五味子降酶膠囊質(zhì)量控制研究

任路路，姚大洋，任瑩，李小偉

慢性肝炎在我國發(fā)病率高并呈上升趨勢，其活動期往往伴隨ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、TBiL（總膽紅素）等指標(biāo)的升高。中醫(yī)認(rèn)為，慢性肝病的病因往往是正氣不足、飲食不節(jié)，以致?lián)p傷脾胃，脾胃不能化濕，則濕熱內(nèi)生，因脾傷肝，造成肝膽脾胃不和，從而加劇了正氣的損傷，導(dǎo)致肝炎的發(fā)生；另外，正氣不足，極易感染疫毒。古人云：邪之所干，其氣必虛。說明本證是本虛標(biāo)實證。我院肝病科老中醫(yī)經(jīng)過多年臨床摸索，認(rèn)為慢性肝病病人正氣虛為本，外感或內(nèi)生濕熱為標(biāo)，治療上要攻補兼施。五味子降酶膠囊正是在此基礎(chǔ)上研制而出，其由五味子、女貞子、板藍根、敗醬草四味藥組成，具有補益肝腎、清熱解毒、涼血止痛的功效；用于肝膽濕熱型脅痛、積聚證，癥見乏力、納差、腹脹、脅肋部疼痛等。方中五味子性溫，味酸、甘，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效，現(xiàn)代藥理研究表明五味子具有保肝降酶的作用，是多種保肝藥的主要成分，為君藥［1-2］；女貞子味甘苦性涼，具有補益肝腎、清虛熱、明目的功效，與五味子合用，增強其補益肝腎的作用，為臣藥；板藍根味苦性寒，具有清熱解毒、涼血的功效；敗醬草味辛、苦，具有清熱解毒、消腫排膿、活血止痛的功效，與板藍根輔助起到清肝膽祛濕熱的作用，故二藥為佐藥。四藥合用，攻補兼施，攻邪不傷正，扶正不留邪。五味子降酶膠囊在我院臨床運用多年，效果顯著。為了更好地控制制劑質(zhì)量，保證臨床療效，特對處方中各藥味進行研究，以建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)把制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器U-3000 型高效液相色譜儀（賽默飛）；FA2004型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ZF-2 型三用紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；DHG-9055A 型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥五味子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號120922-201309）；五味子醇甲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110857-201513）；精氨酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號140685-201707）；五味子降酶膠囊（太和縣中醫(yī)院，批號20190621、20190623、20190625）；五味子（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號1902220328），女貞子（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號1901120124），板藍根（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號1904250252），敗醬草（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號1903210211），以上飲片經(jīng)我院副主任中藥師王虎鑒定均為正品；甲醇（SccBayer，色譜純）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 五味子的薄層鑒別［3］取五味子降酶膠囊的內(nèi)容物1 g，加三氯甲烷20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL三氯甲烷使溶解，作為供試品溶液；另取按處方比例及生產(chǎn)工藝制成的不含五味子的五味子降酶膠囊，按上述方法制成陰性對照溶液；再取五味子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；再另取五味子醇甲對照品，加甲醇溶解，制成每1毫升含五味子醇甲1 mg的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述四種溶液各5 μL，點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，上行展開，距薄層板上沿1 cm 時取出，晾干，置三用紫外儀（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)Rf 位置處，顯相同顏色的斑點；而陰性樣品在此位置處無斑點。說明該方法專屬性強，可作為該制劑中五味子的鑒別方法。

2.2 板藍根的薄層鑒別［4］取五味子降酶膠囊的內(nèi)容物1.75 g，加水60 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液上鈉型732 型陽離子交換樹脂（柱長10 cm，內(nèi)徑1.5 cm），水洗至洗液呈中性，再用2 mol/L 的氨水溶液150 mL 洗脫，棄去前50 mL 洗脫液，收集后100 mL洗脫液，蒸干，殘渣加稀乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取按處方比例及生產(chǎn)工藝制成的不含板藍根的五味子降酶膠囊，按上述方法制成陰性對照溶液；再取板藍根對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；再另取精氨酸對照品，加甲醇溶解，制成每1 毫升含精氨酸0.5 mg 的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，分別吸取上述四種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以無水乙醇-氨水（3∶2）為展開劑，上行展開，距薄層板上沿1 cm 時取出，晾干。噴以茚三酮試液，置105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中加熱到斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)Rf位置處，顯相同顏色的斑點；而陰性樣品在此位置處無斑點。說明該方法專屬性強，可作為該制劑中板藍根的鑒別方法。

3 含量測定（中國藥典2015年版四部通則0512試驗）

3.1 波長的選擇用甲醇為空白試劑，在200～400 nm 范圍內(nèi)對五味子醇甲進行波長掃描。結(jié)果顯示，五味子醇甲在216 nm、251 nm 附近有最大吸收。同時參考藥典及文獻中“五味子醇甲”的含量測定方法，確定本品的測定波長為250 nm。

3.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗［5-9］色譜柱用ODS 柱（依利特，Hypersil ODS2 5 μm 4.6×250 mm）；流動相為甲醇-水（65∶35）；流速為1 mL/min；柱溫設(shè)30 ℃；檢測波長為250 nm。理論板數(shù)以五味子醇甲峰計算應(yīng)不低于2 000。進樣量為5 μL。

3.3 溶液的制備

3.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲對照品適量，加甲醇制成每1 毫升含30 μg 的溶液，即得。

3.3.2 供試品溶液的制備［10-12］精密稱取混勻的裝量差異項下的本品內(nèi)容物0.75 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率20 kHz）20 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密移取5 mL 續(xù)濾液至10 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.4 專屬性試驗取缺五味子的五味子降酶膠囊，按“3.3.2”方法制成陰性樣品溶液。精密吸取對照品、供試品及陰性樣品三種溶液各5 μL，按“3.2”條件進樣，記錄色譜圖。見圖1。

結(jié)果可見，供試品的色譜圖中，在與五味子醇甲峰相同保留時間處顯相同的色譜峰；而陰性樣品在此時間處無色譜峰。陰性無干擾，方法專屬性強。

3.5 線性關(guān)系考察［13-15］精密稱取五味子醇甲對照品適量，加甲醇溶解，制成濃度為0.333 7 g/L的對照品溶液作為儲備液。精密移取1 mL儲備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.033 37 g/L 溶液作為工作液。按“3.2”條件，分別精密吸取工作液1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL 進樣，記錄峰面積。以五味子醇甲的進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程y=35.486x+0.174 6，r=0.999 5。由此說明，五味子醇甲在0.033 37～0.533 92 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

3.6 精密度考察精密吸取“3.5”中的工作液5 μL，在“3.2”條件下連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果五味子醇甲的平均峰面積6.127 0，相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）=0.16%，說明儀器具有較好的精密度。

3.7 重復(fù)性試驗精密稱取五味子降酶膠囊（批號20190621）內(nèi)容物0.75 g，共6份，分別制成供試品溶液，在“3.2”條件下進樣并計算含量。結(jié)果6 份樣品的平均含量為2.40 mg/g，RSD=0.32%，說明該方法重復(fù)性較好。

3.8 樣品穩(wěn)定性試驗精密稱取五味子降酶膠囊（批號20190621）內(nèi)容物0.75 g 制成供試品溶液，分別于制成后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，測定峰面積。結(jié)果平均峰面積6.719 8、RSD=0.44%。由此可知，樣品室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 加樣回收試驗［16］精密稱取已知含量的五味子降酶膠囊6 份（每份約0.40 g），精密加入“3.5”項下的儲備液2.5 mL，按上述方法及色譜條件進行測定，計算回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，樣品平均回收率為100.07%，RSD=0.57%。說明該方法準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率測定結(jié)果

3.10 樣品含量測定取連續(xù)3 批的五味子降酶膠囊，按所述的樣品處理方法及色譜條件進樣測定，計算五味子醇甲的含量，批號20190621、20190623、20190625 的制劑含量每粒分別為0.84 mg、0.85 mg、0.85 mg。

4 討論

4.1 含量測定指標(biāo)成分及薄層鑒別方法的確定五味子主要含五味子醇甲、五味子乙素等成分，根據(jù)《中國藥典》2015 年版、《中藥制劑質(zhì)量及穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》首選君藥、貴重藥、毒性藥材制訂含量測定項目的要求，故選擇君藥五味子中五味子醇甲作為HPLC 測定的指標(biāo)成分；同時用五味子醇甲及五味子對照藥材進行TLC 鑒別，結(jié)果斑點清晰、專屬性強，能清楚地反映五味子的薄層特征。板藍根化學(xué)成分復(fù)雜，主要含（R，S）-告依春、靛藍、精氨酸等化學(xué)成分。本研究曾用化學(xué)鑒別法鑒別板藍根中的氨基酸，陰性雖無干擾，但化學(xué)鑒別方法簡單，特異性差，不足以作為板藍根的鑒別方法；用TLC 法鑒別板藍根中的（R，S）-告依春，陰性亦有干擾，專屬性不強［17］；靛藍的含量較低，TLC 鑒別斑點不清晰，不易檢出；而精氨酸經(jīng)過鈉型732型陽離子交換樹脂處理，再用氨水溶液洗脫提純后，分離效果好，專屬性強，斑點顯色清晰，故可作為本制劑中板藍根的鑒別方法。敗醬草收載于地方炮制規(guī)范中，主要含齊墩果酸、敗醬烯等化學(xué)成分，本研究曾用TLC 法鑒別處方中的敗醬草［18］，但陰性干擾明顯，專屬性不強。女貞子亦含有齊墩果酸，與敗醬草相互干擾，同時含有女貞苷、特女貞苷等化學(xué)成分，由于工藝及處方量的影響，用TLC 法鑒別女貞子中特女貞苷，斑點不清晰、分離效果差且陰性有微弱的干擾［19］。根據(jù)《中藥制劑質(zhì)量及穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》鑒別項的要求“對主要藥味進行研究，選擇專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便的鑒別方法納入標(biāo)準(zhǔn)正文”，故將五味子、板藍根的薄層鑒別方法收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，女貞子、敗醬草的薄層鑒別尚需進一步研究。

4.2 含量測定提取方法及溶劑的選擇藥典及文獻［20-21］中五味子醇甲的提取有超聲法及加熱回流法兩種。本研究曾考察了兩種提取方法五味子醇甲的含量高低，發(fā)現(xiàn)超聲提取含量略高但不明顯。綜合考慮操作的簡易程度及能源消耗，故本試驗選擇超聲法作為HPLC 的提取方法。溶劑選擇方面，本研究比較了分別用甲醇、乙醇、50%甲醇超聲后五味子醇甲的含量高低，發(fā)現(xiàn)三種溶劑處理的色譜峰分離度及不對稱性均較好，色譜圖差別不明顯；而甲醇處理五味子醇甲的含量最高，故選擇甲醇作為五味子醇甲的提取溶劑。

4.3 含量限度的確定受工藝及生產(chǎn)實際的影響，制劑含量往往較投料的理論含量下降明顯。而制成制劑后，飲片指標(biāo)成分含量進入制劑的比率稱為轉(zhuǎn)移率。本制劑五味子粉碎入藥，有效成分損耗較少。研究測定了五味子降酶膠囊及投料的五味子的含量，計算平均轉(zhuǎn)移率為75.59%。由處方計算，本制劑每粒含五味子飲片0.14 g，根據(jù)《中國藥典》2015 年版“五味子”的含量限度，并結(jié)合轉(zhuǎn)移率及工業(yè)化生產(chǎn)實際，暫定本制劑的含量限度為不低于每粒0.40 mg。由于含量測定批次有限，故轉(zhuǎn)移率及制劑含量限度尚需進一步考察。

5 結(jié)論

采用TLC 法鑒別處方中的五味子及板藍根的方法專屬性強、斑點清晰，HPLC 法測定五味子中五味子醇甲的含量方法分離度高、重現(xiàn)效果好，可作為五味子降酶膠囊的薄層鑒別及含量測定方法收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。