miR-18a靶向WNT2B對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響研究

周娟，楊寶艷，張政梅

子宮肌瘤是常見的發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)的腫瘤，其發(fā)病原因尚不明確，可能與雌激素、孕激素等有關［1］。子宮肌瘤病人可能出現(xiàn)不孕、子宮出血、下腹疼痛等癥狀，研究子宮肌瘤分子發(fā)生機制是子宮肌瘤基因治療的途徑之一［2］。miRNA是生命體內的小分子非編碼RNA，其表達具有保守性、時序性以及組織特異性，miRNA 在不同組織中的表達量不同，這與可能與miRNA 的功能有關［3］。研究顯示，miRNA 在人體不同類型細胞生長、分化、凋亡等生物學特性中發(fā)揮作用，參與能量代謝、血糖維持等生理過程［4］。miRNA 在腫瘤中作用廣泛，已知多種miRNA 在腫瘤中表達改變與腫瘤病人的臨床病理特征有關，這些miRNA 還參與調控腫瘤細胞的生長、凋亡，miRNA 也逐漸成為基因靶向治療的研究熱點［5］。miR-18a 是一個腫瘤進展調控因子，miR-18a 在前列腺癌、結直腸癌等腫瘤中低表達，上調其表達可以抑制腫瘤細胞的生長［6-7］。研究報道顯示，miR-18a 在子宮肌瘤中表達水平下降［8］?，F(xiàn)階段對于miR-18a 在子宮肌瘤細胞增殖和凋亡中作用還不明確。本研究探討miR-18a 對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響和靶向調控機制，為子宮肌瘤治療提供可能分子標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年3 月至2019 年10 月延安市人民醫(yī)院子宮肌瘤病人手術切除的肌瘤組織和正常子宮肌組織（病人在手術切除以前均沒有經(jīng)過藥物治療），納入標準為：經(jīng)過臨床以及相關檢查確診為子宮肌瘤。保存在4 ℃、含有青鏈霉素的PBS 溶液中，標本采集已經(jīng)得到病人和近親屬的知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。miR-18a mimics、mimics control 購自百奧邁科生物技術有限公司；B 細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；Bcl-2相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購自上海澤葉生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司；Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen；WNT 家族成員2B（WNT family member 2B，WNT2B）抗體購自上海博研生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染細胞周期檢測試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；miRVana miRNA Isolation Kit 購自上海索寶生物科技有限公司；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、細胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4（cell cycle number dependent protein kinase4，CDK4）抗體購自上海信裕生物工程有限公司。

1.2 子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織分離培養(yǎng)［9］取子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織，用PBS 反復沖洗，剪碎成＜1 mm3的組織塊，添加800 U/mL 的Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃孵育6 h，中間每1 小時用移液槍吹打1 次。1 000 g 離心10 min，收集的細胞接種到24孔板中，接種密度為5×105個/毫升，添加含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，置于95%空氣、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，濕度為飽和濕度。

1.3 細胞轉染及分組取子宮肌瘤細胞，細胞融合度為70%時進行細胞轉染，采用Lipofectamine 3000轉染試劑將miR-18a mimics、mimics control 轉染到細胞中，轉染步驟同轉染試劑說明。將轉染miR-18a mimics、mimics control 后 的 細 胞 命 名 為miR-18a、miR-NC 組，把沒有轉染的細胞命名為Control組。

1.4 細胞miR-18a 表達水平檢測用qRT-PCR 方法檢測miR-18a 表達，步驟：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細胞，用miRVana miRNA Isolation Kit 提取細胞RNA，用紫外風光光度計檢測濃度和純度。取1 μg 的RNA，添加1 μL 的miScript Reverse Transcriptase Mix、5 μL的5×miScript RT Buffer，加無RNA 酶水至20 μL，按照37 ℃孵育60 min、95 ℃孵育5 min條件合成cDNA。取cDNA，進行qRTPCR，PCR體系為：5 μL的引物、5 μL的miScript Primer Assay、25 μL的Quanti Tect SYBR Green PCR Master mix、2 μL的cDNA，加無RNA酶水至50 μL。PCR 反應條件為：95 ℃、15 min；94 ℃、15 s；55 ℃、30 s；70 ℃、34 s。內參為U6，按照2-ΔΔCt法計算miR-18a 表達變化。miR-18a 引 物：正 向 引 物5’-AAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGA-3’，反向引物5’-GCTTGGCTTGAATTATTGGATG-3’。

1.5 細胞增殖檢測用四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）方法檢測增殖變化，步驟為：取子宮肌瘤細胞按照Control、miR-NC、miR-18a組分組方法將細胞接種到96孔板內，細胞接種密度調整為1×105個/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后，取出培養(yǎng)板，添加20 μL 的MTT 溶液，放在37 ℃孵育4 h，把上清吸掉，加200 μL 的DMSO 溶液，振蕩反應10 min，在酶標儀上檢測490 nm的A值。A值代表增殖能力。

1.6 細胞周期檢測用PI 單染法檢測細胞周期變化，步驟為：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細胞，添加提前預冷的PBS 溶液洗滌2次，加入冰預冷的70%乙醇溶液，小心吹打混合，在4 ℃過夜。2 000 g 離心15 min，將上清棄掉，以PBS溶液重新懸浮細胞沉淀，2 000 g 離心10 min。在細胞中加RNaseA 溶液，在37 ℃孵育30 min，然后加入400 μL的PI染液，在4 ℃避光反應30 min，用流式細胞儀檢測周期變化。

1.7 細胞凋亡檢測用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測凋亡變化，步驟為：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細胞，添加提前預冷的PBS 溶液洗滌2 次，最后將細胞懸浮在400 μL 的結合緩沖液中，添加5 μL 的Annexin V-FICT 溶液，置于室溫避光條件反應15 min，然后再添加10 μL 的PI染色液，避光孵育10 min 后，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.8 細胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2 蛋白表達檢測用Western blotting 方法檢測細胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達，步驟為：取培養(yǎng)48 h以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細胞，將上層培養(yǎng)液棄掉以后，加PBS 洗滌細胞2 次，然后在細胞中添加PMSF∶RIPA 比例為100∶1 的裂解試劑，放在冰上裂解30 min。4 ℃，12 000g 離心10 min，取上清，以BCA 方法測定濃度。SDS-PAGE 凝膠蛋白上樣量按照每孔30 μg 計算，將蛋白樣品與1×Loading Buffer 混合煮沸5 min。把電壓設置為60 V，溴酚藍前端進入分離膠以后，電壓調整到120 V，觀察溴酚藍遷移到凝膠的底部以后，取出凝膠。將凝膠浸泡在轉膜緩沖液中10 min，PVDF 膜放在甲醇中平衡5 min，以200 mA 的恒流轉膜1 h。電轉結束后取出PVDF 膜，用TBST 洗滌3 次后，放在封閉液中，室溫封閉2 h；取出PVDF 膜，TBST 洗滌3 次，再置于一抗溶液中，在4 ℃過夜反應；PVDF 膜再放在二抗孵育液中，室溫結合2 h。ECL 顯色。目的蛋白水平=目的條帶灰度值÷內參GAPDH灰度值。

1.9 miR-18a與WNT2B 靶向關系預測和鑒定靶基因預測軟件targetscan 預測miR-18a 與WNT2B 可能互為靶向關系。分別將含有WNT2B 的3，UTR 端結合位點（wt-WNT2）和突變后、不含WNT2B 的3，UTR 端結合位點（mut-WNT2）的熒光素酶報告載體與miR-18a mimics、mimics control 共轉染到子宮肌瘤細胞中，48 h 后用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。熒光素酶報告載體由武漢金開瑞生物工程有限公司構建合成。收集培養(yǎng)48 h以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細胞，用Western blotting檢測WNT2B蛋白表達，步驟同“1.8”。

1.10 上調WNT2B 對miR-18a 調控作用影響檢測分別將miR-18a mimics、pcDNA3.1 和miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B 共轉染到子宮肌瘤細胞中，記為miR-18a+NC、miR-18a+WNT2B 組，利用上述方法測定細胞增殖（MTT）、周期（PI 單染）、凋亡（Annexin V-FITC/PI 雙染法）和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B 蛋 白 表 達（Western blotting）。pcDNA3.1-WNT2B由和元生物技術（上海）股份有限公司構建。

1.11 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 軟件分析，滿足正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組差異比較用單因素方差，兩兩比較用turkey test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-18a mimics 上調子宮肌瘤細胞中miR-18a 表達子宮肌瘤細胞中miR-18a 表達水平（0.52±0.06）低于正常子宮肌細胞（1.00±0.10）（t=7.13，P＜0.05）。與miR-NC 組（0.97±0.13）比較，轉染miR-18a mimics 后子宮肌瘤細胞中miR-18a 表達水平（3.21±0.25）升高，Control 組（1.00±0.12）與miRNC 組的miR-18a 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（F=158.36，P＜0.05）。miR-18a mimics 上調子宮肌瘤細胞中miR-18a表達水平。

2.2 miR-18a 抑制子宮肌瘤細胞增殖、阻滯細胞周期并誘導凋亡轉染miR-18a mimics 后子宮肌瘤細胞增殖能力降低，G1 期細胞比例升高，細胞凋亡率升高，細胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2 蛋白表達水平下降，Bax 蛋白表達水平升高。miR-18a 抑制子宮肌瘤細胞增殖、阻滯細胞周期并誘導凋亡。見圖1、表1。

表1 miR-18a mimics轉染后的子宮肌瘤細胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達/

表1 miR-18a mimics轉染后的子宮肌瘤細胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達/

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，CDK4為細胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4，Bax為Bcl-2相關X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因。①與miR-NC組比較，P＜0.05。

圖1 miR-18a mimics轉染后的子宮肌瘤細胞凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達變化：A為流式細胞術檢測子宮肌瘤細胞凋亡；B為蛋白質印跡法檢測子宮肌瘤細胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達

2.3 miR-18a 和WNT2B互為靶向關系miR-18a 與WNT2B 的3，UTR 端有互補結合位點，并且wt-WNT2B 熒光素酶報告載體和miR-18a mimics 共轉染后的子宮肌瘤細胞熒光素酶活性下降。miR-18a和WNT2B互為靶向關系。見圖2、表2。

表2 細胞熒光素酶活性變化/

表2 細胞熒光素酶活性變化/

注：mut為mut-WNT2B 熒光素酶報告載體，wt為wt-WNT2B 熒光素酶報告載體

圖2 miR-18a靶基因預測結果

2.4 miR-18a 抑制子宮肌瘤細胞中WNT2B 表達與miR-NC 組（0.43±0.06）比較，轉染miR-18a mimics后子宮肌瘤細胞中WNT2B 蛋白表達水平（0.22±0.03）下降，Control 組（0.42±0.04）與miR-NC 組的WNT2B 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（F=20.71，P＜0.05）。miR-18a 抑制子宮肌瘤細胞WNT2B 蛋白表達。見圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測miR-18a mimics轉染后的子宮肌瘤細胞中WNT2B蛋白表達

2.5 上調WNT2B 逆轉miR-18a 對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡作用與共轉染miR-18a mimics、pcDNA3.1 相比，共轉染miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B 后的子宮肌瘤細胞增殖能力增加，G1 期細胞比例降低，細胞凋亡率下降，細胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2、WNT2B 蛋白表達水平升高，Bax 蛋白表達水平降低。上調WNT2B 逆轉miR-18a 對子宮肌瘤細胞增殖、周期和凋亡作用。見圖4、表3。

表3 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉染后的子宮肌瘤細胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達水平/

表3 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉染后的子宮肌瘤細胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達水平/

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，CDK4為細胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4，Bax為Bcl-2相關X 蛋白，Bcl-2為B 細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，WNT2B為WNT家族成員2B。①與miR-18a+NC組比較，P＜0.05。

圖4 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉染后子宮肌瘤細胞凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達：A為流式細胞術檢測細胞凋亡；B為蛋白質印跡法檢測cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達

3 討論

miRNA 在真核生物體內廣泛存在，是一類單鏈RNA，其被認為是基因調控領域中的巨大突破。miRNA 是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，其在不同的物種之間具有高度保守性，人體內有約30%的基因受到miRNA的調控作用［10］。研究證實，免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均受到miRNA的影響，miRNA通過影響細胞生長、凋亡等細胞生理過程而發(fā)揮重要作用［11］。子宮肌瘤進展與miRNA 表達有關，miRNA 調控子宮肌瘤細胞的生長和凋亡［12］。miR-18a 作為一個多功能調控因子，其不僅參與子癇前期、心梗等疾病發(fā)生，還與腫瘤進展有關［13-14］。miR-18a 在前列腺癌、結直腸癌等腫瘤中表達下調，上調miR-18a 降低腫瘤細胞增殖能力［6-7］。既往研究已經(jīng)證實，miR-18a在子宮肌瘤組織中表達下調［8］。本研究顯示，上調miR-18a 后的子宮肌瘤細胞增殖能力降低，這與上述研究結果一致，提示miR-18a 在子宮肌瘤中可能發(fā)揮抑制作用。

細胞增殖、周期以及細胞凋亡是細胞重要的生物學特性，細胞周期有序進展是細胞增殖的基礎，細胞增殖和凋亡平衡是機體內環(huán)境維持的重要途徑［15］。細胞周期分成分裂間期和分裂期，分裂間期是分裂期的準備階段，也是細胞周期的關鍵。研究顯示，細胞分裂間期有兩個關鍵的轉換點，其中G1期向S 期進展是關鍵轉換點之一，這一過程受到細胞內多種調控因子的復雜作用［16］。cyclin D1、CDK4是細胞從G1期向S期進展的促進因子，二者在G1期表達上調，cyclin D1、CDK4 也是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤促進因子［17］。細胞凋亡是細胞受到外界刺激以后引起的多基因調控的結果，Bcl-2是與細胞凋亡有關的蛋白家族［18］。Bcl-2蛋白家族含有多個成員，根據(jù)其在細胞凋亡過程中的作用可以分成促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白［19］。Bax、Bcl-2 分別為Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白［20］。本研究表明，miR-18a具有將細胞周期阻滯在G1期和誘導細胞凋亡的作用，miR-18a還可以減少細胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2蛋白并促進Bax蛋白表達，這充分證實miR-18a有阻滯子宮肌瘤細胞周期并誘導細胞凋亡作用。

miRNA 通過堿基互補的方式與靶基因的mRNA 的3’UTR 端結合，從而影響靶基因的翻譯。miRNA 與靶基因是以不完全匹配的方式結合，因此miRNA 通過作用多個靶基因發(fā)揮作用［21］。本研究表明，miR-18a 可以靶向抑制子宮肌瘤細胞中WNT2B 表達。WNT2B 是WNT 信號通路的組成部分，其在腫瘤中表達上調，下調其表達具有抗腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡的作用［22-23］。本研究顯示，WNT2B 能夠逆轉miR-18a 對子宮肌瘤細胞增殖抑制、周期阻滯和細胞凋亡作用，說明miR-18a 作用機制與靶向調控WNT2B 有關。目前對miR-18a 調控WNT2B 的下游機制還不明確，在以后實驗中會進行詳細探討。

以上表明，miR-18a 靶向抑制子宮肌瘤細胞中WNT2B表達發(fā)揮增殖抑制、周期阻滯和凋亡促進作用，miR-18a 可能是子宮肌瘤進展中的抑制因子，靶向miR-18a可能是子宮肌瘤治療的途徑之一。