細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化在胸腹水診斷中的應(yīng)用研究

錢潔，趙小莉，徐妍，徐蓉

1.張家港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇張家港 215600；2.張家港市第一人民檢驗(yàn)科，江蘇張家港 215600

據(jù)近幾年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)惡性腫瘤疾病的患病率、病死率均呈升高趨勢(shì)。由于多數(shù)惡性腫瘤疾病早期癥狀表現(xiàn)較為隱匿，因此發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)展至中晚期，從而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[1]。另外惡性腫瘤患者一般身體各項(xiàng)機(jī)能減退，對(duì)病理活檢的耐受性較差，因此，找尋一種準(zhǔn)確、安全、便捷的腫瘤診斷技術(shù)已成為臨床深入研究的課題。一般惡性腫瘤患者晚期會(huì)伴有胸腹水情況，這是因?yàn)閻盒阅[瘤在腹膜、淋巴道等處擴(kuò)散，破壞靜脈、淋巴管道，對(duì)腹膜、胸膜形成刺激[2]，提示可通過(guò)檢驗(yàn)胸腹水中脫落細(xì)胞學(xué)診斷腫瘤性疾病。液基細(xì)胞學(xué)為常用腫瘤診斷方式之一，但無(wú)法判斷腫瘤分型與來(lái)源，準(zhǔn)確率不理想。細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化可有效提高檢出率，通過(guò)細(xì)胞蠟塊延長(zhǎng)保存時(shí)間，能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與穩(wěn)定[3]。本研究選取2020 年5 月—2022 年5 月于張家港市第一人民醫(yī)院就診的62例疑似惡性胸腹水患者為研究對(duì)象，分析細(xì)胞蠟塊、免疫組化聯(lián)合診斷的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇于本院就診的62 例疑似惡性胸腹水患者作為研究對(duì)象，男39 例，女23 例；年齡28～85 歲，平均（47.95±6.03）歲；胸水患者51 例，腹水患者11 例。本研究取得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為疑似惡性胸腹水情況者；②患者有明確病理診斷結(jié)果；③患者同意配合該次診斷研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)檢驗(yàn)方法不耐受者；②溝通障礙者；③排斥該次診斷研究者。

1.3 方法

1.3.1 液基細(xì)胞學(xué)檢查方法對(duì)臨床送檢的新鮮胸、腹水先進(jìn)行離心處理，以2 000 r/min 離心5 min，將試管內(nèi)上清液棄掉，再向內(nèi)部加入相較于沉淀物2～5 倍的緩沖液，以吹打的方式將其混合均勻。吹打處理后使用滴管取2～5 滴沉淀樣本，將其滴于載玻片上，以巴氏染色法處理后實(shí)施液基細(xì)胞學(xué)觀察。

1.3.2 細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化檢查方法對(duì)臨床送檢的新鮮胸、腹水靜置20 min 后，輕輕棄去上清液，混勻后取50 mL 置于尖頭離心管內(nèi)，剩余部分放置于冰箱內(nèi)冷藏保存?zhèn)溆?，? 000 r/min 離心5 min，棄上清液，如沉淀量不夠，可反復(fù)離心收集，如有血性沉淀，可吸取白膜層，加入少量生理鹽水，振蕩均勻，以3 000 r/min 離心5 min，去除血細(xì)胞干擾；將瓊脂液加熱溶解后備用；向沉淀中加入等量的瓊脂液，在瓊脂凝固前快速攪勻，靜置3 min，從離心管底取出瓊脂塊，用包埋紙包裹后放入自動(dòng)脫水機(jī)中與常規(guī)組織一起進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋等過(guò)程，制成的細(xì)胞蠟塊進(jìn)行4 μm 切片及常規(guī)HE 染色，細(xì)胞蠟塊保留備用?？筛鶕?jù)需要切片，選擇不同的抗體，用全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行免疫組化染色。

1.4 觀察指標(biāo)

①胸腹水診斷結(jié)果分析。將活檢病理診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，總結(jié)患者惡性胸腹水占比率及具體疾病。②診斷結(jié)果。記錄兩種診斷方案測(cè)定結(jié)果。③診斷效能。分別計(jì)算兩種診斷方案的靈敏度、特異性與準(zhǔn)確率。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%；特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；準(zhǔn)確率=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，將[n(%)]作為計(jì)數(shù)資料記錄結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)格式，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性胸腹水病理診斷結(jié)果分析

62 例疑似惡性胸腹水患者通過(guò)活檢病理診斷顯示，52 例患者診斷為惡性胸腹水，占比83.87%。其中惡性胸水患者43 例，疾病診斷包括肺腺癌、乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、膽管腺癌；惡性腹水患者9例，疾病診斷包括卵巢癌、胃腸道癌轉(zhuǎn)移。見表1。

表1 惡性胸腹水病理診斷結(jié)果分析[n(%)]

2.2 兩種診斷方案的診斷結(jié)果分析

以活檢病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，液基細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化診斷結(jié)果見表2。

表2 兩種診斷方案的診斷結(jié)果分析

2.3 兩種診斷方案的診斷效能對(duì)比

細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化對(duì)胸腹水診斷的靈敏度、準(zhǔn)確率均高于液基細(xì)胞學(xué)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩種診斷方案的診斷效能對(duì)比（%）

3 討論

液基細(xì)胞學(xué)是臨床檢查工作中較為常用的方式之一，樣本制作后的細(xì)胞分布較為均勻，各結(jié)構(gòu)的清晰度較高，經(jīng)染色后可準(zhǔn)確分辨，被廣泛地應(yīng)用于腫瘤類疾病的篩查工作中[4-5]。但隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷革新，對(duì)腫瘤細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的要求也在相應(yīng)提升，其不僅需要在篩查時(shí)判斷病變的良、惡性質(zhì)，還需進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞樣本的來(lái)源、分型、時(shí)期等具體信息[6-7]。須要注意的是，實(shí)際開展該檢查時(shí)，所獲得的樣本往往為單一細(xì)胞，無(wú)法分析其組織結(jié)構(gòu)等特征，且容易受到采集操作、樣本處理等的影響，導(dǎo)致最終檢查結(jié)果出現(xiàn)偏差[8-9]。另外，部分情況下胸腹水中所包含的異常增生的間皮細(xì)胞在外形上和惡性腫瘤細(xì)胞相似度極高，單純通過(guò)液基細(xì)胞學(xué)檢查難以區(qū)分。而利用胸腹水樣本經(jīng)過(guò)石蠟包埋切片制作的樣本，其細(xì)胞也更接近于真實(shí)的組織結(jié)構(gòu)，并且還可根據(jù)實(shí)際情況開展免疫組化檢查，使得整體實(shí)用性、效用性等均相對(duì)更高[10-11]。

細(xì)胞蠟塊即是采集脫落的細(xì)胞樣本，再經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、包埋等處理后形成細(xì)胞蠟塊，以此作為檢驗(yàn)樣本，供細(xì)胞學(xué)、免疫組化等檢查操作使用。臨床上針對(duì)胸腹腔積液、痰液、灌洗液等樣本處理時(shí)均可使用，可充分固定其中所包含的組織碎塊、細(xì)胞等，以保證多種生理、病理特征被詳細(xì)觀察。且經(jīng)過(guò)石蠟包埋后，可實(shí)現(xiàn)重復(fù)性切片，以滿足后續(xù)多種檢查的需求，從而確保檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性、敏感性[12-13]。臨床較為常用的方式為直接固定法，但該操作會(huì)導(dǎo)致沉淀物中的細(xì)胞間黏度下降，導(dǎo)致組織碎塊被大量分散，且松散細(xì)胞不容易被聚集，再經(jīng)過(guò)后續(xù)脫水處理后便會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的分布更加松散，切片時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重丟失細(xì)胞數(shù)的情況[14]。

為此，現(xiàn)代細(xì)胞蠟塊檢查法經(jīng)過(guò)改良后，先以瓊脂進(jìn)行預(yù)包埋處理，可大幅提升細(xì)胞間粘附的穩(wěn)定性，從而在后期脫水處理前，使細(xì)胞的相對(duì)位置更加固定，分布也更加均勻[15-16]。且瓊脂并不會(huì)影響染色效果，經(jīng)過(guò)HE 處理后的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等染色效果較好，且各結(jié)構(gòu)間對(duì)比度明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見。免疫組化染色背景無(wú)干擾因素，且細(xì)胞的分布較為均勻，可達(dá)到液基細(xì)胞學(xué)的效果，也可避免其檢查技術(shù)的缺陷。將細(xì)胞蠟塊和免疫組化檢查聯(lián)合后，能夠有效增加胸腹水診斷的準(zhǔn)確率，且染色檢查還能夠確定腫瘤細(xì)胞的分型情況。另外，應(yīng)用瓊脂預(yù)包埋時(shí)必須在其未凝固前完成混合操作，以確保細(xì)胞能夠均勻地分布在瓊脂內(nèi)部，并對(duì)具有血性沉淀者給予特殊處理，以降低血細(xì)胞對(duì)檢查的影響[17]。免疫組化診斷中，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）本身是一種腫瘤標(biāo)志物，其具有廣譜特性，在臨床診斷、檢查腫瘤類病變時(shí)擁有較強(qiáng)的特異性，對(duì)于人體內(nèi)是否存在腫瘤病灶能提供可靠的參考數(shù)據(jù)。健康人血液當(dāng)中CEA 的含量通常較低，且使用免疫組化檢驗(yàn)時(shí)的結(jié)果往往為陰性，如最終檢查結(jié)果呈陽(yáng)性，則可懷疑該受檢者體內(nèi)存在腫瘤病灶。Ema 則屬于免疫組化指標(biāo)之一，由于其主要是在上皮細(xì)胞膜中合成，因此也被稱為“上皮膜抗原”?，F(xiàn)代臨床研究證實(shí)部分腫瘤細(xì)胞膜也會(huì)表達(dá)、合成Ema，在患病時(shí)可能呈現(xiàn)數(shù)值增加的情況。CK7 屬于角蛋白中的一種，分子量相對(duì)較低，通?？捎糜趯?duì)單層上皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，包括卵巢、肺實(shí)質(zhì)、乳腺等細(xì)胞異常增殖后均可被大量檢出，可用于評(píng)估相關(guān)腫瘤類病變。細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化技術(shù)極大提高了胸、腹腔積液的診斷率，不同病理類型原發(fā)腫瘤細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果不同，鱗癌主要表達(dá)細(xì)胞角蛋白（CK5/6）和抑癌基因（P40），腺癌主要表達(dá)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（thyroid transcription factor 1, TTF-1）和天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A），小細(xì)胞癌主要表達(dá)細(xì)胞角蛋白（cytokeratin, CK）和嗜鉻粒蛋白A（CgA），惡性間皮瘤及間皮瘤主要表達(dá)鈣結(jié)合蛋白（calretinin）和腎母細(xì)胞瘤（wilms tumor 1, WT-1）。并可依靠免疫組織化學(xué)特異性指標(biāo)明確腫瘤組織來(lái)源，不同組織來(lái)源的腫瘤免疫組化染色結(jié)果也不同，肺腺癌組織主要表達(dá)細(xì)胞角蛋白CK7、NapsinA 和TTF-1，乳腺癌組織主要表達(dá)雌激素受體（estrogen receptor, ER）和孕激素受體（progesterone receptor, PR），胃腸道腺癌組織主要表達(dá)細(xì)胞角蛋白（CK20）、癌胚抗原（CEA）和腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子（caudal-related homeobox transcription factor 2, CDX-2），卵巢癌組織主要表達(dá)糖類抗原125 蛋 白（carbohydrate antigen 125, CA125）、ER 和PR。

通過(guò)研究結(jié)果顯示，細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化診斷惡性胸腹水的準(zhǔn)確率93.55%明顯高于液基細(xì)胞學(xué)（P＜0.05），本研究結(jié)果與張煙等[18]研究所得結(jié)果“細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化檢出準(zhǔn)確率48.24%高于液基細(xì)胞學(xué)31.58%”相一致。

綜上所述，細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化方式診斷胸腹水良惡性具有較高的靈敏度，可有效提高疾病檢出準(zhǔn)確率，為進(jìn)一步制訂治療方案提供支持。