多劑量光動(dòng)力聯(lián)合姜黃素治療宮頸癌體外移植瘤及腫瘤組織中腫瘤壞死因子-α、半胱氨酸蛋白酶-8的表達(dá)研究

牟天龍 劉慧敏 潘彥舒 賀桂芳 李占穩(wěn) 郭婕 龐大承 翟臻 吳自旭

宮頸癌是目前危害女性健康的第二大惡性腫瘤，具有高發(fā)病率，高病死率、發(fā)病年齡年輕化的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT) 是近年來(lái)新興的一種療法，具有操作簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小、定位準(zhǔn)確、治療時(shí)間短，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療方面有著廣闊的前景[2]。目前唯一批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的光敏劑為苯卟啉衍生物單環(huán)酸A，此外常用于實(shí)驗(yàn)研究的還有5-氨基酮戊酸等，這些均屬于二代光敏劑。但因傳統(tǒng)光敏劑有著對(duì)皮膚、眼睛及呼吸系統(tǒng)等不同程度的刺激作用，且本身并不具有良好的抑瘤效果，因此需要一種更為合理的光敏劑。1985年印度學(xué)者首先報(bào)道了姜黃素的抑瘤作用，且其本身可食用，毒副作用低，目前美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥[3]。此外，姜黃素具有較好的光敏性，既能夠協(xié)同、也能單獨(dú)發(fā)揮抗癌功效，這在本研究團(tuán)隊(duì)過(guò)去的研究中已經(jīng)證實(shí)[4]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇姜黃素做為光敏劑聯(lián)合不同劑量及治療頻次的光動(dòng)力療法進(jìn)行研究，以便找到合理的治療參數(shù)，同時(shí)對(duì)其抑瘤機(jī)理做進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

雌性 BALB/c 裸鼠60只 (北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK(京)2016-0011)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(京)2017-0033 ，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室IVC動(dòng)物房，倫理審批號(hào)：BUCM-4-2018122101-4065。宮頸癌Hela細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng))。

1.2 主要儀器及試劑

姜黃素(Bioruler 公司，美國(guó)，貨號(hào)：RB12712，規(guī)格20 mg)。445 nm激光器(北京鐳志威光技術(shù)有限公司 BL18111611)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(abcam-ab6671)，半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)(abcam-Ab25901)，山羊抗兔二抗，即用型二步法檢測(cè)試劑盒 PV9000(北京中杉金橋)， BCA蛋白定量試劑盒、eECL-Westen Blot高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、光譜彩虹預(yù)染蛋白Marker(康為世紀(jì)公司)，組織細(xì)胞裂解液(北京普利萊公司)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)Eppendorf(USA)，凝膠成像分析系統(tǒng)Tanton-4500(CHN) 。

1.3 造模

體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞調(diào)整為2.5×107/mL，每只裸鼠背部皮下注入100 μL，約2.5×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一周的潛伏期，可見(jiàn)背部出現(xiàn)米粒大小的腫塊，提示造模成功(成模率100%)，待腫塊直徑為0.8～1.0 cm時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，具體造模方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)4。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 光照參數(shù) 具體光動(dòng)力治療儀參數(shù)如下：光動(dòng)力治療儀為432 nm波長(zhǎng)，0.60 A，0.54 W，距離腫瘤表面3～5 cm，照射時(shí)間為14秒時(shí)，能量為40 J/cm2；照射時(shí)間為21秒時(shí)，能量為60 J/cm2；照射時(shí)間為28秒時(shí)，能量為80 J/cm2。(既往實(shí)驗(yàn)研究中，采用100 J/cm2的光照劑量時(shí)，腫瘤表面皮膚出現(xiàn)變黑、干枯、壞死的情況，副作用損傷過(guò)于明顯，同時(shí)影響了后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)降低了光照劑量，意在降低對(duì)皮膚的損傷及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾因素)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及治療方法 將制備好的模型隨機(jī)分為10組，每組6只，1～9組給予50 mmol/L濃度的姜黃素100 μL，于腫瘤內(nèi)部多點(diǎn)均勻注射。具體分組情況如下：組1為：姜黃素+1次40 J/cm2的光照治療；組2為：姜黃素+1次40 J/cm2，24小時(shí)后重復(fù)40 J/cm2的光照治療，組3為：姜黃素+1次40 J/cm2，并分別于24小時(shí)及48小時(shí)后再次分別給予1次40 J/cm2的光照治療；組4為姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療；組5為：姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療，24小時(shí)后，重復(fù)給予1次60 J/cm2的光照治療，組6為：姜黃素+1次60 J/cm2的光照治療，并于首次光照治療后24小時(shí)及48小時(shí)分別給予1次60 J/cm2的光照治療；組7為：姜黃素+1次80 J/cm2光照治療；組8為：姜黃素+1次80 J/cm2的光照治療，24小時(shí)后重復(fù)1次80 J/cm2的光照治療，組9為：姜黃素+1次80 J/cm2的光照治療，并于首次治療后24小時(shí)及48小時(shí)分別給予1次80 J/cm2的光照治療；組10為模型組：皮下注射生理鹽水，給予正常燈光照射。各組均于完成最后1次治療后24小時(shí)取材。模型組為成模1天后取材。取材后，每只裸鼠背部腫瘤一半置于固定液中用于蘇木精—伊紅染色( hematoxylin-eosin staining，HE)觀察及免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一半置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡(Western-Blot，WB)法檢測(cè)。

1.5 HE觀察各組腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

將取出的瘤體迅速置于4%的多聚甲醛溶液中充分固定，使用脫水機(jī)常規(guī)脫水、經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后，顯微鏡觀察并對(duì)比各組間腫瘤組織及細(xì)胞學(xué)改變，有無(wú)組織壞死及細(xì)胞凋亡情況。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腫瘤組織TNF-α及Caspase-8的蛋白表達(dá)情況

將制備好的切片脫蠟處理，枸櫞酸鈉熱修復(fù)，經(jīng)一抗孵育(4℃過(guò)夜)、PBS沖洗，二抗37℃ 孵育20分鐘，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染、鹽酸酒精分化后，脫水、封片。圖片使用Image Pro Plus免疫組化分析軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)出積分光密度(integrated optical density，IOD)及陽(yáng)性細(xì)胞面積(AREA)數(shù)值，以IOD/AREA的數(shù)值為最終結(jié)果[5]。

1.7 WB法檢測(cè)

取腫瘤組織剪碎，加入細(xì)胞裂解液充分裂解后，離心取上清。BCA 測(cè)定蛋白濃度后，加入loading-buffer煮沸，使蛋白充分變性，分裝備用；樣本SDS-PAGE電泳后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過(guò)夜、二抗孵育后顯色拍照，灰度值采用Image J軟件分析。以各組的灰度值/對(duì)應(yīng)β-acting的灰度值為最終結(jié)果[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠腫瘤的肉眼觀察及病理學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 肉眼觀察 各組在三種不同的光照下，均未出現(xiàn)(周邊)皮膚干枯、變黑及壞死的情況，證明所選劑量不會(huì)對(duì)周邊正常組織造成損傷。

2.1.2 病理學(xué)評(píng)價(jià) 模型組腫瘤組織呈實(shí)性、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞核大，深染，染色質(zhì)粗糙，核漿比高，異型性明顯。經(jīng)姜黃素聯(lián)合光動(dòng)力治療后，各組腫瘤組織均有不同程度的壞死，腫瘤組織排列稀疏，有裂隙，腫瘤細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核有固縮，部分可見(jiàn)核周空暈甚至泡狀核。在同等照射強(qiáng)度下，治療次數(shù)越多，壞死情況越顯著；同等治療次數(shù)條件下，光照劑量小的較為明顯，其中以組3(小劑量3次治療組)壞死最為明顯。如圖1。

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次，組10為模型組。圖1 各組裸鼠腫瘤組織HE染色圖片(HE，×200)

2.2 各組裸鼠TNF-α及Caspase-8的免疫組織化學(xué)表達(dá)情況

模型組TNF-α表達(dá)較低，其余各組較模型組表達(dá)均有不同程度的升高，其中組1、2、3、4、6、8有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。在同等光照強(qiáng)度下：組1、2、3間比較，組3表達(dá)高于組2及組1，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；組4、5、6間比較，組4高于組5(P<0.01)，組6高于組5(P<0.01)，組4及組6間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，組7低于組8，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，組7高于組9(P<0.01)，組8高于組9(P<0.01)。同等治療次數(shù)下：組1、4、7間比較，組7表達(dá)低于組1及組4(P<0.01)，組1及組4間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組2、5、8間比較，組2高于組5及組8(P<0.01)，組5與組8間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組3、6、9間比較，組3高于組6及組9(P<0.01)，組6高于組9(P<0.01)。綜上分析，小劑量光照聯(lián)合多次治療時(shí)，TNF-α表達(dá)最顯著。見(jiàn)圖2，表1。

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次，組10為模型組。圖2 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α免疫組化表達(dá)圖片(IHC，×200)

模型組Caspase-8表達(dá)較偏低，組2～8較模型組相比Caspase-8表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其余各組間比較，同等光照強(qiáng)度下：組1、2、3間比較，組3表達(dá)高于組2(P<0.01)，組3高于組1(P<0.01)；組4、5、6間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同等治療次數(shù)下：組1、4、7間比較，組4高于組7及組1，組1和組4間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；組2、5、8間比較，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組3、6、9間比較，組3高于組6(P<0.05)，組3高于組9(P<0.01)。綜上分析，小劑量光照聯(lián)合多次治療時(shí)Caspase-8表達(dá)最顯著。見(jiàn)圖3，表1。

表1 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α及Caspase-8免疫組化表達(dá)比較

注：組1～3光照40 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組4～6光照60 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次；組7～9光照80 J/cm2，治療次數(shù)分別為1～3次，組10為模型組。圖3 各組裸鼠腫瘤組織Caspase-8免疫組化表達(dá)圖片(IHC，×200)

2.3 各組大裸TNF-α及Caspase-8的WB表達(dá)情況

TNF-α表達(dá)：與模型組相比，組1、2、3、5、6表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。同等光照強(qiáng)度下：組1、2、3間比較，組2及組3均較組1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，組3高于組2(P<0.01)；組4、5、6間比較，組5高于組6及組4(P<0.01)，組6高于組4(P<0.01)；組7、8、9間比較，組9及組8均較組7有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，組8及組9間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。同等治療次數(shù)下：組1、4、7間比較，組1高于組4及組7(P<0.01)，組4與組7間無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組2、5、8間比較，組2高于組5，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，組2高于組8(P<0.01)，組5高于組8(P<0.01)；組3、6、9間比較，組3高于組6及組9(P<0.01)，組6高于組9(P<0.01)。見(jiàn)圖4，表2。

Caspase-8表達(dá)：與模型組相比，組3、5、6、7、8、9表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。同等光照強(qiáng)度下：組1、2、3間比較，組2及組3均高于組1(P<0.01)，組3高于組2(P<0.01)；組4、5、6間比較，組5高于組4(P<0.05)，組6高于組4(P<0.01)，組5及組6間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組7、8、9間比較，組7與組8間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，組7高于組9(P<0.01)，組8高于組9(P<0.01)。同等治療次數(shù)下：組1、4、7間比較，組7高于組4及組1(P<0.01)，組4高于組1(P<0.01)；組2、5、8間比較，組2低于組5及組8(P<0.01)，組5低于組8(P<0.01)；組3、6、9間比較，組3高于組6(P<0.05)，組3高于組9(P<0.01)，組6及組9間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖4，表2。

綜上分析，同等光照強(qiáng)度下，TNF-α表達(dá)與治療次數(shù)呈正相關(guān)趨勢(shì)；在同等治療次數(shù)的條件下，TNF-α表達(dá)與光照強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。同等光照強(qiáng)度下，Caspase-8的表達(dá)與治療次數(shù)呈正相關(guān)性，而在同等治療次數(shù)的條件下，當(dāng)治療1～2次時(shí)，Caspase-8表達(dá)與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)；當(dāng)治療次數(shù)為3次時(shí)，Caspase-8表達(dá)與光照強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)光照強(qiáng)度為40 J/cm2，治療次數(shù)為3次時(shí)，TNF-α與Caspase-8表達(dá)最為顯著。見(jiàn)圖4，表2。

圖4 各組祼鼠腫瘤組織WB表達(dá)結(jié)果

表2 各組裸鼠腫瘤組織TNF-α及Caspase-8WB表達(dá)結(jié)果

3 討論

宮頸癌是危害女性生命健康的第二大惡性腫瘤，近年來(lái)研究表明，其發(fā)病年齡呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)[1]。光動(dòng)力療法是一種無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的新型治療技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)患者傷害小、治療后可保護(hù)器官結(jié)構(gòu)的完整性以及可重復(fù)治療等優(yōu)勢(shì)[2]，且光動(dòng)力治療能使包括宮頸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，增加細(xì)胞毒性、降低細(xì)胞的增值力和活性[4,7-9]。光敏劑的選擇對(duì)于光動(dòng)力治療的效果尤為重要。傳統(tǒng)光敏劑為化學(xué)性光敏劑，雖然具有較好的光敏活性，但對(duì)身體具有一定的副作用，如刺激眼睛、皮膚及呼吸系統(tǒng)等。而姜黃素是中藥提取物，相較于傳統(tǒng)化學(xué)光敏劑，除了同樣具有較強(qiáng)的光敏性以外，還具有毒副作用低，自身殺滅腫瘤的功能，在前期研究中將姜黃素聯(lián)合光動(dòng)力治療宮頸癌已取得滿意療效[3]，但由于對(duì)光照劑量及頻次的把握不足，在治療時(shí)造成了皮膚組織的損傷，因此本實(shí)驗(yàn)在光動(dòng)力療法的光照劑量及治療頻次方面進(jìn)行了細(xì)致研究，并對(duì)其機(jī)制做進(jìn)一步研究。

TNF-α超家族是一種死亡受體，有富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和死亡結(jié)構(gòu)域組成，在傳遞與細(xì)胞死亡有關(guān)的信息方面，發(fā)揮著重要作用。特別是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如參與組織細(xì)胞的損傷與壞死，并介導(dǎo)其他細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞的增生、分化以及凋亡等[11]。對(duì)于最初TNF-α的研究表明，其能夠誘導(dǎo)癌組織的快速出血和壞死[12]，但隨著近些年研究的深入，對(duì)TNF-α的主要研究更傾向于其促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[13]。在對(duì)腫瘤及周邊正常組織的研究中發(fā)現(xiàn)，正常組織中TNF-α的表達(dá)為陰性，而對(duì)研究的腫瘤組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TNF-α出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)[14]，扮演著促進(jìn)腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)的角色。因此TNF-α在腫瘤中的表達(dá)中具有雙向性，這可能與腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體有關(guān)[15-16]。TRAIL在人類中有四個(gè)受體[17]，兩個(gè)死亡受體(death receptor，DR)4和DR5，以及兩個(gè)誘騙受體(decoy receptor，DcR)1和DcR2，TNF-α能和兩個(gè)死亡受體結(jié)合形成死亡結(jié)構(gòu)域，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而誘騙受體則以相似的結(jié)合力和競(jìng)爭(zhēng)力與TRAIL結(jié)合，由于缺乏胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[18]，并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，配體有受體的復(fù)雜關(guān)系，越來(lái)越多的應(yīng)用于癌癥的治療。當(dāng)TNF-α被激活后，可以招募下游的Fas相關(guān)受體死亡結(jié)構(gòu)域組成信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合體，并進(jìn)一步活化Caspase-8,引發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。普遍認(rèn)為細(xì)胞死亡的方式有兩種，但無(wú)論是通過(guò)內(nèi)源性還是外源性途徑，都依賴于Caspase家族[20]。Caspase-8是一種半胱氨酸—天冬氨酸特異性蛋白酶，可觸發(fā)外部凋亡通路，參與細(xì)胞表面死亡受體的激活，被激活的Caspase-8可以直接切割并激活Caspase效應(yīng)體(如Caspase-3)，參與內(nèi)源性凋亡通路，使得線粒體外膜透化和線粒體促凋亡成分釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終引發(fā)凋亡。除了凋亡作用以外，Caspase-8還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和黏附，并在胚胎發(fā)育和癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，治療1天后，各組HE觀察腫瘤細(xì)胞具有不同程度的壞死，其中以組3(小劑量多次治療組)壞死程度最佳。TNF-α表達(dá)方面，在相同光照劑量，不同治療次數(shù)的情況下，多次治療TNF-α表達(dá)最高，而在相同治療次數(shù)，不同光照劑量的情況下，TNF-α以小劑量光照表達(dá)最高。Caspase-8在免疫組化的表達(dá)方面基本與TNF-α相同，而在WB表達(dá)方面部分與前者相同，在相同光照劑量的前提下，多頻次治療時(shí)Caspase-8的表達(dá)較高，這與Kiro NE[23]及Anine等[24]的研究結(jié)果大致相同。

綜上所述，在用中藥單體姜黃素聯(lián)合光動(dòng)力治療宮頸癌時(shí)，治療參數(shù)以小劑量多頻次效果最佳，能夠有效的殺滅腫瘤細(xì)胞，其機(jī)制與TNF-α/Caspase-8通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)仍有一些局限性，目前只對(duì)完成治療后1天的結(jié)果進(jìn)行觀察，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)延長(zhǎng)觀察時(shí)間，分多時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便對(duì)治療后腫瘤變化進(jìn)一步觀察，同時(shí)應(yīng)對(duì)TNF-α相關(guān)受體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步明確光動(dòng)力的治療機(jī)理。