超高效液相色譜法測定噁草酸原藥及乳油中有效成分含量

劉 琳，周 芹,2,3,*，王皙瑋,2,3

(1.黑龍江大學 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，哈爾濱 150080)

0 引 言

噁草酸又名喔草酯(propaquizafop)，化學名稱為：2-異亞丙基氨基氧乙基(R)-2-(4-(6-氯喹喔啉-2-基氧)苯氧基)丙酸酯，化學分子式為C22H22CLN3O5，其結(jié)構(gòu)式見圖1，屬于芳氧苯氧丙酸酯類除草劑[1]，主要用于防除一年生和多年生禾本科雜草[2]。為乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑，通過阻礙ACCase來抑制脂肪酸的合成，干擾細胞膜的形成,從而使雜草生長停止，最終死亡，發(fā)揮除草的功能。具有內(nèi)吸性，對大豆、棉花、油菜、馬鈴薯和蔬菜等安全，在雜草幼苗期和生長期施藥效果最好，且作用迅速[3]。

圖1 噁草酸的結(jié)構(gòu)式

自從上世紀80年代第一例芳氧苯氧丙酸酯類除草劑禾草靈被開發(fā)，就以其高效、低毒、高選擇性的優(yōu)良特點，受到廣泛關(guān)注[4]。隨后，不斷合成出新品種，諸如苯并噻唑基、苯并咪唑基、喹啉基和吡啶并唑基等一系列新型芳氧苯氧丙酸酯類化合物，而到了90年代隨著對現(xiàn)有除草劑作用機制研究的深入，出現(xiàn)了基于乙酰輔酶A羧化酶的分子設(shè)計研究[5]，目前商品化的品種已達20多種，主要包括精喹禾靈、高效氟吡甲禾靈、噁草酸等，與其他的芳氧苯氧丙酸酯類除草劑相比，噁草酸主要用在大豆、棉花、油菜、甜菜、馬鈴薯、花生和蔬菜等作物上，2018年原藥及10%乳油在我國首次獲得登記。

目前，對于噁草酸的研究，主要集中在藥效[6-8]及殘留的檢測。郭松年等[9]利用 QuEChERs-液質(zhì)聯(lián)用法測定菜籽油中7種芳氧苯氧丙酸酯類除草劑殘留，其中就包括噁草酸，采用乙腈提取、分散固相萃取對樣品進行前處理，質(zhì)譜采用MRM監(jiān)測模式，回收為78.3%～95.1%，具有基質(zhì)效應(yīng)低、處理簡單、準確快速、重復性好的優(yōu)點；Shin Y等[10]同樣采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法建立了噁草酸及352種農(nóng)藥在食用昆蟲中的聯(lián)合測定，方法具有較好的的準確度及精密度；吳春英等[3]同樣采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定了水中的16種芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，通過優(yōu)化前處理條件及儀器條件，建立的方法具有檢出限低、回收率高的優(yōu)點。Saito-Shida S等[11]利用液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)，建立了糧谷及豆類中噁草酸等153種農(nóng)藥殘留的測定方法，結(jié)果表明，LC-QTOF-MS方法適用于谷物和豆類中農(nóng)藥殘留的常規(guī)分析。噁草酸結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，在紫外區(qū)具有光譜吸收，采用液相色譜分離，基質(zhì)包括土壤、植物、水以及食用昆蟲等。目前的研究都是針對農(nóng)藥殘留的檢測，制劑有效成分檢測的報道較少。近年來，在我國隨著農(nóng)藥使用數(shù)量的增多，農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，根據(jù)《農(nóng)藥管理條例》規(guī)定，農(nóng)藥所含有效成分種類與農(nóng)藥的標簽、說明書標注的有效成分不符，均視為假農(nóng)藥[12-13]，所以對制劑有效成分含量的檢測具有重要意義，本研究擬建立一種方法可以同時適用于噁草酸原藥(Technical material,簡寫為TC)及乳油(Emulsifiable concentrate簡寫為EC)中有效成分的檢測，采用超高效液相色譜法，通過波長掃描確定適宜的檢測波長，特異性檢驗確定色譜峰純度，優(yōu)化了流動性比例，建立的方法具有靈敏度高，操作簡便的特點，并為國家標準的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

甲醇：色譜純。水：新蒸二次蒸餾水或超純水。噁草酸標樣：已知質(zhì)量分數(shù)為98.5%。Waters超高效液相色譜儀(UPLC)，二極管陣列檢測器(PDA),色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。過濾器：濾膜孔徑約0.45 μm。超聲波清洗器。

1.2 實驗方法

色譜操作條件：流動相：Ψ(甲醇∶水)=80∶20，經(jīng)濾膜過濾，并進行脫氣。流速：0.2 mL·min-1。柱溫：35 ℃±2 ℃。檢測波長：235 nm。進樣體積：0.5 μL。標樣溶液和試樣溶液的制備：稱取0.05 g(精確至0.000 1 g)噁草酸標樣于100 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。測定及計算方法：在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰兩針噁草酸峰面積相對變化<1.2%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標樣溶液中噁草酸峰面積分別進行平均。計算試樣中噁草酸的含量。

2 結(jié)果及分析

2.1 檢測波長的選擇

噁草酸分子中存在共軛雙鍵，價電子會發(fā)生能級躍遷，進而產(chǎn)生紫外吸收光譜。為了找到噁草酸吸光值最大處吸收波長，利用UPLC-PDA在200～400 nm進行波長掃描，紫外光譜圖見圖2。由圖2可見，噁草酸的最大吸收波長為235.2 nm，在農(nóng)藥分析中，一般情況下，如果最大吸收波長處無干擾，分析檢測時選用最大吸收波長[14]，本實驗中235 nm波長處靈敏度較高，干擾小，能夠滿足分析的要求，故將檢測波長確定為235 nm。

圖2 噁草酸的紫外光譜圖

2.2 色譜柱及流動相的選擇

根據(jù)噁草酸的性質(zhì)，選用反相色譜進行分析，常用的色譜柱包括C18、C8等，C18一般用來分析分子量較小的物質(zhì)，C8適合分析大分子類的物質(zhì)。由于C18比C8的碳鏈更長，帶來更好的保留特性。本實驗中選擇常用的C18反相柱，根據(jù)噁草酸物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以甲醇和水作為流動相，將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，隨著甲醇比例的增加，保留時間減小，最終選擇Ψ(甲醇∶水)=80∶20作為流動相，流速0.2 mL·min-1。該條件下，噁草酸色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離(圖3)，具有良好的精密度和準確度，并且分析時間較短，提高了工作效率。

圖3 噁草酸原藥及10%噁草酸乳油的UPLC色譜圖

2.3 特異性實驗

特異性就是對峰純度進行檢驗，利用二極管陣列檢測器全波長同時采集數(shù)據(jù)的特點，也賦予了其光譜比對的功能。峰純度色譜圖見圖4。由圖4可見不同的化合物具有不同的紫外吸收光譜形狀和吸光特性，從而實現(xiàn)對色譜峰純度的檢測。采用UPLC-PDA峰純度分析法來鑒別噁草酸。一般用純度角度與純度閾值比較，如果前者大于后者，說明峰純度不夠，有共流出現(xiàn)象，反之，則認為峰純度符合要求。本實驗中噁草酸標樣、92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中的噁草酸峰純度角度均小于純度閾值，有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

圖4 HPLC-PDA峰純度色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系

按標樣溶液的制備方法配制5個不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標記為STD1至STD5。待儀器穩(wěn)定后，按照STD1至STD5的順序測定每個溶液中噁草酸的峰面積，取兩次測定的平均結(jié)果。以噁草酸質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線見圖5。由圖5可見當噁草酸質(zhì)量濃度為100.5～1 003.9 mg·L-1(進樣體積1 μL)，與相應(yīng)的噁草酸峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計算得回歸方程為y=39 050x+97 636，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，完全可以滿足定量分析要求。本方法中噁草酸標樣質(zhì)量濃度為 502.4 mg·L-1。

圖5 噁草酸標準曲線

2.4.2 方法精密度試驗

按試樣溶液的制備方法配制5個92%噁草酸原藥精密度溶液，分別標記為TC-A1～TC-A5；5個10%噁草酸乳油精密度溶液，分別標記為EC-A1～EC-A5。以有效成分線性相關(guān)溶液STD3為標樣溶液，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標樣溶液的順序進行測定，結(jié)果見表1～表2。農(nóng)藥測定和分析方法中，數(shù)據(jù)結(jié)果的確認應(yīng)以修改的Horwitz公式(2(1-0.51ogC)×0.67)為依據(jù)[15]，RSD值小于這個修正值通常被認為是合格的。由表1～表2可見，92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中噁草酸質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果的RSD分別為0.39%、0.21%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.36(其中C=0.905 0)，表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

表1 噁草酸原藥精密度試驗結(jié)果

表2 噁草酸乳油精密度試驗結(jié)果

2.4.3 方法準確度試驗

分別稱取約含0.025 g(精確至0.000 1 g)噁草酸的92%原藥、10%噁草酸乳油于100 mL容量瓶中，再加入噁草酸標樣約0.025 g(精確至0.000 1 g)，按2.5.2試樣溶液的制備方法配制5個有效成分準確度溶液，分別標記為：TC-B1～TC-B5、EC-B1～EC-B5。以線性相關(guān)溶液STD3為標樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標樣溶液、準確度溶液、準確度溶液、標樣溶液的順序進行測定，結(jié)果見表3～表4。92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油中噁草酸平均回收率分別為100.78%、100.44%，具有良好的準確度。

表3 噁草酸原藥回收率實驗結(jié)果

表4 噁草酸乳油回收率試驗結(jié)果

2.4.4 不同實驗室間方法驗證

為了驗證建立的方法在不同實驗室的適用性，分別在3個不同實驗室進行了方法驗證實驗，實驗結(jié)果見表5。由表5可見，92%噁草酸原藥、10%噁草酸乳油樣品和標樣重復性相對標準偏差分別為0.209 6%、1.559 5%，再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR分別0.454 0%、2.034 4%，均小于相應(yīng)的Horwitz公式理論計算值，表明不同單位間的檢測結(jié)果符合性良好，本文建立的噁草酸液相色譜分析方法可滿足日常檢測工作需要。

表5 不同實驗室方法驗證試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

利用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，甲醇溶解，檢測波長235 nm，甲醇-水作為流動相，等度洗脫，建立了在同一條件下噁草酸原藥及乳油的測定方法。在選擇提取溶劑時，既考慮溶劑本身的性質(zhì)，又要結(jié)合農(nóng)藥的物理化學性質(zhì)及樣品的狀況，噁草酸的溶解性，本實驗選擇甲醇作為提取溶劑溶解樣品。

采用液相色譜配置的二極管陣列監(jiān)測器進行紫外區(qū)全波長掃描，得出噁草酸的最大吸收波長，所選的波長要避開其他物質(zhì)的干擾。本實驗選用235 nm作為測量波長，干擾小，靈敏度較高，進行了色譜峰特異性檢驗(純度檢驗)，大多數(shù)情況下，純度檢驗可輔助進行方法開發(fā)。本研究建立的噁草酸的測定方法，兩種制劑中噁草酸的回收率、精密度、RSD值均滿足要求，具有操作簡單、節(jié)省時間、靈敏度高、準確性及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適用于噁草酸原藥及乳油中有效成分的分析測定。