制抑癌基因-RECK表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，促使癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［19］。miR-92a-3p 可通過(guò)Toll 樣受體7/8 依賴性方式刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6，促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［20］。miR-92a-3p還可通過(guò)調(diào)控EGFR、K-RAS和PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)，參與肺腺癌和肺鱗癌發(fā)病和進(jìn)展［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-92a 表達(dá)升高，miR-92a 表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、T分期、N分期有關(guān)，說(shuō)明miR-92a過(guò)表達(dá)與胃癌發(fā)生及惡性侵襲行為有關(guān)。miR-92a 參與胃癌的發(fā)病機(jī)制：Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2可抑制腫瘤發(fā)生，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，是miR-92a-3p的直接靶標(biāo)，miR-92a-3p通過(guò)靶向抑制Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2 表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲［22］。其次，F(xiàn) 框/WD-40 域蛋白7（FBXW 7）是一種抑癌基因，F(xiàn)BXW 7 過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖，促使癌細(xì)胞凋亡，miR-92a 可靶向抑制FBXW 7 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并減少胃癌細(xì)胞凋亡［23］。因此，miR-92a 過(guò)表達(dá)可能促使胃癌細(xì)胞惡性增殖以及侵襲和轉(zhuǎn)移，在胃癌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮促癌基因作用。生存和回歸分析結(jié)果顯示，miR-92a與胃癌患者術(shù)后生存有關(guān)，miR-92a高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示miR-92a是胃癌患者預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。REN 等［24］認(rèn)為，miR-92a 是胃癌患者生存期縮短的重要預(yù)測(cè)因子。

miR-200a、miR-92a 在胃癌發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程中是否存在相互作用仍不清楚，但兩者均與胃癌浸潤(rùn)深度、T 分期、N 分期和生存率有關(guān)，說(shuō)明miR-200a、miR-92a 可能共同參與胃癌發(fā)生發(fā)展。本研究選擇miR-200a、miR-92a 兩個(gè)指標(biāo)原因?yàn)閱蝹€(gè)指標(biāo)不能反映胃癌病情進(jìn)展，綜合兩個(gè)指標(biāo)可以更全面判斷病情進(jìn)展方向，為預(yù)后評(píng)估提供更可靠指導(dǎo)。

綜上所述，胃癌組織中miR-200a 表達(dá)下調(diào)，miR-92a表達(dá)上調(diào)，miR-200a、miR-92a 可作為胃癌病情分析和預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。本研究不足之處在于只檢測(cè)了早期根治術(shù)患者的數(shù)據(jù)，對(duì)于晚期胃癌miR-200a、miR-92a 表達(dá)特點(diǎn)，其與晚期胃癌惡性指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究探討。