五種中藥體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用研究

程漢　吳秋萍　解慧梅

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的傳染病，本項(xiàng)目研究選取了黃芪等5種中藥，具有免疫力強(qiáng)，解毒清熱等功效，研究這些中藥在體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用，篩選出能有效抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥組合配方，為治療豬繁殖與呼吸綜合征提供臨床治療幫助。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征;中藥組方;抗病毒;細(xì)胞免疫

豬繁殖與呼吸綜合征臨床上主要以妊娠母豬的早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎和木乃伊胎以及生長豬呼吸道疾病為特征。郭寶清[1] 等于1996年在我國發(fā)現(xiàn)該病并分離到病原，此后，豬繁殖與呼吸綜合征給養(yǎng)豬業(yè)造成的威脅的很大，同時有較大經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前，該病主要靠預(yù)防，還沒有防治的有效藥物和相關(guān)防治辦法。近幾年，中藥受到市場追捧，運(yùn)用比較普遍，在調(diào)整機(jī)體陰陽平衡，增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力，扶正培本等方面具有很好的效果，實(shí)驗(yàn)研究證明，許多單味中藥和復(fù)方藥物應(yīng)用臨床，具有抑制病毒感染復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫等功效，同時，中藥具有副作用少，藥物低殘留，藥源豐富等優(yōu)勢[2-6] 。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

Marc-145細(xì)胞，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制品重點(diǎn)研究室提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代。病毒由江蘇農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)院鑒定分離。

1.2 主要材料

胰酶細(xì)胞消化液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購自上海生工生物工程有限公司。將MTT以無鈣離子、鎂離子的PBS液配制成5mg/ml，除菌，過濾分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥水提取物的制備

將市場采購的黃柏、黃芩、梔子、黃芪和黃連等5種藥物，每種藥物稱4g，用水浸泡1h，小火煎2次，每次煮30min，兩次合并，再低速離心，濃縮，定容至20ml。提取后的中藥水相當(dāng)于生藥0.2g/ml。用碳酸氫鈉溶液調(diào)整pH值到7，再經(jīng)高壓蒸汽滅菌，滅菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物對細(xì)胞安全濃度測定

在九十六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞長成單層，棄去培養(yǎng)液原液，用PBS洗滌1次。用細(xì)胞培養(yǎng)液對各中藥原液分別進(jìn)行2倍倍比稀釋至1×2，第1～12孔分別加入100μl，細(xì)胞對照孔為第11、12孔，每個稀釋度重復(fù)4孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h，每天定時觀察生長情況。72h后倒去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌，加入MTT液20μl/孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后倒去MTT液，加入二甲基亞砜，150μl/孔，振蕩10min，等晶體全部溶解，測定OD490nm數(shù)值，計(jì)算出不同濃度藥物的生長抑制率。

1.5 半數(shù)病毒組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測定

參照文獻(xiàn)[7-8]，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒按十倍倍比稀釋，在長滿細(xì)胞的九十六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，按100μl/孔的量加入，，最后兩列為細(xì)胞對照組，各稀釋度重復(fù)八孔，于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h，病毒液除去，各孔加100μlDMEM維持液，再進(jìn)一步培養(yǎng)。觀察病變細(xì)胞（CPE）的情況，等72～96h后，用MTT測定法測定各孔OD490nm值，計(jì)算出豬繁殖與呼吸綜合征病毒對細(xì)胞的生長抑制率。

1.6 中藥體外抗PRRSV效果的測定

參照冼瓊珍等[2，7，9]方法，以中藥的起始濃度為最大安全濃度，共四個稀釋度，用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行兩倍稀釋中藥，每個稀釋度重復(fù)8孔，豬繁殖與呼吸綜合征病毒液的使用稀釋度是100TCID50，設(shè)立設(shè)細(xì)胞病毒對照組和對照組。在37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意及時查看CPE的情況，培養(yǎng)72h以后，通過MTT法檢測得出各孔OD490nm數(shù)值，通過計(jì)算得出各中藥對感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒的Marc-145細(xì)胞的保護(hù)率。用MTT法檢測中藥配方組合物的OD490nm數(shù)值高，中藥的細(xì)胞保護(hù)率就高，說明它的抑制病毒的吸附能力就越強(qiáng)。

（1）藥物的切斷作用方法是首先加中草藥，其次加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒，再將中藥液加入細(xì)胞培養(yǎng)板上，該中藥液為安全濃度起始濃度，100μl/孔，37℃培養(yǎng)4h，然后除去中藥液，再加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒液，100μl/孔，于37℃培養(yǎng)2h后除去病毒液，各孔中加入10微升DMEM液。

（2）藥物的抑制作用方法是先加豬繁殖與呼吸綜合征病毒，再加中草藥，在Marc-145細(xì)胞上長到單層的九十六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒液，100μl/孔，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)2h后，除去病毒液體，而后加入中藥液，此時的中藥液濃度為安全濃度，100μl/孔，于37℃下培養(yǎng)，4h后，再除去藥液，各孔中加入100μlDMEM維持液。

（3）藥物的殺滅作用方法是中藥與豬繁殖與呼吸綜合征病毒一并加入，制備以藥物安全濃度為起始濃度，不同濃度中藥培養(yǎng)液倍比稀釋，在九十六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入Marc-145細(xì)胞，100μl/孔，37℃培養(yǎng)，4h后除去藥液，各孔加DMEM維持液100μl。

（4）藥物評價及數(shù)據(jù)處理用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，用各中藥對細(xì)胞保護(hù)率來評價效果，如果細(xì)胞保護(hù)率大就說明藥物抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用就強(qiáng)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 藥物對細(xì)胞的安全濃度

藥物對Marc-145細(xì)胞的毒副作用：導(dǎo)致細(xì)胞變圓、折光性增加，細(xì)胞間黏連和細(xì)胞損傷及脫落現(xiàn)象。如果中藥液的濃度高，就證明豬繁殖與呼吸綜合征病毒對細(xì)胞毒性作用就強(qiáng);如果活的細(xì)胞較少，通過MTT法測量，得到的OD值也不高，通常情況下，藥物濃度越高，副作用就越大，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果跟這個規(guī)律是符合的。不同濃度下的中藥對細(xì)胞的生長抑制率，是通過公式以及OD490nm值計(jì)算得出的，同時結(jié)合CPE的情況，根據(jù)以上幾種因素，來綜合判斷中藥毒性的強(qiáng)弱。結(jié)果說明黃芪的安全濃度最高

（50mg/ml），其他4種中藥的最大安全濃度在1.56～3.13mg/ml范圍內(nèi)（如表1所示）。

注：黃連、黃芩起始濃度為50mg/ml，其他藥物的起始濃度為100mg/ml。

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒TCID50的測定

依據(jù)Reed-Muench法計(jì)算豬繁殖與呼吸綜合征病毒的TCID50的結(jié)果是1×10-5.393/0.1ml，如果病毒液稀釋到1×10-5.393的時候，結(jié)果半數(shù)的細(xì)胞感染?？梢钥吹接貌煌兴幰旱南♂尯?，豬繁殖與呼吸綜合征病毒對細(xì)胞的生長抑制率產(chǎn)生了不同程度的影響，如圖表2。

2.3 中藥抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的效果

（1）中藥的阻斷作用如表3顯示，黃芪對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的阻斷效果最強(qiáng)，黃芪在50～6.25mg/ml濃度下均能100%保護(hù)細(xì)胞。黃連和黃柏次之，黃連在0.2～1.56mg/ml濃度、黃柏在1.56～3.13mg/ml濃度均能保護(hù)50%以上的細(xì)胞。黃芩和梔子也有一定的阻斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒吸附的作用。

（2）中藥的抑制作用，由表3可知，5種中藥對PRRSV增殖都有一定程度上的抑制作用，黃芪、黃連和梔子的作用最為顯著，黃芩其次，中藥黃柏的抑制效果最差。

（3）中藥的直接殺滅作用，如表3可知，黃芩和黃芪對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的殺滅作用非常明顯，梔子其次，而黃柏和黃連對PRRSV的直接殺滅作用較低。

從上述可知，五種中藥中體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒黃芪效果顯著，其他4種中藥則在對病毒的阻斷、抑制或殺滅作用上均有不同程度的效果。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示黃芪在5種中藥中對Marc-145細(xì)胞的生長抑制率最低，安全用藥的濃度最高，而且在阻斷病毒的吸附、抑制病毒的復(fù)制和直接殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒方面都表現(xiàn)較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所選的黃芪等五種中藥做了同樣的實(shí)驗(yàn)，對細(xì)胞的毒性程度不同，藥物種類不一樣，毒性的強(qiáng)弱不一樣。在該研究中，當(dāng)每一種中藥液如果稀釋至某一個倍數(shù)后，幾乎不會出現(xiàn)細(xì)胞的病理變化。如果所測的藥物組OD值相等，或者是測得值大于對照組，這就證明該濃度的中藥能引起細(xì)胞的生長，同時也證明對細(xì)胞是沒有毒性的，本實(shí)驗(yàn)各中藥測定結(jié)果與胡元亮[8]等人的研究相符。這些中藥之所以對細(xì)胞有作用，是因?yàn)檫@些藥物中含有很多的活性物質(zhì)，如多糖類、生物堿類及揮發(fā)油類物質(zhì)等。而藥物中的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、生長因子，與細(xì)胞生長和機(jī)體免疫力的提高，是密切聯(lián)系的。藥理學(xué)研究結(jié)果表明，中草藥對畜禽病毒性疾病的作用主要體現(xiàn)在直接作用（抗病毒）和間接作用（調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能）2個方面[9]。直接作用體現(xiàn)在一些中藥通過阻斷病毒增殖過程的吸附、穿入、復(fù)制、成熟中的某個環(huán)節(jié)，從而達(dá)到抗病毒的目的[10]。

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