培土清心方降低人肥大細胞HMC1.1突變株與HMC1.2突變株細胞增殖活性及對HMC1.1突變株相關(guān)信號通路的影響研究

晏烽根 吳清 吳汶豐 劉俊峰 賈金靖 葉思祺 張瑜 莫秀梅 陳達燦

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是最為常見的慢性炎癥性皮膚病，AD終生患病率高達20%，瘙癢是嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的因素之一[1]。瘙癢—搔抓的惡性循環(huán)可進一步破壞皮膚屏障，加重瘙癢和皮膚炎癥反應(yīng)。肥大細胞在免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的皮膚風(fēng)團反應(yīng)及其相關(guān)的AD瘙癢中至關(guān)重要，肥大細胞作為特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵效應(yīng)免疫細胞之一，通過增殖活化釋放炎癥介質(zhì)或與神經(jīng)系統(tǒng)的雙向相互作用參與了特應(yīng)性皮炎的病理機制及療效作用[2-6]?；谔貞?yīng)性皮炎心火脾虛的中醫(yī)核心病機，筆者團隊總結(jié)形成了培土清心方，前期研究表明培土清心方可減輕特應(yīng)性皮炎小鼠模型瘙癢癥狀及減少肥大細胞浸潤[7-8]，然而相關(guān)作用機制尚不清楚。研究顯示，肥大細胞增生與C-kit基因點突變尤其是Asp816Val(D816V)及 Val560Gly(V560G)的位點突變密切相關(guān)[9]，已廣泛采用細胞株HMC1.1(V560G位點突變)與HMC1.2(D816V和V560G兩個位點突變)用于開展研究[10]。故本研究通過體外實驗探討培土清心方對人肥大細胞HMC1.1突變株與HMC1.2突變株細胞增殖活性及對HMC1.1突變株相關(guān)信號通路的影響，為培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的療效機制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及培養(yǎng)條件

人肥大細胞突變株HMC1.1：突變位點為C-kit蛋白中的560位點，由纈氨酸(Val)突變?yōu)楦拾彼?Gly)即：氨基酸密碼子由GTC到GGC(V560G)；人肥大細胞突變株HMC1.2(560，816)：突變位點為C-kit蛋白中的Val560Gly(V560G)及816位點，由天冬氨酸(Asp)突變?yōu)槔i氨酸(Val)即：氨基酸密碼子由GAC到GTC(D816V)均購自美國Millipore。

細胞培養(yǎng)在10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的IMDM培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)條件為37℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗藥物及其制備

培土清心方已獲得專利授權(quán)(專利號：ZL2013 1 0328668.4)，處方：白術(shù)10 g、連翹10 g、太子參10 g、白茅根15 g、白鮮皮10 g、山藥15 g、薏苡仁10 g、甘草5 g、珍珠粉0.3 g。培土清心方的浸膏由廣東省中醫(yī)院廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院黎雄博士課題組自制(編號：20190103)，濃度為2 g/mL。復(fù)方配制為將100 mg 培土清心方浸膏溶于10 mL含10%FBS的IMDM完全培養(yǎng)基中，渦旋混勻后配置成10 mg/mL的培土清心方母液，過濾除菌后分裝于-20 ℃保存?zhèn)溆谩８髦兴巻误w購于成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 主要儀器及試劑

超凈工作臺(ESCO公司)；水浴鍋(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司，型號：CKX41)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，型號：Thermo2838)；酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司，型號：VICTOR X5型)。

IMDM細胞培養(yǎng)基、FBS(Thermo公司)；2,4-二硝基甲苯(Sigma-Aldrich公司)；青霉素/鏈霉素雙抗(Millipore公司)；蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(Roche公司)；Phospho-C-kit(Y703)抗體、Phospho-C-kit(Y719)抗體C-kit抗體、Phospho-Stat1(Y701)抗體、Phospho-Stat3(S727)抗體、Stat1抗體、Stat3抗體(Cell signaIing technology公司)；Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)、鈣離子載體A23187、地塞米松(Sigma-Aldrich 公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.4 Cell Counting Kit-8檢測培土清心方對細胞增殖活性的影響

將細胞接種于96孔板中，96孔板設(shè)立空白對照組、陰性對照組及實驗組。細胞種板密度為1×104個每孔100 μL。培土清心方實驗組設(shè)立不同濃度，分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL，每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。作用時間點分別為24小時、48小時和72小時，實驗重復(fù)三次。在不同藥物濃度作用各時間點后加入10 μL每孔的CCK-8試劑，再孵育4小時后，酶標(biāo)儀在波長450 nm檢測各孔吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測培土清心方對HMC1.1細胞C-kit/Stat信號通路的影響

取對數(shù)生長期的HMC1.1細胞接種于6 孔板，細胞密度為1.5×106個/mL，先加培土清心方各劑量處理2小時后，再加刺激劑培養(yǎng)24小時后棄去培養(yǎng)液，細胞實驗刺激劑為十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA，0.05 μmol/L)和鈣離子載體A23187(1.0 μmol/L)，細胞陽性對照藥為地塞米松(Dexamethasone, DEX, 0.1 μmol/L)。收集各組HMC1.1細胞，分別加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，待測樣品測定蛋白濃度后進行蛋白變性，然后取相同蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳，然后將電泳后的蛋白濕法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。室溫封閉1小時后，經(jīng)目標(biāo)抗體4℃孵育過夜。然后洗膜3次，每次5 分鐘，加入相對應(yīng)二抗(1∶ 5000)室溫孵育1小時，PBST 清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像。以GAPDH 抗體為內(nèi)參，進行灰度值分析。 實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 培土清心方降低肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性

培土清心方作用于HMC1.1和HMC1.2細胞24小時，與正常對照組比較，細胞增殖活性無顯著差異(P>0.05)。培土清心方0.25 mg/mL及高劑量作用于HMC1.1與HMC1.2細胞48小時后能顯著抑制細胞增殖(P<0.05)，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。培土清心方作用HMC1.1與HMC1.2細胞72小時也呈現(xiàn)劑量依賴性抑制細胞增殖活性作用。尤其是對HMC1.1細胞增殖抑制更為明顯，見表1、2。

2.2 培土清心方對HMC1.1細胞相關(guān)信號通路的影響

基于“2.1 培土清心方降低肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性”實驗結(jié)果，得出培土清心方對HMC1.1細胞抑制作用更加明顯，尤其是高劑量。因此，后期探討培土清心方作用的機制研究將采用HMC1.1細胞進行。

培土清心方對HMC1.1細胞作用8小時后，培土清心方可降低Phospho-C-kit(Y703)蛋白表達的趨勢，尤其在高劑量能明顯降低該蛋白表達，比地塞米松陽性藥組(DEX組)更加明顯，見圖1A、表3。同時，檢測了培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)蛋白的作用，與刺激組(P/A組)比較，培土清心方各劑量組具有一定量降低Phospho-C-kit(Y719)蛋白表達的作用。尤其在培土清心方高劑量組，見圖1B、表4。

表3 培土清心方對Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白表達的影響

表4 培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白表達的影響

進一步檢測了C-kit/Stat信號通路的Stat相關(guān)蛋白。培土清心方作用HMC1.1細胞8小時的時間點下，培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表達具有下調(diào)趨勢，尤其在培土清心方高劑量下調(diào)作用更加明顯，并且呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)作用，見圖2A、表5。此外，檢測了培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3的作用，培土清心方高劑量與刺激組(P/A組)比較無明顯差異，見圖2B、表6。

表2 培土清心方對HMC1.2細胞增殖活性的影響

注：A：培土清心方對Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白的作用；B：培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白的作用。圖1 培土清心方對HMC1.1細胞Phospho-C-kit及C-kit表達電泳圖

注：A：培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白的作用；B：培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白的作用。圖2 培土清心方對HMC1.1細胞Phospho-Stat1、Stat1、Phospho-Stat3及Stat3表達電泳圖

表5 培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白表達的影響

表6 培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白表達的影響

3 討論

中醫(yī)藥治療特應(yīng)性皮炎可發(fā)揮抗菌消炎、抗變態(tài)反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用，具有一定的優(yōu)勢及特色[11]。培土清心方是我們團隊對特應(yīng)性皮炎患者的長期臨床診治，從而總結(jié)形成的經(jīng)驗方。處方現(xiàn)已獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局專利保護授權(quán)(專利號：ZL2013 1 0328668.4)。前期培土清心方對特應(yīng)性皮炎療效研究包括國家自然科學(xué)基金等多個課題進行了探討。既往的研究表明其發(fā)揮了多維度、多靶點的藥理作用。在臨床癥狀改善方面，培土清心方能明顯改善患者皮損嚴(yán)重程度[12-15]、瘙癢及睡眠[16]。且前期動物實驗表明，培土清心方可緩解特應(yīng)性皮炎小鼠模型瘙癢癥狀及減少肥大細胞浸潤[7-8]。但培土清心方緩解瘙癢、減少肥大細胞浸潤的機制尚不明確，對HMC1.1及HMC1.2的增殖作用及相關(guān)機制亦無探討。

特應(yīng)性皮炎也稱為特應(yīng)性濕疹，是一種慢性炎癥性皮膚病，其主要的臨床特征為反復(fù)發(fā)作的濕疹樣皮損改變和劇烈瘙癢。特應(yīng)性皮炎的病理機制涉及表皮屏障、皮膚微生物組異常和主要的2型炎癥免疫失調(diào)之間的復(fù)雜相互作用[17]。肥大細胞與 AD發(fā)病機制密切相關(guān)，研究表明，AD 患者皮膚中存在Th2細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，肥大細胞釋放多種物質(zhì)，如類胰蛋白酶、組胺和白介素31(interleuk in-31,IL-31)，可與皮膚神經(jīng)末梢的相應(yīng)受體結(jié)合，產(chǎn)生瘙癢[18]。Yamashita 等[19]運用半抗原和賦形劑刺激肥大細胞缺陷 Kit Sl/Sl-d小鼠，以誘導(dǎo)AD模型，盡管小鼠出現(xiàn)表皮增厚和炎癥細胞浸潤的病理表現(xiàn)，以及IgE水平升高，但半抗原刺激的小鼠搔抓行為并未增強，這表明AD的瘙癢需要肥大細胞的參與。此外，IgE與肥大細胞上的特定受體FCεRI交聯(lián)，導(dǎo)致肥大細胞脫粒并釋放過敏性介質(zhì)(組胺，前列腺素，白三烯，單核細胞趨化蛋白1，IL-6和IL-8)。這些過敏介質(zhì)與TH1釋放的介質(zhì)相互作用，加速了AD的疾病進程[20]?？乖?IgE 介導(dǎo)的肥大細胞活化是一個多步驟過程,FcεRI 介導(dǎo)的激活事件受其他表面受體(如 KIT、腺苷受體、前列腺素受體和許多其他受體)的參與調(diào)節(jié)[21]。故本研究以人肥大細胞HMC1.1及HMC1.2為研究模型，探討培土清心方對其增殖活性的影響，以期闡釋培土清心方緩解AD瘙癢的作用機制。

肥大細胞增殖與C-kit及其配體密切相關(guān)。C-kit 基因編碼跨膜受體酪氨酸激酶，C-kit基因產(chǎn)物在細胞生長和分化中具有重要功能。 C-kit的配體為一種新型生長因子，該因子也被稱為肥大細胞生長因子，現(xiàn)常稱為干細胞因子(Stem Cell Factor，SCF)。在人類皮膚中，肥大細胞和表皮黑色素細胞是僅有的表達 KIT 受體的細胞[22]。組織中肥大細胞數(shù)量的調(diào)節(jié)取決于從骨髓產(chǎn)生肥大細胞前體的速率和成熟肥大細胞在組織內(nèi)的存活時間。肥大細胞在IL-3和 C-kit 配體(SCF)的影響下從骨髓發(fā)育而來。SCF 促進肥大細胞增殖可被其他細胞因子增強，如IL-4 和 IL-10[23]。SCF 與其受體 C-kit (CD117) 之間的相互作用具有酪氨酸激酶活性，可誘導(dǎo)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，促進肥大細胞的分化、增殖、趨化和成熟。缺乏 SCF 或 C-kit 的小鼠基本也缺乏肥大細胞 ，可見C-kit與 SCF 對肥大細胞的存活和發(fā)育起著關(guān)鍵作用[24]。

AD患者的苔蘚樣病變中可觀察到肥大細胞數(shù)量增加。由于 SCF 是肥大細胞最重要的有絲分裂原和化學(xué)引誘劑，SCF 與其受體C-kit的相互作用可能是 AD 病變中肥大細胞募集和增殖的重要事件。患者血清sSCF 和 sKIT 水平可能是評估AD 疾病活動度和嚴(yán)重程度的有用指標(biāo)[25]。

本實驗采用Cell Counting Kit-8檢測法，研究培土清心方對肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示培土清心方顯著抑制肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性，并呈劑量依賴性，其中HMC1.1的增殖活性抑制更為明顯。該結(jié)果表明，培土清心方可抑制肥大細胞增殖活性，從而為培土清心方緩解AD瘙癢及減輕肥大細胞浸潤提供依據(jù)。其對HMC1.1的增殖具有更強的抑制作用，可能與其V560G位點突變相關(guān)。

Kit的酪氨酸激酶活性對STAT信號激活至關(guān)重要，C-kit 的不同細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域參與了各種STAT蛋白的激活[26]。激活的 Kit可刺激MAPK、JAK-STAT和mTOR等細胞內(nèi)通路。JAK2與C-kit 結(jié)合并在 SCF 刺激后磷酸化，JAK2激活導(dǎo)致 STAT 1α、STAT 3、STAT 5A 和STAT 5B的磷酸化[27]。其中，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的優(yōu)先信號通路，而mTORC1/4E-BP1通路優(yōu)先連接到 KIT(D816V)。這些關(guān)鍵信號通路的抑制導(dǎo)致程序性細胞死亡[28]。JAK-STAT信號通路在AD的病理生理機制中發(fā)揮重要作用[29]。在體外實驗中，IL-9 通過激活 STAT 3 刺激人肥大細胞產(chǎn)生 VEGF[30]。AD 動物模型中肥大細胞 VEGF 生成和血管生成的顯著增加也支持 JAK-STAT 在該免疫途徑中的作用[31-32]。

如上所述，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的優(yōu)先信號通路，且肥大細胞增殖與C-kit及其配體密切相關(guān)。故本研究進一步利用Western Blot 檢測培土清心方給藥后對HMC1.1細胞的C-kit及Stat相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果表明，培土清心方作用8小時后，各劑量組具有降低Phospho-C-kit(Y703)、Phospho-C-kit(Y719)蛋白表達的趨勢。故培土清心方可能通過減少C-kit蛋白的表達，從而抑制肥大細胞的增殖。此外，JAK-STAT作為其下游通路，蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果亦表明，培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表達具有下調(diào)趨勢，尤其在高劑量，其下調(diào)作用更加明顯，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

綜上所述，本研究利用HMC1.1及HMC1.2細胞模型，闡明培土清心方可顯著抑制HMC1.1及HMC1.2細胞增殖活性。培土清心方可能通過抑制C-kit/Stat信號通路，從而降低HMC1.1細胞的增殖活性。該研究為臨床應(yīng)用培土清心方緩解特應(yīng)性皮炎瘙癢癥狀提供新的理論基礎(chǔ)和研究方向。但本文仍有一定的局限性，需要開展進一步的動物實驗以驗證上述結(jié)果。