大豆卵磷脂中二亞油酰磷脂酰膽堿的分離純化

劉思敏，從艷霞，黃俊圻，陳 歡，龔 任,李 冰, 張海龍,齊玉堂，張維農

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢430023； 2.國糧武漢科學研究設計院有限公司，武漢430079)

二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)是大豆卵磷脂(PC)的主要活性成分[1]，具有抗氧化[2]、預防纖維化[3]、抗炎、調節(jié)細胞凋亡、修復和保護細胞膜[4]等獨特的藥用價值及特殊生理功能。但天然存在的DLPC含量并不高，以大豆磷脂為例，其中的DLPC含量僅為10%左右。

國內外對磷脂的研究多集中在磷脂大類及磷脂酰膽堿(PC)分子種類的高效液相色譜檢測方法和營養(yǎng)功能上[5-10]，對特異性磷脂分子(如DLPC、二油酰磷脂酰膽堿這類具有特定脂肪酰種類和位置的磷脂分子)的分離純化以及合成的相關報道較少。史蘇佳等[11]提出用正相硅膠柱純化二亞麻酰磷脂酰膽堿，但未提及對DLPC的純化程度，且以正己烷-甲醇-水作為洗脫劑，不利于回收，同時也不利于產品安全和環(huán)境友好[12]。酶法合成DLPC具有反應條件溫和、溶劑使用量少的特點，但目前該法對DLPC含量提高有限。因此，尋找一種高效、綠色環(huán)保的方法制備高純度DLPC具有很好的經(jīng)濟效益與社會價值。本文以大豆粉末磷脂為原料，經(jīng)95%乙醇溶液處理后，得到高純度的磷脂酰膽堿，再將磷脂酰膽堿溶于乙醇，用反相C18柱進行分離。考慮到甲醇在有機溶劑中價格低廉，而乙醇在食品加工中無毒無害，本研究考察了甲醇和乙醇作為洗脫劑對DLPC的分離純化效果，以期為制備高純度的DLPC提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆粉末磷脂(PC含量30%，DLPC含量8.5%)，安徽素之味生物科技有限公司；無水乙醇、乙醚、丙酮、甘油、乙酸銨，均為分析純；甲醇、正己烷、無水乙醇，均為色譜純；L-α-磷脂酰膽堿標準品(純度≥98%)，百靈威科技有限公司；1,2-二亞油?；?3-sn-磷脂酰膽堿(DLPC，純度≥99%)，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設備

CHEETAHTMMP 100/200中壓快速純化制備系統(tǒng)、中壓制備型Claricep Flash C18色譜柱(20～35 μm，100 ?，40 g)、Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，博納艾杰爾公司； Waters2996高效液相色譜儀(PDA 檢測器)、Waters1525 二元 HPLC 泵，Waters公司；ME204/02 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；YRE2000E旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DLPC的分離純化

以大豆粉末磷脂為原料，DLPC的分離純化工藝流程如圖1所示。

1.2.1.1 原料預處理

取20 g大豆粉末磷脂于燒杯中，加入40 mL 95%的乙醇溶液，在50℃水浴中加熱攪拌均勻，靜置，收集上清液，于50℃旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到磷脂酰膽堿粗提物。取5 g磷脂酰膽堿粗提物于具塞圓底燒瓶中，加入20 mL 95%的乙醇溶液，于60℃加熱攪拌溶解，降溫至-7℃，保溫24 h，直接收集上清液，于50℃旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到高純度的磷脂酰膽堿(磷脂酰膽堿含量為90%，其中DLPC含量為28%)。

1.2.1.2 反相C18色譜柱分離純化DLPC

采用中壓制備型Claricep Flash C18色譜柱對磷脂酰膽堿中的DLPC進行分離純化。將1.2.1.1制備的磷脂酰膽堿溶解于乙醇中(料溶比0.5∶1)，以此作為上樣原料進行上樣，然后用洗脫劑進行洗脫，每10 mL收集一玻璃試管，采用HPLC分析DLPC的純度，合并DPLC純度大于50%的洗脫液，真空脫溶得產品DLPC。

1.2.2 DLPC的HPLC測定[8]

1.2.2.1 標準曲線的制作

分別配制質量濃度梯度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL的DLPC標準溶液, 經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后，進行HPLC分析。以峰面積(Y)為縱坐標，DLPC的質量濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程(Y=13 074 294.896 8X+151 506.853 7，r2=0.997)。

HPLC分析條件：Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-正己烷-0.05 mol/L乙酸銨-甘油(體積比84∶6∶8∶0.6)；檢測波長203 nm；流速1 mL/min；柱溫35℃；進樣量20 μL。

1.2.2.2 樣品處理及測定

對于洗脫液，直接取1 mL經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后進行HPLC分析。對于DLPC產品，取50 mg DLPC產品，用3 mL乙醇溶解并定容于25 mL 容量瓶中，再取1 mL經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后進行HPLC分析。采用面積歸一化法計算DLPC的純度。將樣品中DLPC的峰面積代入1.2.2.1標準曲線回歸方程，得到DLPC含量。分別按式(1)和式(2)計算洗脫液和DLPC產品中DLPC的得率。

Y1=c1V1/m×100%

(1)

式中：Y1為洗脫液中DLPC得率；c1為洗脫液中DLPC含量，mg/mL；V1為洗脫液體積，mL；m為上樣量，mg。

Y2=c2V2/m

(2)

式中：Y2為產品中DLPC得率；c2為產品乙醇溶解液中DLPC含量，mg/mL；V2為定容體積，mL；m為上樣量，mg。

2 結果與討論

2.1 甲醇洗脫體系對DLPC分離純化的影響

2.1.1 洗脫流速的影響

在柱分離過程中洗脫流速是影響分離效果和成本的重要因素，洗脫流速過快時，樣品來不及平衡，影響分離效果；洗脫流速過慢時，會導致柱內擴散現(xiàn)象嚴重，同樣會影響分離效果[13]。此外，洗脫流速過快或者過慢還可能造成溶劑消耗量過大，增加生產成本。因此，有必要確立適宜的洗脫流速。本實驗以甲醇作為洗脫劑，固定上樣量為0.5 g(以40 g C18柱填充材料為基準，下同)，在洗脫流速分別為12、20、28 mL/min時，對合并洗脫液的DLPC純度和得率進行分析，結果分別如圖1和表1所示。

圖1 甲醇洗脫體系下不同洗脫流速時的色譜圖

表1 甲醇洗脫體系下洗脫流速對DLPC分離效果的影響

由圖1可見，隨著洗脫流速的加快，DLPC在更短的時間內被洗脫出來，但不同結構的磷脂酰膽堿分離效果變差。由表1可知，隨著洗脫流速的增加，DLPC純度降低，得率升高。洗脫流速為20、28 mL/min時，DLPC純度分別為85.1%和83.7%，二者純度相差不大，同時二者溶劑消耗量接近；但洗脫流速為28 mL/min時DLPC得率更高，且洗脫時間更短。相比之下，以28 mL/min的洗脫流速進行洗脫在生產上更具有實際價值。

2.1.2 甲醇體積分數(shù)的影響

在反相柱分離系統(tǒng)中，洗脫劑中添加適量水分能提高分離效果，但水分含量過高會使反相柱的保留性能大大減弱[14]。本實驗中固定洗脫流速為28 mL/min，上樣量為0.5 g，以不同體積分數(shù)的甲醇為洗脫劑，對合并洗脫液的DLPC純度和得率進行分析，結果如圖2和表2所示。

圖2 甲醇洗脫體系下不同甲醇體積分數(shù)時的色譜圖

表2 甲醇洗脫體系下甲醇體積分數(shù)對DLPC分離效果的影響

由表2和圖2可見，隨著甲醇體積分數(shù)的降低，DLPC純度提高，在甲醇體積分數(shù)為90%時，DLPC純度高達95.5%，與 95%的甲醇相比，以90%甲醇作為洗脫劑進行洗脫時，其純度提高不到2百分點，但洗脫時間延長了3倍，溶劑消耗量增加了3倍。綜合考慮，95%甲醇更適合作為DLPC的洗脫劑。

2.1.3 上樣量的影響

在制備液相色譜中，樣品的上樣量是影響分離效果的重要因素之一。固定相負載樣品的能力是一定的，上樣量過多或者過少都不利于分離。上樣量過小，分離效率變低；上樣量過大，會導致相鄰峰的分離度降低，甚至重疊在一起無法分離，分離效果變差[15]。本實驗以95%甲醇為洗脫劑，固定洗脫流速為28 mL/min，以不同的上樣量進行上樣，對合并洗脫液的DLPC純度和得率進行分析，結果如圖3和表3所示。

圖3 甲醇洗脫體系下不同上樣量時的色譜圖

由圖3可見，不同上樣量下DLPC的洗脫時間無明顯差異。由表3可見，整體來看隨著上樣量的增加，DLPC純度呈下降趨勢，而得率呈升高趨勢?？紤]到將該方法投入到生產中應盡可能提高樣品處理量，選擇0.5 g上樣量，既達到DLPC較高純度的要求，又達到更高產量的要求。

表3 甲醇洗脫體系下上樣量對DLPC分離效果的影響

2.2 乙醇洗脫體系對DLPC分離純化的影響

2.2.1 洗脫流速的影響

按2.1.1分離條件，將洗脫劑甲醇換為乙醇，考察不同洗脫流速對DLPC分離效果的影響，結果如圖4和表4 所示。

圖4 乙醇洗脫體系下不同洗脫流速時的色譜圖

表4 乙醇洗脫體系下洗脫流速對DLPC分離效果的影響

由圖4可見，乙醇作為洗脫劑時，不同結構的磷脂酰膽堿重疊在一個峰上，無法分離。與甲醇相比，乙醇極性更弱，洗脫能力更強，磷脂酰膽堿更快流出，導致分離效果變差。由表4可見，在3種洗脫流速下，DLPC純度介于50% ～ 60%之間，得率介于21%～ 24%之間。綜合考慮效率和成本，選擇洗脫流速為28 mL/min。

2.2.2 乙醇體積分數(shù)的影響

相較甲醇洗脫體系，乙醇對磷脂酰膽堿洗脫能力更強，為了提高分離效果，需考慮更高水分含量對DLPC分離效果的影響。按2.1.2分離條件，將洗脫劑不同體積分數(shù)的甲醇換成不同體積分數(shù)的乙醇，考察乙醇體積分數(shù)對DLPC分離效果的影響，結果如圖5和表5所示。

圖5 乙醇洗脫體系下不同乙醇體積分數(shù)時的色譜圖

表5 乙醇洗脫體系下乙醇體積分數(shù)對DLPC分離效果的影響

由圖5和表5可見，隨著乙醇體積分數(shù)的降低，DLPC分離效果得到明顯改善。乙醇體積分數(shù)為90%時，DLPC純度僅為77.7%，遠未達到高純度磷脂酰膽堿的要求；而乙醇體積分數(shù)為80%時，DLPC純度可達96.1%。因此，選擇80%乙醇作為洗脫劑。

2.2.3 上樣量的影響

以80%乙醇為洗脫劑，固定洗脫流速為28 mL/min，考察上樣量對DLPC分離效果的影響，結果如圖6和表6所示。

圖6 乙醇洗脫體系下不同上樣量時的色譜圖

表6 乙醇洗脫體系下上樣量對DLPC分離效果的影響

由圖6可見，不同上樣量下DLPC的洗脫時間無明顯差異。由表6可見，隨著上樣量的增加，DLPC的純度略有下降，但都高于90%，上樣量0.75 g 與0.50 g相比，得率上升不到2百分點。綜合考慮分離效果和成本，選擇上樣量為0.75 g。

2.3 最優(yōu)條件下產品純度和得率

對優(yōu)化的甲醇洗脫體系(95%甲醇，洗脫流速28 mL/min，上樣量0.5 g)和乙醇洗脫體系(80%乙醇，洗脫流速28 mL/min，上樣量0.75 g)下產品DLPC的純度和得率進行檢測，結果表明，甲醇洗脫體系得到的產品DLPC純度為91.2%，得率為21.5%，乙醇洗脫體系得到的產品DLPC純度為92.6%，得率為20.1%。與優(yōu)化的甲醇洗脫體系相比，乙醇洗脫體系得到的DLPC純度更高，但得率有所下降，溶劑消耗量也更大。實際工業(yè)生產，需結合標準和法規(guī)選擇合適的洗脫體系。

3 結 論

以大豆粉末磷脂為原料提取磷脂酰膽堿，再采用反相制備色譜系統(tǒng)從磷脂酰膽堿中分離純化DLPC，以不同體積分數(shù)的甲醇或者乙醇作為洗脫劑均可實現(xiàn)DLPC的分離純化，其純度均能達到90%以上。本實驗采用的中壓柱色譜分離技術易于工業(yè)化，分離效果好，本研究結果將利于推進DLPC的制備及應用。