三種固相萃取柱在農(nóng)產(chǎn)品高氯酸鹽檢測中應(yīng)用比較

李冬桂，呂麗蘭，陸覃昱，吳 鳳，李慧敏，黃嬋嬋，陳羽燁，甘志勇

〔1廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（南寧），廣西南寧 530001；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，廣西南寧 530001〕

高氯酸鹽是一種有毒的無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，其物理化學(xué)性質(zhì)及其穩(wěn)定，在環(huán)境中不易分解[1]。高氯酸鹽水溶性高，在地下水和地表水中流動性強(qiáng)，可經(jīng)水、土壤等途徑被植物富集吸收，并通過食物鏈作用進(jìn)入人體[2-3]。高氯酸鹽在體內(nèi)富集對人體健康造成神經(jīng)毒性、生殖毒性和遺傳毒性等方面危害[4]。隨著經(jīng)濟(jì)和科技高速發(fā)展，高氯酸鹽被廣泛應(yīng)用于航空業(yè)、軍火工業(yè)、橡膠制品等領(lǐng)域[5]。高氯酸鹽污染食品的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，蔬菜、牛奶及其制品、飲用水、茶葉、肉類等食品中都檢出不同含量水平的高氯酸鹽[6-7]。

目前，高氯酸鹽分析方法主要有離子色譜法、離子色譜—質(zhì)譜法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-9]。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法具有抗基質(zhì)干擾優(yōu)異，檢測靈敏度高，檢出限低，儀器使用更為普及、方法優(yōu)化前景更廣闊等優(yōu)點[10]。高氯酸鹽的檢測，較多采用該方法[11]。固相萃取凈化柱可以降低質(zhì)譜基質(zhì)干擾，提高待測物檢測的靈敏度。由于不同類型凈化柱針對不同基質(zhì)樣品，凈化效果和檢測成本存在差異，根據(jù)喀斯瑪商城（https://www.casmart.com.cn）查詢，商品價格PRiME HLB 固相萃取柱＞石墨碳黑柱[12]＞C18固相萃取柱。我國對不同基質(zhì)中高氯酸鹽的檢測標(biāo)準(zhǔn)仍不完善。SN/T 4089-2015《出口食品中高氯酸鹽的測定液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法》推薦使用凈化柱為C18柱[13]，BJS201706《食品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定》推薦使用PRiME HLB 柱[14]，目前尚未有關(guān)于C18柱和HLB 柱針對蔬菜、水果和茶葉樣品中高氯酸鹽檢測凈化效果差異的相關(guān)文獻(xiàn)報道，且現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)沒有蔬菜基質(zhì)樣品檢測凈化柱的推薦。擬研究采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法考察HLB柱，C18柱和石墨碳黑柱三種凈化柱在蔬菜、水果和茶葉檢測中凈化效果，篩選出適合蔬菜、水果和茶葉中高氯酸鹽檢測的固相萃取凈化柱，為完善農(nóng)產(chǎn)品中高氯酸鹽檢測標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：蔬菜水果樣品來自超市和農(nóng)貿(mào)市場的隨機(jī)取樣，蔬菜包括葉菜類、蕓薹屬類、根莖類、鱗莖類、茄果瓜類、食用菌類、豆類，水果樣品包括熱帶亞熱帶水果、仁果核果類，漿果類、柑橘類、瓜類等，茶葉樣品購買于超市及茶葉銷售商店，包括黑茶、紅茶、綠茶、花茶。

儀器：LC-20ADXR 超高壓液相色譜儀（日本島津公司）；API3200 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；KQ3200DE 超聲震蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋渦混勻器（德國IKA 公司）；3K30 臺式冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）。

試劑耗材：乙腈、乙酸銨（色譜純，美國Fisher 公司）；高氯酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（ClO-4，1000mg/L，美國Inorganic Ventures 公司）；高氯酸根內(nèi)標(biāo)溶液（Cl18O-4，100mg/L，美國 Cambridge Isotop Laborltories 公司）；C18固相萃取柱（500mg/6mL，Agilent 公 司）；PRiME HLB固相萃取柱（500mg/6cc，美國Waters 公司），石墨碳黑柱（500mg/6mL，Agilent 公司）。

1.2 溶液配制

準(zhǔn)確移取高氯酸根及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以水逐級稀釋分別配制為1mg/L 高氯酸根及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20℃冰箱避光保存。用流動相乙腈-20mmol/L 乙酸銨溶液稀釋中間液，配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液為1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L，高氯酸根同位素內(nèi)標(biāo)液濃度為20 μg/L。配制高氯酸根及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合液20 μg/L 作為對照溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

蔬菜、水果樣品用組織搗碎機(jī)制成勻漿，茶葉樣品用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩。準(zhǔn)確稱取勻漿好的蔬菜、水果樣品5 g，粉碎的茶葉樣品1 g（精確至0.001 g），置于50 mL 離心管中，加入1 mg/L 高氯酸根同位素內(nèi)標(biāo)中間液0.4 mL，加入超純水7 mL，混勻。蔬菜、水果樣品常溫振蕩超聲5 min，茶葉樣品60℃水浴振蕩超聲5 min，再加入13 mL 乙腈，混勻，進(jìn)一步提取。蔬菜、水果樣品常溫振蕩超聲提取30 min，茶葉樣品60℃水浴振蕩超聲提取30 min，提取后樣品經(jīng)10000 r/min 常溫離心10 min，取上清液待凈化。

1.3.2 凈化

分別取5 mL 乙腈/ 水（V/V，13∶7）混合液過C18柱和石墨碳黑柱，重力洗脫活化，棄去洗脫液。當(dāng)洗脫溶劑全部流出時，吸取離心后的樣品上清液至凈化柱內(nèi)，采用重力過柱。HLB 柱不需活化，直接吸取樣品上清液至凈化柱內(nèi)重力過柱，棄去前1 mL 流出液。收集各凈化柱的續(xù)濾液，過0.22 μm 濾膜供UPLC-MS/MS 測定。

1.3.3 色譜條件

液相色譜條件：色譜柱Acclaim TRINITYP1復(fù)合離子交換柱（100 mm×2.1 mm，3 um），流動相乙腈（A）和20 mmol/L 乙酸銨，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫條件：0～0.2 min，70%A，0.2～3 min，70%～90%A，3～7 min，90%A，7～8 min，90%～70%A，8 min～11 min，70%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；電噴霧電壓（IS）5500 V；離子源溫度550℃；碰撞氣Medium；氣簾氣壓力（CUR）30.0 Psi；霧化氣壓力（Gas 1）55.0 Psi；輔助氣（Gas 2）55.0 Psi。由于氯原子有兩個同位素原子，因此高氯酸根有兩個母離子，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 高氯酸鹽的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.4 三種固相萃取柱凈化效果比較

在樣品凈化環(huán)節(jié)，從加標(biāo)回收、色素干擾及色譜峰表現(xiàn)等方面對PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種不同凈化柱的凈化效果進(jìn)行考察擇優(yōu)。并用選出的凈化柱對不同樣品進(jìn)行不同添加水平的回收試驗及對實際樣品進(jìn)行檢測，檢驗適用性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 三種固相萃取柱對加標(biāo)樣品絕對回收率比較

選擇空白基質(zhì)樣品，蔬菜以生菜、白菜、蘿卜、荷蘭豆為樣品，水果以柑橘、香蕉、梨、葡萄為樣品，茶葉以紅茶、茉莉花茶、綠茶、六堡茶為樣品。歐盟2020 年設(shè)定蔬菜、水果中高氯酸鹽限量值為0.05 mg/kg，茶葉為0.75 mg/kg。以歐盟對高氯酸鹽限量值為參考，選一個適合濃度添加水平，考察三種固相萃取柱絕對回收率。水果、蔬菜樣品中高氯酸根及其18O 標(biāo)記高氯酸根添加水平均為80 μg/kg，茶葉樣品中高氯酸根及其18O 標(biāo)記高氯酸根添加水平均為400 μg/kg，按照1.2.2 方法進(jìn)行提取，并分別經(jīng)PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種凈化柱凈化，考察三種凈化柱對高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)的絕對回收率影響，結(jié)果見表2。經(jīng)過HLB 柱和C18柱凈化的樣品，高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)絕對回收率相差不大，石墨碳黑柱處理的樣品，絕對回收率最低。

表2 不同基質(zhì)加標(biāo)樣品過固相萃取柱后高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)絕對回收率

HLB 柱采用水浸潤性聚合物吸附劑，不需活化和平衡，可直接使用，可以去除鹽類、蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等常見基質(zhì)。C18柱是在硅膠表面鍵合十八烷基，可以去除色素、鹽、大分子等干擾物。石墨碳黑柱填充材料為石墨化碳顆粒，既可以吸附非極性和弱極性的化合物又可以吸附極性化合物，對化合物表現(xiàn)出很廣的吸附性。石墨碳黑柱處理的樣品，高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)絕對回收率最低，可能是因為石墨碳黑柱吸附能力較強(qiáng)，對高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)物有吸附。因此選擇HLB 柱和C18柱凈化樣品較適合。

2.2 三種固相萃取柱對加標(biāo)樣品色素干擾

比較PRiME HLB、C18和石墨碳黑三種凈化柱除色素情況。石墨碳黑柱雖然能較好的吸附樣品中色素，但過凈化柱后，高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)絕對回收率最低。HLB 柱、C18柱對蔬菜、茶葉樣品色素的去除能力相當(dāng)，對部分水果樣品，HLB 柱去除色素能力優(yōu)于C18柱，如葡萄樣品，凈化后效果見圖1，HLB 柱凈化后樣品比C18柱凈化后澄清。因此，水果樣品適用于HLB 柱，蔬菜、茶葉樣品適用于HLB 柱和C18柱。

圖1 經(jīng)HLB 柱、C18 柱和石墨碳黑柱凈化后樣液效果比較

2.3 三種固相萃取柱對加標(biāo)樣品凈化后的色譜圖

選擇空白基質(zhì)樣品，考察了PRiME HLB，C18和石墨碳黑三種凈化柱對80 μg/kg 蔬菜、水果加標(biāo)樣品，400 μg/kg 茶葉加標(biāo)樣品提取液的凈化效果，高氯酸鹽的峰面積信號響應(yīng)值見表3。三種固相萃取柱凈化后的加標(biāo)樣品色譜圖見圖2、圖3、圖4 所示，凈化后色譜圖峰形尖銳對稱。蔬菜、水果樣品均為過HLB 柱凈化后高氯酸鹽峰面積響應(yīng)最大，石墨碳黑柱最小。且HLB 柱與C18柱相比不用活化，節(jié)省試劑和時間。因此，蔬菜、水果樣品選擇HLB柱做為凈化柱。

圖2 三種固相萃取柱凈化茶葉加標(biāo)樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)色譜圖

圖3 三種固相萃取柱凈化水果加標(biāo)樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)色譜圖

圖4 三種固相萃取柱凈化蔬菜加標(biāo)樣品后高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)色譜圖

表3 不同加標(biāo)樣品經(jīng)過不同凈化柱后高氯酸鹽響應(yīng)值

茶葉樣品過HLB 柱和C18柱凈化后峰面積響應(yīng)值差不多，石墨碳黑柱最小。由于茶葉樣品經(jīng)HLB柱和C18柱凈化后均能獲得較好的絕對回收率，均適用茶葉樣品，但HLB 柱價格比C18柱貴[12]，因此茶葉樣品選擇C18柱凈化。

2.4 樣品加標(biāo)過固相萃取柱的回收率影響

選擇空白基質(zhì)樣品、生菜、黃瓜、金針菇、香梨和茶葉6 個樣品，添加高、中、低3 個濃度的高氯酸鹽，按照1.3.1 前處理方法處理樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。其中蔬菜、水果用HLB 柱凈化、茶葉用C18柱凈化，每個濃度平行測定6 次，結(jié)果如表4所示。添加回收率平均值為89.25%～117.4%，RSD為0.59%～2.94%。說明HLB 柱滿足蔬菜、水果中高氯酸鹽的檢測要求，C18柱滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求。

表4 6 種樣品加標(biāo)過固相萃取柱回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.5 實際樣品檢測

取市售蔬菜、水果和茶葉樣品各10 份，按照1.3.1 前處理方法處理樣品。蔬菜、水果用HLB 柱凈化、茶葉用C18柱凈化，市售樣品檢測結(jié)果見表5所示。蔬菜中高氯酸鹽平均值為23.3 μg/kg，檢出率為90%，水果中高氯酸鹽平均值為1.35 μg/kg，檢出率為40%，茶葉中高氯酸鹽平均值為398.93μg/kg，檢出率為90%，說明蔬菜、水果和茶葉均受高氯酸鹽污染。

表5 市售樣品的高氯酸鹽檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，對農(nóng)產(chǎn)品中內(nèi)標(biāo)法檢測高氯酸鹽適用固相萃取柱進(jìn)行考察。通過比較HLB 柱、C18柱和石墨碳黑柱對蔬菜、水果和茶葉中高氯酸鹽及其18O 標(biāo)記高氯酸根同位素內(nèi)標(biāo)物檢測的影響，確定了HLB 柱為蔬菜、水果中高氯酸鹽檢測凈化柱，C18柱為茶葉中高氯酸鹽檢測凈化柱。方法具有回收率高、操作簡單、價格實惠等優(yōu)點，為完善農(nóng)產(chǎn)品中高氯酸鹽檢測標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。